Identificación del nuevo patógeno potencial Trueperella pecoris con importancia entre especies mediante diagnóstico LAMP
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Identificación del nuevo patógeno potencial Trueperella pecoris con importancia entre especies mediante diagnóstico LAMP

Aug 01, 2023

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 14005 (2023) Citar este artículo

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Trueperella pecoris se describió como una nueva especie del género Trueperella en 2021 y podría ser patógena para varias especies animales. Sin embargo, la falta de un sistema de pruebas de diagnóstico adecuado obstaculiza la realización de estudios epidemiológicos para aclarar posibles víctimas. En este estudio, se desarrolló y validó un ensayo de amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) que era altamente específico para T. pecoris. El ensayo proporcionó una sensibilidad analítica de 0,5 pg/25 µL y mostró una inclusión y exclusividad del 100 % para 11 cepas objetivo y 33 no objetivo, respectivamente. Se evaluaron tres métodos diferentes de extracción de ADN para seleccionar el método más compatible con LAMP para la alteración celular en muestras puras y complejas. Utilizando una extracción de ADN con tampón único aplicable in situ con calentamiento adicional, el límite de detección basado en células fue de 2,3 UFC/reacción. Finalmente, el ensayo LAMP se validó mediante muestras de tejido pulmonar porcino contaminadas artificialmente en las que se detectaron cargas microbianas mínimas entre 6,54 y 8,37 × 103 UFC por muestra de hisopo. El ensayo LAMP establecido en este estudio representa un procedimiento de diagnóstico adecuado para identificar T. pecoris en muestras clínicas y ayudará a recopilar datos epidemiológicos sobre la patogenicidad de esta especie.

En 2021, Schönecker et al.1 introdujeron Trueperella (T.) pecoris como una nueva especie del género Trueperella. Se aislaron cepas de especímenes de ganado lechero que padecían mastitis o aborto y de un cerdo muerto que presentaba pleuresía fibrinosa y bronconeumonía supurativa durante la necropsia. Además de esta bacteria, también se aislaron otros patógenos potenciales, de modo que no se pudo demostrar un vínculo etiológico, pero tampoco se pudo excluir. Con base en las encuestas anamnésicas y los resultados de los exámenes culturales, los autores sospecharon al menos una probable participación de T. pecoris en la patogénesis de los casos de mastitis descritos en ese estudio1. Sin embargo, otras especies del género Trueperella, como T. abortisuis y T. pyogenes, también se han asociado con manifestaciones patológicas en cerdos, incluido el aborto o la inflamación multiorgánica2,3. Recientemente, se aisló otra cepa de T. pecoris de la vestibulitis necrótica de un camello4.

Aparte de los orígenes descritos anteriormente de los aislados bacterianos y sus características fenotípicas y genotípicas, no hay información disponible sobre esta nueva especie de Trueperella. Su distribución y significado patogénico siguen sin estar claros, especialmente en la medida en que sea posible, faltan métodos de detección específicos y fiables. El examen cultural seguido de diferenciación bioquímica y secuenciación del gen 16S rRNA como lo describen Schönecker et al.1 puede ofrecer ya posibilidades para identificar T. pecoris, pero requiere mucho trabajo y mucho tiempo. Para estudiar eficazmente la epidemiología de este patógeno potencial, se necesitan métodos de diagnóstico rápidos adecuados para examinar un gran número de muestras heterogéneas.

Como se dispone de información detallada sobre la secuencia de varias cepas de T. pecoris1, se debe considerar el desarrollo de métodos de detección molecular, por ejemplo basados ​​en la amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP). Esta técnica se introdujo en 20005 y desde entonces ha ganado mucha atención en la comunidad científica. En comparación con métodos alternativos como la PCR, LAMP permite una amplificación rápida y continua a una temperatura constante, eliminando la necesidad de un dispositivo de termociclado costoso y no portátil6. Además, se demostró que el método es muy específico y sensible en la detección de objetivos genómicos y, al mismo tiempo, resistente a los componentes inhibidores en diversas muestras7, 8. Las reacciones se pueden llevar a cabo a bajo costo, por ejemplo, utilizando un bloque calefactor9. Para la detección posterior de productos LAMP, se encuentran disponibles varios métodos, que a menudo se basan en un cambio de color visible o en una turbidez generada10. Además de las opciones de bajo costo para realizar este método, que pueden ser de gran beneficio en entornos de laboratorio limitados, también hay fluorómetros o turbidímetros portátiles en tiempo real disponibles en el mercado11,12. Estos ofrecen características adicionales como monitoreo en tiempo real de la reacción LAMP o generación de curva de fusión para evaluar la especificidad de un producto LAMP.

Las características ventajosas del método LAMP han llevado al desarrollo de varios ensayos destinados a ser herramientas de diagnóstico en el lugar de atención para una amplia gama de patógenos13. Para la detección de microorganismos, LAMP es de aplicación casi universal siempre que esté disponible una región genómica diana específica. Por lo tanto, el presente estudio tuvo como objetivo desarrollar y validar un ensayo LAMP fácil de realizar para detectar T. pecoris en muestras clínicas. En primer lugar, debería proporcionar una herramienta de diagnóstico para futuras investigaciones sobre los aspectos epidemiológicos y la importancia patogénica de esta nueva especie. Además, el ensayo debe cumplir los requisitos para un posible uso posterior en el diagnóstico de pacientes.

Se determinó una región diana genómica específica y conservada dentro de la cepa T. pecoris 19OD0592 (Nº de acceso NZ_CP063212.1) de 31.777 a 31.996 pb utilizando el algoritmo BLAST del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) (https://blast. ncbi.nlm.nih.gov). Las secuencias y posiciones de los cebadores se muestran en la Fig. 1. Para configurar el ensayo LAMP de Trueperella pecoris (TP), se optimizaron las concentraciones de los cebadores y la temperatura de reacción. El conjunto de cebadores TP concentrados dio como resultado una amplificación más eficaz y proporcionó una ventaja de aproximadamente 5 minutos en el tiempo de detección en comparación con el conjunto de cebadores TP estándar (datos no mostrados). Utilizando el conjunto de cebadores concentrados, los tiempos de detección más cortos se midieron a 65 °C (Fig. 2). Por lo tanto, se seleccionaron el conjunto de cebadores concentrados y la temperatura de reacción de 65 °C como parámetros de ejecución finales. El control positivo tuvo un tiempo medio de detección de 9,26 ± 0,03 min con una temperatura de fusión del producto LAMP de 90,7 ± 0,06 °C. En los siguientes experimentos, las temperaturas de fusión del producto LAMP de 90,7 ± 1,0 °C se clasificaron como específicas para diferentes aislamientos.

Cebadores del ensayo TP LAMP. Los cebadores LAMP se basaron en la cepa T. pecoris 19OD0592 (Nº de acceso NZ_CP063212.1). La alineación con otros genomas de T. pecoris mostró la alta conservación de la región objetivo. Consulta = Cepa de T. pecoris 19OD0592, CP071974.1 = Cepa de T. pecoris 15IMDO307, CP063213.1 = Cepa de T. pecoris 15A0121, CP053291.1 = Cepa de T. pecoris 19M2397.

Optimización de la temperatura del ensayo TP LAMP. Los tiempos de detección se muestran para 0,5 pg de ADN de control positivo/25 µl de la cepa T. pecoris DSM 111392T en función de la temperatura de reacción utilizada. Las marcas y las barras indicadoras de error representan la media y la desviación estándar, respectivamente, de tres mediciones independientes.

La especificidad analítica del ensayo TP LAMP se evaluó mediante 44 cepas bacterianas, incluidos 11 aislados de T. pecoris de diferentes orígenes (Tabla 1) y 33 especies no objetivo. La inclusividad y exclusividad del ensayo fueron ambas del 100% con respecto a los aislados analizados (Tabla 2).

Para determinar la sensibilidad analítica del ensayo TP LAMP, se analizó ADN diluido en serie diez veces. Se pudo detectar una concentración mínima de 0,5 pg de ADN/25 µl en las tres repeticiones. La disminución del contenido de ADN en la mezcla de reacción se asoció con un aplanamiento de las curvas de amplificación y un aumento no lineal en los tiempos de detección (Fig. 3A + B). Por el contrario, una PCR en tiempo real dirigida al mismo amplicón que TP LAMP detectó una concentración mínima de 50 fg de ADN/25 µl en las tres repeticiones.

Sensibilidad analítica del ensayo TP LAMP. (A) Curvas de amplificación para ADN diluido en serie diez veces de T. pecoris DSM 111392T. Característica de LAMP, las curvas de amplificación se aplanaron al disminuir la concentración de ADN. NTC = control sin plantilla. (B) Tiempos de detección para ADN diluido en serie diez veces de T. pecoris DSM 111392T en función de la concentración de ADN por reacción. Las marcas y las barras indicadoras de error representan la media y la desviación estándar, respectivamente, de tres mediciones independientes. Al disminuir la concentración de ADN, los tiempos de detección no aumentaron linealmente. Por este motivo, LAMP no era adecuado para cuantificar las especies objetivo.

La determinación de los límites de detección basados ​​en células del ensayo TP LAMP se basó en tres métodos de extracción de ADN. Utilizando el kit DNeasy Blood & Tissue, TP LAMP detectó hasta 6,0 × 102 UFC/25 µL en las tres repeticiones. Esto fue 600 veces menos sensible en comparación con la PCR en tiempo real con diana genómica idéntica, que fue capaz de detectar hasta 1 UFC/20 µL. El límite de detección del ensayo TP LAMP mejoró a 2,3 × 102 UFC/25 µL mediante extracción con tampón único e incluso alcanzó 2,3 UFC/25 µL después de aplicar un paso de calentamiento adicional.

Se analizaron muestras de tejido pulmonar porcino contaminadas artificialmente para evaluar la idoneidad de la aplicación del ensayo TP LAMP bajo la influencia del material de la muestra y la flora de fondo del tipo de muestra. El tejido pulmonar se recogió durante las disecciones realizadas como parte de los procedimientos de diagnóstico de rutina en la Estación de Campo de Epidemiología en Bakum (Universidad de Medicina Veterinaria de Hannover). Los límites de detección para las cepas de T. pecoris DSM 111392T y 203/7 se determinaron y evaluaron utilizando tres métodos de extracción de ADN adaptados al muestreo con hisopo. Los resultados correspondientes en términos de recuento de patógenos por hisopo se muestran en la Tabla 3. Usando ADN extraído con el kit, TP LAMP fue 100 y 300 veces menos sensible que la PCR en tiempo real para las cepas de T. pecoris DSM 111392T y 203/7, respectivamente. . Sin embargo, todos los resultados pudieron interpretarse claramente y no se produjeron falsos negativos cuando las muestras se analizaron con TP LAMP. Por el contrario, la PCR en tiempo real frecuentemente producía señales falsas positivas bajo la influencia de la matriz de la muestra. Las curvas de fusión de los productos LAMP siempre fueron uniformes, mientras que las curvas de fusión de los productos de PCR correspondientes mostraron una amplia variedad de perfiles en comparación con el control positivo, con picos de fusión en su mayoría divergentes pero también parcialmente uniformes.

Trueperella pecoris es una nueva especie bacteriana que parece estar relacionada con varias enfermedades animales, incluida la mastitis en el ganado vacuno, la bronconeumonía en los cerdos y las alteraciones del tracto reproductivo en los rumiantes1,4. Además, la presencia de T. pecoris en la glándula mamaria bovina sugiere que también se debe considerar la infección humana por el consumo de leche contaminada, ya que las propiedades patógenas humanas de Trueperella spp. se describen con frecuencia en la literatura14, 15. Sin embargo, los datos disponibles no permiten sacar conclusiones definitivas sobre si T. pecoris realmente se presenta como agente causante de enfermedades. En este estudio se desarrolló un sistema de detección que permite realizar diagnósticos específicos en muestras clínicas y así ayuda a generar datos epidemiológicos y aclarar el significado patogénico de la bacteria.

Los cebadores del ensayo TP LAMP se basaron en una región genética que codifica una peptidasa de la familia S9 que se ha demostrado que es única en T. pecoris mediante análisis BLAST. Las funciones de estas enzimas hasta ahora se han estudiado mejor en humanos y están asociadas con procesos metabólicos inmunológicos y hormonales complejos16. Se puede suponer que la peptidasa de la familia S9 también desempeña un papel clave en el metabolismo de T. pecoris y que el gen codificante está constantemente presente y conservado en el genoma bacteriano. Esto se reflejó en el alto nivel de inclusión del ensayo TP LAMP para las especies objetivo y de exclusividad para las especies no objetivo.

Se compararon los rendimientos de TP LAMP y PCR dirigidos al mismo amplicón en términos de sensibilidad analítica. En la literatura, existe una verdadera competencia entre las dos técnicas de amplificación, y a menudo se enfatiza que LAMP es superior a PCR10. Sin embargo, esto debe verse de manera diferenciada. Por ejemplo, LAMP normalmente alcanza una mayor sensibilidad analítica solo en comparación con la PCR convencional17, 18. Considerando los resultados de la PCR en tiempo real, con frecuencia se obtienen límites de detección similares o incluso peores19,20. Por lo tanto, no fue inusual que el ensayo TP LAMP presentado en este estudio mostrara una sensibilidad analítica 10 veces menor que la de la PCR en tiempo real. El ensayo TP LAMP pudo compensar esta diferencia con otras propiedades ventajosas y fue superior a la PCR en tiempo real, particularmente en la prueba de matrices de muestras complejas.

Al examinar el límite de detección basado en células, curiosamente hubo una pérdida significativa de sensibilidad cuando se analizó el ADN extraído con el kit. Por el contrario, el rendimiento del ensayo TP LAMP podría mejorarse mediante la extracción con tampón LPTV con calentamiento adicional, lo que probablemente se debió a un rendimiento de ADN comparativamente mayor. Además, este método de extracción de ADN se caracteriza por su rapidez y su idoneidad para su uso in situ. Sin embargo, no se incluyen pasos de lavado, lo que significa que los componentes inhibidores no se eliminan. Esto suele plantear un problema para el diagnóstico por PCR, ya que las plantillas de ADN de baja calidad insuficientemente procesadas pueden asociarse con la supresión de la amplificación y la obtención de resultados falsos negativos21. Por el contrario, LAMP es conocido por su capacidad para lidiar con inhibidores potenciales22, lo que hace que el método sea compatible con técnicas de preparación de ADN no sofisticadas, rápidas y de bajo costo.

El ensayo TP LAMP también demostró las propiedades descritas anteriormente cuando se probó en muestras de tejido pulmonar porcino. Esta matriz fue seleccionada porque puede representar un órgano diana potencial para la infección por T. pecoris1. Tanto las partículas de tejido como la sangre se adhirieron a las muestras tomadas con hisopo, por lo que contenían varios componentes inhibidores como hemoglobina, lactoferrina o inmunoglobulina G23,24. De manera similar a los hallazgos anteriores de este estudio, TP LAMP mostró una menor sensibilidad para las muestras de ADN extraídas con el kit en comparación con la PCR en tiempo real, pero compensó esta limitación cuando se utilizaron plantillas de extracción con tampón LPTV con calentamiento posterior. Sin embargo, las diferencias entre TP LAMP y PCR en tiempo real con respecto a la sensibilidad en muestras complejas solo pueden evaluarse de forma limitada, ya que con frecuencia se produjeron reacciones falsas positivas en el examen de PCR en tiempo real. Por el contrario, todas las reacciones de TP LAMP se pudieron interpretar claramente y no mostraron resultados falsos positivos, lo que respalda la solidez de este ensayo.

Actualmente no se dispone de ningún método de referencia cultural o biomolecular para el diagnóstico de T. pecoris, por lo que la identificación de la bacteria hasta ahora sólo es posible mediante la recolección no dirigida de aislados sospechosos seguida de análisis de secuencia laboriosos y que requieren mucho tiempo. En consecuencia, sería necesario obtener material de muestra adecuado de animales infectados durante los estudios apropiados y las pruebas posteriores con TP LAMP para completar finalmente la validación de este ensayo. Dado que hasta la fecha solo se han aislado las 11 cepas de T. pecoris enumeradas en la Tabla 1, se espera que este proceso lleve más tiempo y no se pueda abordar en este estudio. Aún no se dispone de conocimientos sobre el potencial zoonótico de esta especie, pero si la transmisión a los humanos se produce a través de animales productores de alimentos, la validación del ensayo TP LAMP también debería ampliarse a muestras de carne y leche.

En conclusión, el ensayo TP LAMP descrito en este estudio representa el primer método disponible para diagnosticar infecciones por T. pecoris en materiales de muestra complejos. El hecho de que el ensayo detecte la bacteria con alta especificidad y sensibilidad en plantillas no purificadas reduce los costos, la mano de obra y el tiempo para el análisis de muestras, al mismo tiempo que garantiza una alta confiabilidad de los resultados. Estas son condiciones adecuadas para realizar estudios de prevalencia a gran escala, ya que el ensayo TP LAMP se puede utilizar tanto en condiciones de laboratorio como de campo. Los datos que ahora se pueden recopilar mediante el diagnóstico TP LAMP se pueden procesar para sacar conclusiones sobre la patogenicidad de T. pecoris en humanos y animales, lo que debería ser objeto de futuros estudios.

La secuencia de la cepa 19OD0592 de T. pecoris sirvió como base para diseñar seis cebadores LAMP específicos utilizando el software de diseño LAMP versión 1.15 (PREMIER Biosoft, Palo Alto, CA, EE. UU.). Los datos de la secuencia se obtuvieron de la base de datos GenBank (número de acceso NZ_CP063212.1) proporcionada por NCBI (Bethesda, EE. UU.). Para determinar una región de secuencia específica de la especie, se alinearon sucesivamente secciones del genoma de T. pecoris con otros datos de secuencia disponibles en GenBank utilizando el algoritmo megablast de la herramienta integrada de búsqueda de alineación local básica (BLAST) (NCBI). Después de importar los datos seleccionados al software de diseño LAMP, se generaron varios cebadores LAMP utilizando parámetros predeterminados y se sometieron al cebador integrado BLAST25. Posteriormente, se seleccionó un conjunto de cebadores apropiado, que consta de cuatro cebadores básicos y dos de bucle, según la clasificación realizada por el software y de acuerdo con las propiedades de especificidad óptimas (Fig. 1). La producción de los cebadores LAMP se contrató a Eurofins Genomics GmbH (Ebersberg, Alemania).

Todas las reacciones LAMP se llevaron a cabo utilizando el fluorómetro en tiempo real Genie II® de OptiGene Ltd. (Horsham, Reino Unido). El dispositivo está equipado con una batería recargable y puede operarse in situ mediante una pantalla táctil, lo que también permite la visualización directa de los resultados. Para determinar la composición óptima de los cebadores TP LAMP individuales en una mezcla de reacción, se prepararon dos juegos de cebadores, que constan de una versión estándar y una concentrada, de acuerdo con las recomendaciones de OptiGene Ltd. Utilizando el juego de cebadores TP estándar, se determinaron las concentraciones de cebadores. F3 y B3, los cebadores FIP y BIP y los cebadores LF y LB en una mezcla de reacción fueron 0,2 µM, 0,8 µM y 0,4 µM, respectivamente. Por el contrario, las concentraciones de los cebadores F3 y B3, los cebadores FIP y BIP y los cebadores LF y LB en una mezcla de reacción fueron 0,2 µM, 2,0 µM y 1,0 µM, respectivamente, cuando se utilizó la versión concentrada del conjunto de cebadores TP. Cada mezcla de reacción con un volumen total de 25 µl contenía 15 µl de mezcla maestra isotérmica GspSSD (ISO-001) (OptiGene Ltd.), 2,5 µl de mezcla de cebador, 2,5 µl de agua libre de nucleasas (NFW) y 5 µl de plantilla de ADN. El conjunto de cebadores óptimo se seleccionó mediante los tiempos de detección logrados para el ADN estandarizado (0,1 ng/μl) de la cepa de referencia de T. pecoris DSM 111392T y la cepa de campo de T. pecoris 203/7. Posteriormente, la temperatura de reacción del ensayo TP LAMP se optimizó para el conjunto de cebadores seleccionado evaluando el ADN estandarizado (0,1 ng/μL) de la cepa de referencia de T. pecoris DSM 111392T utilizando un gradiente de temperatura entre 62 y 69 °C en el Genie II®. instrumento. La temperatura a la que se midieron los tiempos de detección más bajos se aplicó para las pruebas LAMP posteriores. Los experimentos de optimización se realizaron por triplicado y se evaluaron con el software de aplicación Genie Explorer versión 2.0.7.11 (OptiGene Ltd.) utilizando parámetros predeterminados. Cada ejecución incluyó una reacción de control positiva y negativa utilizando una plantilla de ADN de T. pecoris DSM 111392T (0,1 ng/μl) y NFW, respectivamente.

Se estableció un ensayo de PCR en tiempo real dirigido al mismo amplicón que el ensayo TP LAMP para comparar el rendimiento de ambas técnicas de amplificación. Para este propósito, se utilizaron los cebadores LAMP TP-F3 y TP-B3 como cebador directo e inverso en el ensayo de PCR en tiempo real, respectivamente. Cada reacción tenía un volumen total de 20 µl y contenía 10 µl de FastStart Essential DNA Green Master (Roche), 1 µl de cebador TP-F3 y TP-B3 (10 µM), 3 µl de H2O y 5 µl de plantilla de ADN. Las ejecuciones comenzaron con una desnaturalización inicial a 95 °C durante 10 minutos, seguida de 45 ciclos de amplificación en tres pasos y fusión. La amplificación en tres pasos incluyó desnaturalización a 95 °C durante 10 s, recocido a 60 °C durante 10 s y elongación a 72 °C durante 10 s con velocidades de rampa de 4,4, 2,2 y 4,4 °C. respectivamente. Las señales de fluorescencia se midieron después de cada paso de elongación. Las curvas de fusión se generaron utilizando un perfil de temperatura-tiempo de 95 °C durante 10 s, 65 °C durante 60 s y 97 °C durante 1 s. Al igual que con el ensayo TP LAMP, se utilizaron plantilla de ADN de T. pecoris DSM 111392T (0,1 ng/μl) y NFW como control positivo y negativo, respectivamente, en cada ejecución.

Para la extracción de ADN, todas las bacterias se cultivaron en agar sangre de oveja Columbia (Oxoid Deutschland GmbH, Wesel, Alemania) de acuerdo con los requisitos específicos de cada especie. Se incubaron aislados de Escherichia coli, Enterococcus faecalis y Enterococcus faecium durante 24 h a 37 °C en condiciones aeróbicas. Por el contrario, se utilizó una atmósfera de tarro de velas para cultivar Trueperella spp. y Arcanobacterium spp. durante 24 a 48 h a 37 °C. Para el aislamiento del ADN, se utilizó el kit DNeasy Blood & Tissue (Qiagen GmbH, Hilden, Alemania) con ligeras modificaciones. En lugar de recolectar células bacterianas de cultivos líquidos mediante centrifugación, se recogieron de 5 a 10 colonias de bacterias Gram positivas o Gram negativas de placas de agar y se resuspendieron directamente en tampón de lisis enzimática (Tris-HCl 20 mM, pH 8,0; EDTA sódico 2 mM). ; Triton® X-100 al 1,2 %; lisozima, 20 mg/ml) o tampón ATL, respectivamente. Los siguientes pasos para la extracción de ADN se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Se utilizó un total de 44 aislados bacterianos para probar la especificidad analítica del ensayo TP LAMP (Tabla 2). Las cepas se derivaron de la colección de cultivos internos del Instituto de Calidad y Seguridad Alimentaria de la Universidad de Medicina Veterinaria de Hannover, Fundación (Hannover, Alemania), la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares GmbH (Braunschweig, Alemania), la Colección Nacional de Type Cultures (Salisbury, Reino Unido) y de RIPAC-LABOR GmbH (Potsdam, Alemania, base de datos de cepas europea ENOVAT). Para las pruebas de inclusión, se consideraron cepas de T. pecoris previamente descritas procedentes de ganado vacuno y camello1,4, así como otros aislados de T. pecoris (Tabla 1). Los resultados positivos se definieron por la aparición de una señal de fluorescencia asociada a una temperatura de fusión específica. Las cepas utilizadas para las pruebas de exclusividad se seleccionaron debido a su estrecha relación genética con T. pecoris y su coexistencia en el mismo entorno.

La sensibilidad analítica del ensayo TP LAMP se determinó mediante ADN diluido en serie diez veces de la cepa T. pecoris DSM 111392T. Se utilizó tampón AE del kit DNeasy Blood & Tissue (Qiagen) como medio de dilución. Las concentraciones de ADN se ajustaron de 1 ng/μl a 1 fg/μl y cada plantilla se analizó por triplicado utilizando TP LAMP. A modo de comparación, cada plantilla también se examinó tres veces mediante PCR en tiempo real. La sensibilidad analítica se definió como la cantidad mínima de ADN por reacción en la que los resultados fueron positivos en las tres réplicas.

Para aislar el ADN de T. suspensiones de células de pecoris y muestras de hisopos de tejido pulmonar porcino. La extracción basada en kit se realizó utilizando el kit DNeasy Blood & Tissue (Qiagen) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Los pasos de incubación requeridos a 37 °C y 56 °C duraron 1 h cada uno. Para comparar la sensibilidad de LAMP y PCR, todos los aislados del kit se analizaron con ambos métodos. Aplicando el método de extracción con tampón único, los sedimentos se suspendieron en 500 µl de tampón LPTV (AmplexDiagnostics GmbH, Gars am Inn, Alemania), se incubaron durante 5 minutos a temperatura ambiente y se probaron directamente exclusivamente usando TP LAMP. Posteriormente, las mismas suspensiones de células LPTV se sometieron a calentamiento a 100 °C durante 10 minutos y se probaron nuevamente.

El límite de detección basado en células del ensayo TP LAMP se determinó mediante suspensiones celulares diluidas en serie diez veces. Para ello, se cultivó la cepa T. pecoris DSM 111392T durante 48 h a 37 °C en un frasco con vela. El material de la colonia se suspendió en 5 ml de solución de NaCl (0,9%) hasta que se alcanzó una turbidez de 2,0 unidades McFarland (MFU). Posteriormente, la suspensión se diluyó en serie diez veces de 10–1 a 10–8 utilizando tubos de diluyente de recuperación máxima de 9 ml (Oxoid Deutschland GmbH). El ADN se extrajo como se describió anteriormente a partir de sedimentos celulares obtenidos de 1 ml de cada nivel de dilución después de centrifugar las alícuotas de 1 ml durante 10 minutos a 7500 rpm. Se descartaron cuidadosamente los sobrenadantes. Cada procedimiento de aislamiento se repitió tres veces. El límite de detección se definió como el recuento mínimo de células T. pecoris en el que los resultados fueron positivos en las tres réplicas.

Para evaluar la idoneidad del método TP LAMP bajo la influencia de la matriz de la muestra y su flora de fondo, se tomaron muestras de hisopo de tejido pulmonar porcino y se contaminaron artificialmente con T. pecoris. Para la contaminación artificial se utilizaron la cepa T. pecoris DSM 111392T y la cepa 203/7 de T. pecoris asociada a camellos. Para ello, las cepas se cultivaron durante 48 h a 37 °C en un frasco con vela y se prepararon series de diluciones decimales como se describió anteriormente. Se frotaron con un hisopo de algodón esterilizado la superficie del pulmón de un cerdo clínicamente sano, así como las capas de tejido más profundas abiertas mediante una incisión estéril en el tejido pulmonar. Posteriormente, el hisopo se transfirió a un tubo de reacción de 1,5 ml lleno con 900 µl de MRD, se hizo girar repetidamente y finalmente se exprimió en la pared. Para cada cepa se prepararon 10 tubos. De cada nivel de dilución de las suspensiones de dos cepas celulares, se tomaron 100 µl y se agregaron al material de hisopo que contenía medio MRD. Un tubo por cepa permaneció sin inocular y sirvió como control negativo de extracción. Después de centrifugar los tubos a 7500 rpm durante 10 minutos, se desecharon cuidadosamente los sobrenadantes. Se utilizaron pellets para la extracción de ADN como se describió anteriormente. El experimento se repitió tres veces en tres días consecutivos. El límite de detección en muestras de tejido pulmonar porcino se definió como el recuento promedio de células T. pecoris por hisopo en el que los resultados fueron positivos en las tres réplicas.

Los datos generados durante las ejecuciones de LAMP y PCR se analizaron utilizando el software de aplicación Genie Explorer versión 2.0.7.11 y Light Cycler® 96 versión 1.1.0.1320 proporcionados por los respectivos fabricantes de instrumentos. El procesamiento de datos brutos y los análisis estadísticos se realizaron con Microsoft Excel versión 2303.

Los conjuntos de datos utilizados y analizados durante el presente estudio están disponibles a través de solicitud razonable del autor correspondiente.

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Los autores desean agradecer a Silke Ortaeri y Anke Bertling por su excelente asistencia técnica. Gracias también a Manfred Merle por editar las ilustraciones para su publicación.

Esta publicación de acceso abierto fue financiada por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundación Alemana de Investigación) - 491094227 “Open Access Publication Funding” y la Fundación de la Universidad de Medicina Veterinaria de Hannover. Financiamiento de Acceso Abierto habilitado y organizado por Projekt DEAL.

Instituto de Calidad y Seguridad de los Alimentos, Universidad de Medicina Veterinaria de Hannover, Bischofsholer Damm 15, 30173, Hannover, Alemania

Antonia Kreitlow, Madeleine Plötz y Amir Abdulmawjood

Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad Wijaya Kusuma Surabaya, Jl. Dukuh Kupang XXV No.54, Dukuh Kupang, Surabaya, 60225, Indonesia

Siti Gusti Ningrum

Instituto de Higiene y Enfermedades Infecciosas de los Animales, Universidad Justus Liebig de Giessen, Frankfurter Str. 87-89, 35392, Giessen, Alemania

Christoph Lämmler y Christiane Hoffmann

RIPAC-LABOR GmbH, Am Mühlenberg 11, 14476, Potsdam, Alemania

marcel erhard

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AK, CL y AA fueron responsables de la conceptualización del proyecto. AK diseñó los experimentos y escribió el borrador original del manuscrito. AK y SGN realizaron experimentos. AK, SGN y AA analizaron los datos. ME y CH proporcionaron cepas de T. pecoris. MP supervisó el proyecto. Todos los autores revisaron y aprobaron la versión final del artículo.

Correspondencia a Amir Abdulmawjood.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Kreitlow, A., Ningrum, SG, Lämmler, C. et al. Identificación del nuevo patógeno potencial Trueperella pecoris con importancia entre especies mediante diagnóstico LAMP. Representante científico 13, 14005 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-40787-1

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Recibido: 02 de junio de 2023

Aceptado: 16 de agosto de 2023

Publicado: 27 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-40787-1

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