La neuroinvasión y la anosmia son fenómenos independientes tras la infección por SARS

Nature Communications volumen 14, número de artículo: 4485 (2023) Citar este artículo

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La anosmia se identificó como un sello distintivo de la COVID-19 al principio de la pandemia; sin embargo, con la aparición de variantes preocupantes, el perfil clínico inducido por la infección por SARS-CoV-2 ha cambiado, siendo la anosmia menos frecuente. Aquí, evaluamos las condiciones clínicas, olfativas y neuroinflamatorias de hámsteres dorados infectados con la cepa original de Wuhan SARS-CoV-2, su mutante isogénico con deleción ORF7 y tres variantes: Gamma, Delta y Omicron/BA.1. Mostramos que los animales infectados desarrollan una enfermedad clínica dependiente de variantes que incluye anosmia, y que el ORF7 del SARS-CoV-2 contribuye a la inducción de disfunción olfativa. Por el contrario, todas las variantes del SARS-CoV-2 son neuroinvasivas, independientemente de la presentación clínica que induzcan. En conjunto, esto confirma que la neuroinvasión y la anosmia son fenómenos independientes tras la infección por SARS-CoV-2. Utilizando el SARS-CoV-2 que expresa nanoluciferasa recientemente generado, validamos la vía olfativa como un importante punto de entrada al cerebro in vivo y demostramos in vitro que el SARS-CoV-2 viaja retrógrada y anterógradamente a lo largo de los axones en redes neuronales epiteliales de microfluidos.

La pandemia de COVID-19 sigue siendo un importante problema de salud pública mundial. Desde el inicio de la pandemia en diciembre de 2019, se han confirmado más de 760 millones de casos, todas las variantes del SARS-CoV-2 combinadas1. El SARS-CoV-2 original (Wuhan) dio lugar a diferentes variantes preocupantes (VoC) en el primer año de la pandemia (Alpha/B.1.1.7, Beta/B.1.351, Gamma/P.1), que fueron reemplazados casi totalmente por el VoC Delta (B1.617.2, AY*) en 2020, por el VoC Omicron y sus linajes (por ejemplo, BA.1, BA.2 y BA.5) en 2021-2022 y recombinantes (XBB*) 1.

El SARS-CoV-2 infecta las células de las vías respiratorias superiores e inferiores, y el COVID-19 se manifiesta mediante multitud de síntomas respiratorios y extrarrespiratorios, incluidas manifestaciones neurológicas, que van desde dolor de cabeza y mareos hasta anosmia, ageusia e incluso accidente cerebrovascular2,3,4 . Actualmente se considera que la neuropatología de la COVID-19 es una consecuencia de la inflamación y la hipoxia, más que de una invasión viral directa al SNC5,6. Sin embargo, con la aparición de las VoC y el aumento de la tasa de vacunación o infección previa, la sintomatología del COVID-19 ha cambiado. En este contexto, el cuadro clínico inducido por el VoC Omicron/BA.1 es menos grave o en ocasiones asintomático, con una mayor tasa de afectación de las vías respiratorias superiores, respetando la mucosa olfativa y, en consecuencia, una menor incidencia de anosmia, inicialmente considerada una característica de la COVID. -197,8,9,10,11,12,13.

Previamente, determinamos que la infección de neuronas sensoriales olfativas y la pérdida de cilios en la mucosa olfativa causada por el SARS-CoV-2 Wuhan en humanos y hámsteres sirios se asociaron con la pérdida de olfato, así como con inflamación local y neuroinflamación en los bulbos olfativos. , dando fe de que el hámster dorado es un modelo relevante para estudiar la patogénesis de la infección por SARS-CoV-214,15,16. Otros autores informaron microgliosis persistente en los bulbos olfatorios de hámsteres infectados17, y se han descrito diferencias en la neuroinvasividad y neurovirulencia de las VoC18. Además, otros autores han intentado comparar la patogenicidad de los VoC en hámsteres19,20,21, pero faltan estudios que relacionen la invasión cerebral del SARS-CoV-2 con los síntomas neurológicos. Además de la variación de patogenicidad debido a mutaciones en el pico de las variantes, otras proteínas virales pueden desempeñar un papel en la anosmia y la inflamación local, incluido ORF7, que se ha demostrado que interfiere con la inmunidad innata del huésped22,23,24, con células adhesión en la mucosa olfatoria25 y con receptores olfatorios26.

Aquí, mostramos que el SARS-CoV-2 Wuhan y los VoC Gamma, Delta y Omicron/BA.1 son capaces de invadir el cerebro de los hámsteres sirios y de provocar una respuesta inflamatoria específica de tejido. Utilizando virus bioluminiscentes generados por genética inversa, demostramos que el SARS-CoV-2 infecta los bulbos olfatorios, pero el perfil clínico, incluido el rendimiento olfativo, depende en gran medida de la variante. Además, la eliminación de la secuencia ORF7ab en el virus ancestral (Wuhan) reduce la incidencia de pérdida del olfato sin afectar el cuadro clínico ni la neuroinvasividad a través de los bulbos olfatorios. En consecuencia, este trabajo valida que el SARS-CoV-2 puede viajar dentro de los axones y la vía olfativa como principal vía de entrada del SARS-CoV-2 al cerebro y corrobora el potencial neurotrópico de las variantes del SARS-CoV-2. Por tanto, la neuroinvasión y la anosmia son fenómenos independientes de la infección por SARS-CoV-2.

Primero investigamos las diferencias en el cuadro clínico inducido por diferentes VoC del SARS-CoV-2 en comparación con el virus ancestral (Wuhan). Primero probamos las curvas de crecimiento in vitro de estos virus en células Vero-E6 y no encontramos diferencias significativas (Figura complementaria 1A). Luego, se inocularon hámsteres dorados macho por vía intranasal con 6 × 104 UFP de SARS-CoV-2 Wuhan, o los VoC Gamma, Delta u Omicron/BA.1 y se les dio seguimiento durante 4 días después de la infección (dpi). Todos los animales infectados por SARS-CoV-2 presentaron una pérdida progresiva de peso; sin embargo, se observó un efecto variante (Kruskal-Wallis P <0,0001, Fig. 1A, B), y los animales infectados por SARS-CoV-2 de Wuhan presentaron la pérdida de peso mediana más intensa (15,8%, rango intercuartil 'IQR' 3,9% ), seguidos de los animales infectados con Gamma (11,0%, IQR 2,6%), los animales infectados con Delta (9,4%, IQR 3,1%) y los animales infectados con Omicron/BA.1 (1,9%, IQR 2,5%). Los signos clínicos no específicos relacionados con la enfermedad (pelaje erizado, movimientos lentos, apatía) siguieron el mismo patrón (Kruskal-Wallis P <0,0001, Fig. 1D, E), y los animales infectados por SARS-CoV-2 Wuhan presentaron peores síntomas clínicos. imagen, seguidos por los animales infectados con Gamma y Delta, mientras que los animales infectados con Omicron/BA.1 presentaron una manifestación tardía de signos leves, clínicamente observables solo a 4 ppp.

A, B Variación del peso corporal durante los cuatro días posteriores a la infección. C Peso pulmonar medido a 4 ppp. D, E Puntuación clínica durante los cuatro días posteriores a la infección. La puntuación clínica se basa en una escala acumulativa de 0 a 4: pelaje erizado; movimientos lentos; apatía; y ausencia de actividad exploratoria. F Relación peso pulmonar-peso corporal medida a 4 ppp. A–F Las líneas horizontales indican la mediana y el rango intercuartílico (n = 8/grupo). B, C, E, F Prueba de Kruskal-Wallis seguida de la prueba de comparaciones múltiples de Dunn (se indica el valor de p ajustado cuando es significativo). G, H Rendimiento olfativo medido 3 días después de la infección (ppp). La prueba del olfato se basa en la prueba de búsqueda de alimentos ocultos (enterrados). Las curvas representan el desempeño olfativo de los animales durante la prueba (G) y las barras representan los resultados finales (H) (n = 8/grupo). Prueba de chi-cuadrado para tendencia (el valor p ajustado se indica cuando es significativo). Consulte las figuras complementarias. 1, 2.

La pérdida del olfato es un signo clínico típico de los hámsteres de Wuhan infectados por SARS-CoV-214; sin embargo, el déficit olfativo difirió según los diferentes VoC (Chi-cuadrado para la tendencia P <0,0001): 62,5% (5/8) de los hámsteres de Wuhan infectados por SARS-CoV-2. 2 animales infectados por Wuhan presentaron pérdida del olfato (prueba de rango logarítmico en comparación con el simulado P = 0,0012), solo el 12,5 % (1/8) de los animales infectados por Gamma perdieron el olfato por completo y el 62,5 % (5/8) presentó un deterioro del olfato. rendimiento olfativo (es decir, mayor tiempo para encontrar los cereales ocultos) (prueba de rango logarítmico en comparación con el simulacro P < 0,0001). Por el contrario, ninguno de los animales infectados con Delta y Omicron/BA.1 presentó signos de deterioro olfativo (Fig. 1G, H). Todos los animales encontraron la comida visible durante la prueba de control, lo que demuestra que ningún comportamiento enfermizo, discapacidad visual o déficit locomotor fue responsable del retraso en encontrar la comida oculta.

Varias mutaciones en el pico distinguen los diferentes VoC. Además, algunos aislados de VoC también presentan deleciones en la secuencia ORF727,28,29,30, incluido el aislado Delta utilizado en el presente estudio (deleción que abarca las posiciones 27506 a 27540 del genoma de referencia del SARS-CoV-2 Wuhan, que genera una parada codón (Figura complementaria 1D). Dado que se ha propuesto un posible vínculo entre ORF7b y la pérdida del olfato25, construimos un SARS-CoV-2 recombinante basado en la columna vertebral de CoV-2/W, donde la secuencia de ORF7ab fue reemplazada por la de GFP (SARS-CoV-2 Wuhan/ ΔORF7ab) (Figura complementaria 4A). Sorprendentemente, el perfil clínico exhibido por los hámsteres infectados con Wuhan/ΔORF7ab fue similar al causado por el SARS-CoV-2 de tipo salvaje Wuhan (Fig. 1A-F), lo que demuestra que ORF7ab no es esencial para la infección y replicación viral. Sin embargo, la incidencia de la pérdida del olfato disminuyó significativamente; sólo el 25% (2/8) de los animales infectados presentaron signos de anosmia, en contraste con el 62,5% (5/8) observado en los hámsteres infectados por CoV-2/SARS-COV-2 Wuhan (Fig. 1G, H). . A pesar de esta reducción en la incidencia de anosmia, todavía se detectó Wuhan/ΔORF7ab en las vías respiratorias y en los bulbos olfatorios de los animales infectados, con títulos aún más altos (Fig. 2A, B).

A Títulos virales infecciosos en el pulmón, los cornetes nasales y los bulbos olfatorios 4 días después de la infección (dpi) expresados ​​como TCID50 por 100 mg de tejido. Las líneas horizontales indican la mediana y el rango intercuartílico (n = 4/grupo). B Carga de ARN viral del SARS-CoV-2 detectada en el pulmón, los cornetes nasales y los bulbos olfatorios a 4 ppp. El ARN viral genómico y subgenómico se evaluó basándose en la secuencia del gen E. Las líneas horizontales indican la mediana y el rango intercuartílico. Las líneas grises conectan símbolos de los mismos animales (n = 4/grupo). Valores de expresión génica en pulmón (C), cornetes nasales (D) y bulbos olfatorios (E) de Mx2, Ifn-β, Il-6, Cxcl10, Tnf-α e Il-10 a 4 ppp. A – E Las líneas horizontales indican la mediana y el rango intercuartílico (n = 4/grupo). Prueba de Kruskal-Wallis seguida de la prueba de comparaciones múltiples de Dunn (se indica el valor de p ajustado cuando es significativo). nd: no detectado. Consulte las figuras complementarias. 1, 2.

Con respecto a la patología pulmonar, en cuanto a los otros parámetros clínicos, el agrandamiento de los pulmones y la relación peso pulmonar-peso corporal (LW/BW) fueron significativamente mayores en los animales infectados por SARS-COV-2 Wuhan y Wuhan/ΔORF7ab; Los animales infectados con Gamma y Delta presentaron valores intermedios, mientras que los valores de los animales infectados con Omicron/BA.1 fueron cercanos a los de los animales infectados simuladamente (Kruskal-Wallis P <0,0001, Fig. 1C, F). Asimismo, los hallazgos histopatológicos en los pulmones siguieron la misma tendencia: en todos los animales infectados se observaron congestión, edema, infiltración de células mononucleares, engrosamiento de las paredes alveolares y descamación del epitelio bronquiolar (Fig. 2A complementaria), junto con una infección difusa por SARS-CoV. -2 tinción de nucleocápside (Fig. 2B complementaria), observándose alteraciones más graves en los pulmones de animales infectados por SARS-COV-2 Wuhan que en hámsters infectados con Gamma, Delta y Omicron/BA.1.

En un análisis multivariado de parámetros clínicos registrados a 4 ppp, los dos primeros componentes principales explicaron el 91,9% de la variabilidad de la muestra. El peso corporal se cargó negativamente en PC1 (componente principal) y se correlacionó negativamente con la puntuación clínica y la relación LW/BW, mientras que el rendimiento olfativo se cargó positivamente en PC2 (Figura complementaria 3A). En el gráfico del análisis de componentes principales (PCA) con respecto a la inflamación relacionada con el tejido, la diferencia entre los grupos fue marcada: los animales simulados y los infectados con Omicron/BA.1 se cargaron de manera homogénea y relativamente cerca, seguidos por los animales infectados con Delta. Animales infectados por SARS-COV-2 Wuhan, Wuhan/ΔORF7ab y Gamma cargados de una manera más dispersa, lejos de los otros VoC, efecto del déficit de rendimiento olfativo y gravedad clínica (Figura complementaria 3C).

A continuación, medimos el título viral y las cargas de ARN en las vías respiratorias superiores (cornetes nasales) y en las vías respiratorias inferiores (pulmones). Se detectaron virus infecciosos en los cornetes nasales y en los pulmones de todos los hámsteres infectados independientemente del VoC, sin embargo, se observó un efecto variante, con los valores más altos para los animales infectados con Gamma y los valores más bajos para Omicron/BA. 1 animales infectados (Kruskal-Wallis P <0,0001, Fig. 2A). Se detectó ARN genómico y subgenómico del SARS-CoV-2 por igual en los pulmones de todos los animales infectados; pero a diferencia en los cornetes nasales, independientemente de la positividad de todas las muestras, los animales infectados con Delta presentaron la carga viral más alta (Kruskal-Wallis P = 0,0023, Fig. 2B).

Tanto las vías respiratorias superiores como las inferiores respondieron a la infección por todos los VoC (Fig. 2C, D), pero con una firma inflamatoria específica del tejido: en los pulmones, Mx2, Il-6, Cxcl10 e Il-10 estaban regulados positivamente para todos los VoC. , y el más alto en animales infectados por SARS-COV-2 en Wuhan (Fig. 2C). En los cornetes nasales, la expresión genética de Ifn-β e Il-6 presentó los valores más altos en animales infectados por SARS-COV-2 Wuhan y los más bajos en animales infectados por Omicron/BA.1. La expresión de Mx2, Cxcl10 e Il-10 fue la más alta en los animales infectados con Delta, mientras que los animales infectados con Omicron/BA.1 mostraron los niveles más bajos (Fig. 2D). Curiosamente, la infección por Wuhan/ΔORF7ab indujo una firma inflamatoria pulmonar diferente en comparación con Wuhan u otros VoC, representada por una mayor expresión de Mx2 e Ifn-β (Fig. 2C). En los cornetes nasales, la infección por Wuhan/ΔORF7ab también indujo una mayor expresión de Mx2, pero también de Il-6, Cxcl10, Tnf-α e Il-10 (Fig. 2D). Para apreciar mejor la expresión genética relacionada con el tejido frente a la relacionada con el virus, realizamos un análisis multivariado de estos datos. Curiosamente, los dos primeros componentes principales explicaron el 79,5% de la variabilidad de la muestra (Figura complementaria 3B). En las gráficas de PCA, los cornetes nasales de todos los hámsteres infectados se cargaron uno cerca del otro (Figura complementaria 3D), mientras que los pulmones se separaron por un efecto importante de Il-6, Cxcl10 e Il-10 (Figura complementaria 3D). ).

Después de establecer el perfil clínico e inflamatorio de los animales infectados, nuestro objetivo fue evaluar el efecto de la infección en los bulbos olfatorios. Sorprendentemente, incluso si el rendimiento olfativo difirió según los VoC (Fig. 1G, H), se detectaron títulos virales positivos en los bulbos olfativos de los animales de todos los grupos infectados, siendo los animales infectados con Wuhan/ΔORF7ab y Gamma los que presentaron el título más alto en 4 ppp (Kruskal-Wallis P = 0,0096, Fig. 2A). Estos hallazgos también fueron corroborados por la detección de ARN viral genómico en los bulbos olfatorios de animales de todos los grupos infectados, pero la carga de ARN viral fue mayor en los animales infectados por SARS-COV-2 en Wuhan (Kruskal-Wallis P = 0,0104, Fig. 2B). Por el contrario, en estas muestras, el ARN subgenómico estaba por debajo del límite de detección.

Los bulbos olfatorios presentaron un perfil inflamatorio intrigante. El gen antiviral Mx2, junto con los genes inflamatorios Ifn-β, Il-6 y Cxcl10, estaban altamente regulados en los bulbos olfatorios de todos los hámsteres infectados (Fig. 2E), independientemente de su desempeño olfativo en la prueba de búsqueda de alimento (Fig. 1G, H), sin embargo, la expresión de Il-10 estaba altamente regulada en los bulbos olfativos de los animales infectados con SARS-COV-2 Wuhan/ΔORF7ab (en comparación con el simulacro). Inesperadamente, la expresión genética de estos objetivos seleccionados tendió a ser mayor en los bulbos olfatorios de los animales infectados con Delta (Fig. 2E). En un análisis multivariado de la expresión genética relacionada con tejidos y virus, los bulbos olfativos de los animales infectados por el SARS-COV-2 de Wuhan tendieron a cargarse cerca de los cornetes nasales correspondientes (efecto de Il-6, Cxcl10 e Il-10). , mientras que los bulbos olfatorios de animales infectados con Gamma, Delta y Omicron/BA.1 se cargaron por separado, lo que posiblemente refleja el impacto de la expresión diferencial de Mx2, Tnf-α e Ifn-β (Figura complementaria 3D).

Habiendo detectado el virus en los bulbos olfatorios mediante técnicas virológicas y moleculares, nuestro objetivo fue visualizar la infección. Examinamos la distribución de SARS-CoV-2 Wuhan en todo el cerebro combinando la limpieza del tejido de toda la cabeza con imágenes de microscopía de lámina luminosa utilizando iDISCO+31. A 4 ppp, todos los hámsteres infectados por Wuhan mostraron una distribución viral difusa en la cavidad nasal: cornetes nasales y epitelio olfatorio (Fig. 3A y Película complementaria 1). En la misma línea, todos los animales infectados por SARS-COV-2 en Wuhan presentaron SARS-CoV-2 en los bulbos olfatorios en neuronas escasas, localizadas en la proximidad del punto de entrada del nervio olfatorio (Fig. 3B y Película complementaria 1). Mediante esta técnica no se observaron células infectadas en otras áreas del cerebro ni se detectó ninguna alteración en la red vascular.

A, B Limpieza e inmunomarcado de toda la cabeza iDISCO+ contra la nucleocápside del SARS-CoV-2 en hámsteres infectados con el virus original del SARS-CoV-2 (Wuhan) 4 días después de la infección (dpi). Un cornete nasal representativo (sección sagital del cráneo) que muestra una distribución difusa del SARS-CoV-2 (barra de escala = 500 µm). B Sección representativa del bulbo olfatorio teñida para la nucleocápside del SARS-CoV-2 y para la podoplanina (CD31/Podo) para identificar el compartimento vascular. Nótese la presencia de SARS-CoV-2 en las neuronas del bulbo olfatorio, sin alteraciones macroscópicas en la red vascular del bulbo olfatorio. Barra de escala: 200 µm. Consulte la película complementaria 1. C, F Los virus SARS-CoV-2 recombinantes bioluminiscentes inducen una enfermedad clínica con infección de los bulbos olfatorios. C Perfil clínico de hámsteres infectados con los virus recombinantes SARS-CoV-2 Wuhan_nLuc y Wuhan/ΔORF7ab_nLuc (basado en el SARS-CoV-2 Wuhan original) y Delta_nLuc (basado en la variante Delta). La pérdida de peso corporal y la puntuación clínica son comparables con las inducidas por virus de tipo salvaje (n = 4/grupo). Las líneas horizontales indican la mediana y el rango intercuartil (ver Fig. 1A). La puntuación clínica se basa en una escala acumulativa de 0 a 4: pelaje erizado; movimientos lentos; apatía; y ausencia de actividad exploratoria (Ver Fig. 1D). D Valores de bioluminiscencia ex vivo de los pulmones, los bulbos olfatorios (vista ventral), los cerebros (vista ventral) a 4 ppp (n = 4/grupo). Las líneas horizontales indican la mediana y el rango intercuartílico. Prueba de Kruskal-Wallis seguida de la prueba de comparaciones múltiples de Dunn (se indica el valor de p ajustado cuando es significativo). El área gris rayada corresponde a señales de fondo obtenidas de los mismos tejidos de un hámster infectado simuladamente. E, F Imágenes representativas ex vivo de un pulmón (C) y un cerebro (D) de un hámster infectado con un SARS-CoV-2 recombinante que expresa el nLuc a 4 ppp. Tenga en cuenta que en el cerebro, el principal foco bioluminiscente se localiza en la cara ventral de los bulbos olfatorios. Consulte la figura complementaria 3.

A continuación utilizamos un método complementario para visualizar la infección de los bulbos olfatorios. Con este fin, generamos virus recombinantes que expresan la nanoluciferasa mediante genética inversa (Wuhan_nLuc, Wuhan/ΔORF7ab_nLuc y Delta_nLuc; Figuras complementarias 1B, C y Figuras complementarias 4A). El perfil de la enfermedad inducido por estos tres nuevos virus recombinantes fue similar al perfil inducido por los virus parentales de tipo salvaje (Fig. 3C). Se realizaron imágenes in vivo de hámsteres infectados a 4 ppp utilizando fluorofurimacina (FFz) como sustrato. Se observaron señales positivas muy bajas en la región de la cavidad nasal, posiblemente debido al grosor de la piel y los huesos que podrían bloquear la emisión de luz, pero significativamente mayores en Wuhan_nLuc que en Wuhan/ΔORF7ab_nLuc o Delta_nLuc (Kruskal-Wallis P = 0,0107 , Figura complementaria 4BC). Se obtuvieron resultados más sensibles durante las imágenes ex vivo. Después de la eutanasia, se recolectaron y tomaron imágenes de los pulmones y el cerebro. Se obtuvieron señales positivas en los pulmones con la misma intensidad para los tres virus (Fig. 3D) y presentaron una distribución multifocal/difusa (Fig. 3E y Fig. 4D complementaria). Se tomaron imágenes de los cerebros en posición ventral para exponer mejor los bulbos olfatorios. Se registraron intensas señales luminiscentes en los cerebros de hámsteres infectados con todos los virus; al colocar el ROI (región de interés) exclusivamente en los bulbos olfativos, la intensidad fue mayor en Wuhan_nLuc en comparación con Delta_nLuc; por el contrario, al considerar toda el área ventral del cerebro, la intensidad fue mayor en Delta_nLuc. Wuhan / ΔORF7ab_nLuc indujo valores intermedios (Fig. 3C y Fig. 4D complementaria), que podrían reflejar la mayor tasa de replicación detectada en los bulbos olfatorios infectados en Wuhan (Fig. 2B). A pesar de las diferencias de intensidad, los bulbos olfatorios fueron la principal estructura infectada en el cerebro, y las vistas sagitales del cerebro indican que el origen de la señal luminiscente es la parte ventral de los bulbos olfatorios, que está situada encima del epitelio olfatorio en la cavidad nasal. (Fig. 3E y Fig. 4E complementaria).

Se encontró que todas las variantes del SARS-CoV-2 probadas podían invadir el SNC e infectar los bulbos olfativos, pero la incidencia de disfunciones olfativas varió según la VoC, y los hámsteres infectados con Delta y Omicron/BA.1 no presentaron signos de anosmia (Fig. 1G, H). Para probar si el inóculo viral podría influir en la neuroinvasividad del SARS-CoV-2 y la incidencia de disfunciones olfativas, infectamos hámsteres con una dosis infecciosa 2 log menor de Wuhan (6 × 102 UFP). Estos animales fueron sometidos a las mismas pruebas clínico-conductuales descritas anteriormente. En la fase aguda de la infección, hasta 4 ppp, la dosis infecciosa baja indujo una pérdida de peso corporal y una puntuación clínica similares a las de los animales infectados con el inóculo inicial (6 × 10^4 UFP), así como títulos virales infecciosos en el vías respiratorias y en los bulbos olfatorios (Figura complementaria 5). Sorprendentemente, a pesar de la presencia de virus infeccioso en los bulbos olfatorios, los animales infectados con una dosis infecciosa más baja presentaron una menor incidencia de disfunción olfatoria (25%, 2/8).

In vitro, la infección de neuronas por SARS-CoV-2 es un tema contradictorio32. Por un lado, hay descripciones de que el SARS-CoV-2 puede infectar neuronas dopaminérgicas derivadas de hPSC y provocar senescencia neuronal33, o que un pequeño subconjunto de neuronas derivadas de iPSC puede verse sometido a una infección abortiva34. Por otro lado, se sugirió que la presencia de células permisivas adicionales puede ser necesaria para una infección neuronal exitosa35. Los intentos que hicimos de infectar monocultivos de neuronas derivadas de hNSC no fueron positivos y, en consecuencia, desarrollamos un sistema de cocultivo con neuronas derivadas de hNSC y células epiteliales receptoras de SARS-CoV-2 (células A549-hACE2-TMPRSS2). Cultivamos estos cocultivos utilizando diodos axonales en dispositivos de microfluidos36 para evaluar la capacidad del SARS-CoV-2 para infectar neuronas y moverse dentro de los axones. En estos dispositivos, los cocultivos forman redes neuronales epiteliales en las cámaras izquierda y derecha del dispositivo (Fig. 4A, B), que están conectadas exclusivamente a través de un crecimiento unidireccional de axones desde la cámara izquierda hacia la derecha ( Figura 4C). Luego, la cámara derecha o izquierda de los dispositivos de microfluidos se infectó con el virus ancestral (Wuhan), el Wuhan/ΔORF7ab y los VoC Gamma, Delta y Omicron/BA.1. A 3 ppp, se detectaron células infectadas en las cámaras derecha e izquierda de todos los dispositivos, lo que demuestra que el virus viajó de la cámara derecha a la izquierda dentro de los axones (transporte axonal retrógrado; Fig. 4D, H y Fig. 6 complementaria). ), y de la cámara de izquierda a derecha dentro de los axones (transporte axonal anterógrado; Fig. 4I-M y Fig. Suplementaria 7). Para confirmar aún más la participación del transporte axonal del SARS-CoV-2, utilizamos ciliobrevina D, un inhibidor de la maquinaria de transporte citoplasmático de dineína que actúa sobre el transporte bidireccional de orgánulos a lo largo de los axones37. Cuando la infección se produjo en presencia de ciliobrevina D, se bloqueó el transporte retrógrado y no se observó ninguna célula infectada con SARS-CoV-2 en la cámara izquierda (Figura complementaria 8). Para cuantificar la llegada de partículas virales a través de los axones, infectamos dispositivos de microfluidos en condiciones retrógradas y anterógradas con los virus recombinantes que expresan nanoluciferasa Wuhan_nLuc, Wuhan/ΔORF7ab_nLuc y Delta_nLuc, y medimos la luminiscencia en los sobrenadantes diariamente (Suplementario). Figura 9). Se detectó actividad nLuc positiva en los sobrenadantes de todas las cámaras receptoras desde 1 ppp, aumentando progresivamente con el tiempo (Figura complementaria 9G, H), lo que indica movimiento retrógrado y anterógrado del SARS-CoV-2. Los valores de luminiscencia en las cámaras infectadas fueron constantes y en el límite máximo de detección (Figura complementaria 1).

Una vista esquemática de un diodo de axón en un dispositivo de microfluidos que contiene neuronas y células epiteliales en las cámaras izquierda y derecha. Las cámaras están conectadas exclusivamente por los axones de las neuronas cuyos cuerpos celulares se encuentran en la cámara izquierda. En este estudio, el SARS-CoV-2 se añadió en la cámara derecha (para evaluar el transporte axonal retrógrado) o en la cámara izquierda (para evaluar el transporte axonal anterógrado). B Vista de campo brillante de una red neuronal-epitelial que muestra el cocultivo neuronal y A549-ACE2-TMPRSS2 en ambas cámaras, separados por microcanales en forma de embudo (barra de escala = 200 µm). C Detalle de los axones positivos para β-tubulina III que cruzan los microcanales en forma de embudo y entran en la cámara derecha (barra de escala = 50 µm). Redes neuronales epiteliales infectadas en la cámara derecha con SARS-CoV-2 Wuhan (D), Wuhan/ΔORF7ab (E), Gamma (F), Delta (G) y Omicron/BA.1 (H) que muestran células infectadas en la cámaras izquierdas (barra de escala = 50 µm). Redes neuronales epiteliales infectadas en la cámara izquierda con SARS-CoV-2 Wuhan (I), Wuhan/ΔORF7ab (J), Gamma (K), Delta (L) y Omicron/BA.1 (M) que muestran células infectadas en las cámaras derechas (barra de escala = 50 µm). Hoechst: núcleos (azul). TUBB3: β-tubulina III (rojo). N: nucleocápside del SARS-CoV-2 (verde). Las zonas de rayas blancas y negras a la derecha (D – H) y a la izquierda (I – M) de las microfotografías representan los microcanales, a los que no se puede acceder durante las inmunotinciones. B–M Estas microfotografías son representativas de 3 experimentos independientes. Consulte las figuras complementarias. 6-9. El panel A fue creado con BioRender.com.

El neurotropismo del SARS-CoV-2 sigue siendo un tema de debate32. Si bien los estudios sobre infección natural en humanos e infección experimental en modelos animales informaron infección cerebral por SARS-CoV-214,38,39,40,41,42, incluidos modelos de infección humanos in vitro43,44,45, otros no lograron detectar SARS-CoV-2 en el tejido nervioso5,46. Esta inconsistencia puede deberse al momento de la infección, ya que en la mayoría de los casos las muestras disponibles son postmortales, y hemos demostrado, en el modelo de hámster, que el aislamiento viral depende del tiempo, encontrándose cargas virales más altas en el momento agudo. puntos14. A pesar de esta pregunta abierta, el impacto de la infección por SARS-CoV-2 en el cerebro es innegable2,47,48,49. La mayoría de estos datos publicados están relacionados con el SARS-CoV-2 original (Wuhan), sin embargo, hay menos información disponible sobre la neuropatogénesis de los VoC10. Aquí mostramos que todos los virus SARS-CoV-2 evaluados (Wuhan, Gamma, Delta y Omicron/BA.1), incluido el nuevo SARS-CoV-2 recombinante generado, son capaces de invadir el cerebro, probablemente a través de los nervios olfativos. y de promover la inflamación en el tejido nervioso.

A pesar de esta neuroinvasividad compartida a través de los bulbos olfatorios, el perfil de la enfermedad y las respuestas de las vías respiratorias dependen bastante de la variante del SARS-CoV-2. De hecho, demostramos que todos los VoC pueden infectar a los hámsteres dorados y promover la inflamación pulmonar, incluido Omicron/BA.1 de manera diferente a otros informes19,50, probablemente debido a dosis infecciosas o aislados virales. Se evidenció un “efecto variante” en la presentación clínica y en la inflamación relacionada con los tejidos, presentando la gravedad de la enfermedad el siguiente orden: SARS-CoV-2 Wuhan > Gamma > Delta > OmicronBA.1, lo que apoya la hipótesis de que Omicron/ La evolución de BA.1 ha resultado en un tropismo más restringido al tracto respiratorio superior, provocando así una enfermedad clínica menos grave10,51,52,53. Aunque con diferente gravedad, la neuroinvasividad, el neurotropismo y la neurovirulencia32 parecen ser características conservadas entre las variantes del SARS-CoV-2. De hecho, los datos presentados aquí respaldan la capacidad neuroinvasiva del SARS-CoV-2, ya que además de la detección del ARN viral y el aislamiento del virus infeccioso de los bulbos olfatorios, pudimos observar claramente las neuronas infectadas con el SARS-CoV-2 en el cerebro de hámsteres mediante microscopía de lámina óptica. Sin embargo, en hámsteres, a diferencia de lo informado en ratones K18-hACE2 cuyo patrón de expresión de ACE2 es no fisiológico y ectópico39, la detección de células infectadas por SARS-CoV-2 se restringió a los bulbos olfatorios, sin evidencia de remodelación de la vasculatura cerebral ni de virus. asociado a los vasos sanguíneos.

La infección del bulbo olfatorio es, por tanto, una característica común en el proceso infeccioso del SARS-CoV-2, independientemente de la variante considerada. También se observó una respuesta inflamatoria en este tejido, con una regulación positiva común del gen antiviral Mx2, independientemente de la VoC. La razón por la que algunos VoC no causan pérdida del olfato sigue siendo una cuestión abierta. La infección y la inflamación de los bulbos olfatorios, si están implicadas en la anosmia asociada al SARS-CoV-2, no parecen ser suficientes para provocar la pérdida del olfato en el hámster dorado. De hecho, es probable que las agresiones a la mucosa olfatoria, más que al bulbo olfatorio, sean los principales factores que contribuyen a la anosmia, ya que la recuperación de la anosmia se ha relacionado con la regeneración del epitelio olfatorio en hámsteres54,55. Además, cambios significativos en el epitelio olfatorio, como apoptosis, daños arquitectónicos, inflamación, regulación negativa de los receptores olfativos y cambios funcionales en las neuronas sensoriales olfatorias, también podrían contribuir, además de la infección per se, a la aparición de anosmia10,14. 56,57,58,59. Por lo tanto, parece que la infección y la inflamación de la mucosa olfatoria combinadas son necesarias para desencadenar la anosmia y, por lo tanto, la menor incidencia de anosmia observada después de la infección por algunas VoC está relacionada con niveles más bajos de inflamación.

Además, además de las mutaciones en la secuencia de picos en el genoma de las variantes del SARS-CoV-2, pueden estar presentes mutaciones adicionales en otras regiones del genoma viral, incluidas deleciones en las secuencias ORF7a y ORF7b27,28,29,30. ORF7a y ORF7b se han relacionado con la apoptosis inducida por virus y con la interferencia con la inmunidad innata y la respuesta antiviral22,23,24,60,61, sin ser, sin embargo, esenciales para la infección y replicación viral62,63. Además, ORF7b tiene el potencial de interferir con las proteínas de adhesión celular en la mucosa olfativa25 y, curiosamente, también se ha informado de una interacción binaria entre ORF7b y el receptor olfativo humano OR1D526. Por tanto, las deleciones o mutaciones en estas regiones pueden desempeñar un papel adicional en la inducción de alteraciones olfativas, al preservar la arquitectura y las estructuras del epitelio olfativo. Otro punto importante es que podemos observar un perfil clínico similar y una baja incidencia de alteraciones olfativas como SARS-CoV-2 Wuhan/ΔORF7ab simplemente reduciendo el inóculo viral de SARS-CoV-2 Wuhan. Independientemente de una evolución comparativa de la pérdida de peso corporal y de la puntuación clínica64, la anosmia fue menos frecuente en animales infectados con una dosis baja de SARS-CoV-2 Wuhan. Esto podría estar relacionado con la agresión inicial menos grave que sufre el epitelio olfatorio debido a dosis infecciosas más bajas55,65 y también puede explicar por qué otros estudios no detectaron disfunción olfativa a pesar de detectar cambios inflamatorios en el cerebro66.

Independientemente de la aparición o no de anosmia, el SARS-CoV-2 puede infectar las neuronas sensoriales olfativas y el bulbo olfatorio10,14, y aquí mostramos que el virus puede infectar neuronas y viajar dentro de los axones tanto en dirección retrógrada como anterógrada. Se planteó la hipótesis de que la neuroinvasión del SARS-CoV-2 se producía mediante transporte axonal a través de los nervios craneales (olfatorio, vago, trigémino) o por vía hematógena32,67,68. Los datos aquí presentados no apoyan la difusión hematógena del SARS-CoV-2 hacia el cerebro, pero corroboran la hipótesis de la vía olfatoria como portal de entrada preferencial hacia los bulbos olfatorios69. Por lo tanto, la infección cerebral a través de la vía olfativa parece una característica común de los coronavirus70,71, independientemente de la presentación clínica de la enfermedad. Finalmente, este estudio destaca que la neuroinvasión y la anosmia son, por tanto, fenómenos independientes tras la infección por SARS-CoV-2.

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con la legislación francesa y de conformidad con las Directivas del Consejo de las Comunidades Europeas (2010/63/UE, Ley francesa 2013-118, 6 de febrero de 2013) y de acuerdo con las regulaciones de los Comités de Cuidado de Animales del Institut Pasteur. El Comité de Ética de Experimentación Animal (CETEA 89) del Institut Pasteur aprobó este estudio (200023; APAFIS#25326-2020050617114340 v2) antes de que se iniciaran los experimentos. Los hámsteres fueron alojados en grupos de 4 animales en aisladores y manipulados en gabinetes de seguridad de clase III en las instalaciones para animales del Instituto Pasteur acreditadas por el Ministerio de Agricultura francés para realizar experimentos con roedores vivos. Todos los animales fueron manipulados estrictamente de acuerdo con las buenas prácticas animales.

El aislado BetaCoV/France/IDF00372/2020 (colección EVAg, Ref-SKU: 014V-03890) fue amablemente proporcionado por el Centro Nacional de Referencia de Virus Respiratorios alojado por el Instituto Pasteur (París, Francia) y dirigido por el Pr. Sylvie van der Werf. La muestra humana de la que procede la cepa hCoV-19/Japan/TY7-501/2021 (variante brasileña, JPN [P.1]) fue suministrada por el Instituto Nacional Japonés de Enfermedades Infecciosas (Tokio, Japón). El aislado SARS-CoV-2 Delta/2021/I7.2 200 (variante india, GISAID ID: EPI_ISL_2029113) y el aislado SARS-CoV-2 Omicron/B.1.1.529 (variante Omicron BA.1, GISAID ID: EPI_ISL_6794907 ) fueron amablemente proporcionados por la Unidad de Virus e Inmunidad del Institut Pasteur y dirigida por Olivier Schwartz72,73. Las reservas virales se produjeron en células Vero-E6 infectadas con una multiplicidad de infección de 1 × 10−4 UFP/célula. El virus se recogió 3 días después de la infección, se clarificó y luego se dividieron en alícuotas antes del almacenamiento a -80 °C. Las reservas virales se titularon en células Vero-E6 mediante ensayos de placa clásicos utilizando superposiciones semisólidas (Avicel, RC581-NFDR080I, DuPont)74.

Se obtuvieron virus recombinantes que expresan nanoluciferasa (nLuc) como gen indicador mediante genética inversa. Wuhan_nLuc se derivó del clon synSARS-CoV-2-GFP-P2A-ORF7a (clon n.º 41) generado como se describe75,76,77,78,79, donde el gen indicador GFP fue reemplazado por el nLuc. La estrategia de clonación se optimizó para construir un ADNc completo del virus Delta_nLuc en la misma columna vertebral que el aislado EPI_ISL_2029113. SARS-CoV-2 Wuhan/ΔORF7ab se obtuvo utilizando el mismo sistema genético inverso reemplazando la secuencia completa de ORF7ab por la de GFP o por nLuc (Wuhan/ΔORF7ab_nLuc).

El genoma viral se dividió en 11 fragmentos superpuestos de alrededor de 3 kb cada uno. Esos fragmentos y dos fragmentos que codifican diferentes genes de selección específicos de levadura (His3 y Leu2) se recombinaron en el plásmido centrómero de levadura pRS416 para generar el clon genómico completo del virus recombinante. El promotor T7 se colocó justo antes de la secuencia 5'UTR y se colocó un sitio de restricción único EAG1 justo después de la cola poli(A).

Los fragmentos virales se obtuvieron mediante RT-PCR en ARN extraído de células Vero-E6 infectadas por Delta usando SuperScript IV VILO Master Mix (11756050, Thermofisher) de acuerdo con el protocolo del fabricante, o usando genes sintéticos (GeneArt, Life Technologies). Todas las amplificaciones por PCR se realizaron utilizando ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion™ (F530, Thermofisher). El producto de la PCR se clonó en el vector Topo-TA y sus secuencias se controlaron mediante secuenciación de Sanger. El gen nLuc se insertó en ORF7a aguas arriba y se separó de él usando un conector GSG y una secuencia peptídica P2A para mediar en la escisión entre el indicador y la proteína viral. Fue sintetizado directamente en el fragmento F10-1.

La recombinación de los 4 fragmentos específicos de levadura y los 11 fragmentos virales se realizó en S. cerevisiae BY4741. Se realizó un cultivo de levadura a partir de un precultivo durante una noche en medio YPDA (2 mL de precultivo en 50 mL de medio YPDA calentado a 30 °C) hasta alcanzar la fase de crecimiento exponencial, con una densidad óptica correspondiente a aproximadamente 108 células/mL. Las levaduras se cosecharon mediante centrifugación de 50 mL de cultivo (3000 × g a 4 °C durante 5 min) antes de ser lavadas por primera vez en solución estéril de Tris-EDTA y Acetato de Litio TE/LiAc (Tris-HCl pH 7,5 10 mM). ; EDTA pH 7,5 0,1 mM; LiAc 100 mM). Las células se resuspendieron en 500 µl de solución TE/LiAc (2,109 células/ml). Luego la suspensión de levadura se incubó a 30 °C sin agitación durante 30 min. Durante este tiempo se preparó una mezcla de todos los fragmentos de ADN en proporción equimolar. Para cada condición de recombinación, se resuspendieron 50 µl de células competentes (108 células) en un volumen final de 300 µl de solución de TE/LiAc/PEG (Tris-HCl 100 mM, pH 8; acetato de litio 100 mM; PEG 3350 al 40 % v/v). ) con la mezcla de ADN a recombinar y 50 μg de ADN de esperma de salmón desnaturalizado (31149, Sigma) y luego se enfrió en hielo durante 5 min. La mezcla se incubó a 30 °C durante 30 min sin agitación antes de sufrir un choque térmico a 42 °C durante 20 min. Después de enfriar en hielo, las levaduras se sedimentaron mediante centrifugación a 500 × g a temperatura ambiente durante 5 minutos y luego se resuspendieron y se incubaron con 500 μl de CaCl2 5 mM a temperatura ambiente durante 10 minutos. CaCl2 se lavó mediante centrifugación a 500 × g a temperatura ambiente durante 5 min y las células se resuspendieron en 200 μL de agua estéril antes de sembrarlas en medio mínimo sintético selectivo que carecía de histidina, uracilo y leucina (SD-His-Ura-Leu-), y Se incubaron a 30°C durante 3 días. Para cada transformación, se comprobaron diez clones diferentes mediante PCR múltiple (206143, Qiagen) en preparaciones rápidas de ADN realizadas mediante la técnica Chellex como ya se describió75 utilizando cebadores específicos (Tabla complementaria 1) para controlar la presencia de los diferentes fragmentos en la orientación esperada. . La colonia de levadura de interés se subcultivó en 200 ml de medio SD-His-Ura-Leu- y el plásmido se extrajo utilizando el kit de preparación midi de Qiagen (12143, Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante.

El plásmido se linealizó mediante digestión con EagI-HF (R3505, NEB), se purificó mediante un proceso de cloroformo con fenol y se transcribió in vitro en ARN utilizando el sistema de producción de ARN a gran escala T7 RiboMaxTM (P1300, Promega) y el m7G(5')ppp( Kits de análogos de estructura de tapa de ARN 5')G (#S1411, NEB). Se usaron aproximadamente 5 µg de ADN lineal como plantilla en un volumen de reacción de 50 µl que comprendía: 10 µl de tampón de transcripción 5X T7; 5 μL de estructura análoga de tapa de ARN m7G(50)ppp(50)G a 30 mM; 0,75 l de GTP 100 mM; 3,75 μL de cada nucleótido tipo ATP, CTP; UTP de 100 mM; y 5 μL de enzima ARN polimerasa RNasin T7. La reacción se incubó a 30 °C durante 3 h y luego el ADN molde se digirió a 37 °C durante 20 min añadiendo 2 μL de la enzima RQ1 RNase free DNase. El ARN sintetizado finalmente se purificó utilizando un método clásico de fenol cloroformo y se precipitó. Se electroporaron doce μg de ARNm viral completo y 4 μg de plásmido que codifica el gen de la nucleoproteína viral (N) en 8 × 106 células Vero-E6 resuspendidas en 0,8 ml de solución de electroporación Mirus Bio™ Ingenio™ (MIR50114) utilizando la electroporación Gene Pulser Xcell. Sistema (1652660, Biorad) con pulso de 270 V y 950 μF. Luego, las células se transfirieron a un matraz de cultivo T75 con 15 ml de DMEM suplementado con FCS al 2 % (v/v). Las células electroporadas se incubaron a 37 °C, 5% de CO2 durante varios días hasta que se observó el efecto citopático (CPE). Luego, el sobrenadante se recogió, se repartió en alícuotas y se congeló a -80 °C hasta la titulación. La secuencia viral fue controlada por NGS.

Se utilizaron células Vero-E6 (ATCC CRL-1586) para evaluar la cinética de replicación de diferentes variantes del SARS-CoV-2 y virus recombinantes. Las células se mantuvieron en medio de cultivo modificado de Dulbecco (DMEM, 31966-021, Gibco) suplementado con suero fetal de ternera al 5%, a 37 °C en CO2 al 5%. El día antes de la infección, se sembraron 1 x 106 células VeroE6/pocillo en placas de 6 pocillos. El día de la infección, las células se infectaron con el virus SARS-CoV-2 con una multiplicidad de infección (MOI) de 0,01, por triplicado independiente, y se incubaron durante las 24, 48 o 72 horas posteriores a la infección. Los sobrenadantes se recogieron en cada momento y se congelaron a -80 °C. Los títulos virales se obtuvieron mediante el método clásico TCID50 en células Vero-E6 después de 72 horas después de la infección80.

Se compraron hámsteres sirios dorados machos (Mesocricetus auratus; RjHan:AURA) de 5 a 6 semanas de edad (peso promedio de 60 a 80 gramos) de Janvier Laboratories y se manipularon en condiciones específicas libres de patógenos. Los animales fueron alojados y manipulados en aisladores en una instalación de nivel 3 de bioseguridad, con acceso ad libitum a agua y alimento. Antes de cualquier manipulación, los animales pasaron por un período de aclimatación de una semana. Los animales se anestesiaron con una inyección intraperitoneal de 200 mg/kg de ketamina (Imalgène 1000, Merial) y 10 mg/kg de xilazina (Rompun, Bayer), y 100 µL de solución fisiológica que contenía 6 × 104 UFP de SARS-CoV-2 (salvaje). -tipo o recombinante) se administró por vía intranasal a cada animal (50 µl/fosa nasal). Los animales infectados simuladamente recibieron únicamente la solución fisiológica. Los hámsteres infectados y simulados se alojaron en aisladores separados y se les hizo un seguimiento diario durante cuatro días en los que se anotó el peso corporal y la puntuación clínica. La puntuación clínica se basó en una escala acumulativa de 0 a 4: pelaje erizado, movimientos lentos, apatía, ausencia de actividad exploratoria. El día 3 posterior a la infección (dpi), los animales se sometieron a una prueba de búsqueda de alimento para evaluar el olfato como se describió anteriormente14,81. Brevemente, 24 horas antes de la prueba, los hámsteres se dejaron en ayunas y luego se colocaron individualmente en una jaula nueva (37 × 29 × 18 cm) con ropa de cama estándar limpia durante 10 minutos. Posteriormente, se colocaron los hámsteres en otra jaula similar durante 2 minutos y se escondieron aproximadamente 5 trozos de cereales en un lecho de 1,5 cm en una esquina de la jaula de prueba. Luego, los hámsteres evaluados se colocaron en la esquina opuesta y se registró la latencia para encontrar la comida (definida como el tiempo para localizar los cereales y comenzar a cavar) utilizando un cronómetro. La prueba se llevó a cabo durante un período de 15 min. Tan pronto como se descubrió la comida, se sacó a los hámsteres de la jaula. Un minuto más tarde, los hámsteres realizaron la misma prueba pero con cereales de chocolate visibles, colocados sobre la ropa de cama. Las pruebas se realizaron en aisladores de una instalación de nivel 3 de Bioseguridad especialmente equipada para ello. A los 4 ppp, los animales fueron sacrificados con un exceso de anestésicos (ketamina y xilazina) y desangrados82, y se recogieron muestras de cornetes nasales, pulmones y bulbos olfatorios que se congelaron inmediatamente a -80 °C. También se recogieron fragmentos de pulmones y se fijaron en formalina tamponada neutra al 10%.

Se pesaron y homogeneizaron fragmentos de pulmón congelados, cornetes nasales y bulbos olfatorios con 1 ml de DMEM helado suplementado con penicilina/estreptomicina al 1 % (15140148, Thermo Fisher) en tubos Lysing Matrix M de 2 ml (116923050-CF, MP Biomedicals) utilizando el sistema FastPrep-24™ (MP Biomedicals), y el siguiente esquema: homogeneización a 4,0 m/s durante 20 seg, incubación a 4 °C durante 2 min, y nueva homogeneización a 4,0 m/s durante 20 seg. Los tubos se centrifugaron a 10.000 x g durante 2 minutos a 4 °C y se recogieron los sobrenadantes. Los títulos virales se obtuvieron mediante el método clásico TCID50 en células Vero-E6 después de 72 horas después de la infección80. Las cargas de ARN viral se obtuvieron mediante la cuantificación del ARN genómico y subgenómico del SARS-CoV-2 basado en el gen E83. Brevemente, se homogeneizaron 125 µl de los sobrenadantes con 375 µl de Trizol LS (10296028, Invitrogen) y se extrajo el ARN total utilizando el kit Direct-zol RNA MicroPrep (R2062, Zymo Research: cornetes nasales y bulbos olfatorios) o el kit MiniPrep (R2052 , Zymo Research: pulmón). Utilizamos la qRT-PCR de un solo paso Taqman (Invitrogen 11732-020) en un volumen final de 12,5 μL por reacción en placas de PCR de 384 pocillos utilizando un termociclador (QuantStudio 6 Flex, Applied Biosystems). Brevemente, se agregaron 2,5 µL de ARN a 10 µL de una mezcla maestra que contenía 6,25 µL de mezcla de reacción 2X, 0,2 µL de MgSO4 (50 mM), 0,5 µL de Superscript III RT/Platinum Taq Mix (2 UI/ µL) y 3,05 µL de mezcla maestra. μL de agua libre de nucleasas que contiene 400 nM de cebadores y 200 nM de sonda. Para detectar el ARN genómico, utilizamos los cebadores y la sonda E_sarbeco (E_Sarbeco_F1 5′-ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT-3'; E_Sarbeco_R2 5′-ATATTGCAGCAGTACCGCACACA-3'; E_Sarbeco_Probe FAM-5′-ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG-3'-TAMRA). La detección del ARN subgenómico del SARS-CoV-2 se logró reemplazando el cebador E_Sarbeco_F1 por el cebador CoV2sgLead (CoV2sgLead-Fw 5′-CGATCTCTTGTAGATCTGTTCTC-3'). Se encargó a Thermo Fisher Scientific un gen sintético que codifica las secuencias objetivo de la PCR. Se amplificó un producto de PCR utilizando ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion™ (Thermo Fisher Scientific) y se transcribió in vitro mediante el kit Ribomax T7 (Promega). El ARN se cuantificó utilizando el kit Qubit RNA HS Assay (Thermo Fisher Scientific), se normalizó y se usó como estándar para cuantificar el número absoluto de copias de ARN. Las condiciones de amplificación fueron las siguientes: 55 °C por 20 min, 95 °C por 3 minutos, 50 ciclos de 95 °C por 15 s y 58 °C por 30 s; seguido de 40 °C durante 30 s.

Las preparaciones de ARN de pulmones, cornetes nasales y bulbos olfatorios recolectadas a 4 ppp se sometieron a RT-qPCR. Brevemente, el ARN se transcribió de forma inversa al ADNc de la primera cadena utilizando SuperScript™ IV VILO™ Master Mix (11766050, Invitrogen). La qPCR se realizó en un volumen final de 10 μL por reacción en placas de PCR de 384 pocillos utilizando un termociclador (QuantStudio 6 Flex, Applied Biosystems) y su software relacionado (QuantStudio Real-time PCR System, v.1.2, Applied Biosystems). Brevemente, se agregaron 2,5 μl de ADNc (12,5 ng) a 5 μl de mezcla maestra Taqman Fast Advanced (444457, Applied Biosystems) y 2,5 μl de agua libre de nucleasas que contenía pares de cebadores de hámster dorado (Tabla complementaria 2). Las condiciones de amplificación fueron las siguientes: 95 °C por 20 s, y 45 ciclos de 95 °C por 1 s y 60 °C por 20 s. Se utilizaron como referencia los genes γ-actina y Hprt (hipoxantina fosforribosil-transferasa). Las variaciones en la expresión génica se calcularon como el cambio de n veces en la expresión en los tejidos de los hámsteres infectados en comparación con los tejidos del grupo infectado simuladamente utilizando el método 2-ΔΔCt84.

Para iDISCO+, se infectaron tres hámsteres machos y tres hembras con 6×104 UFP de SARS-CoV-2 Wuhan y se les realizó un seguimiento como se describe anteriormente. A los 4 dpi, los animales fueron anestesiados con una inyección intraperitoneal de ketamina (200 mg/kg; Imalgène 1000, Merial) y xilazina (10 mg/kg; Rompun, Bayer), y realizamos una perfusión transcardial con DPBS que contenía heparina (5 × 103 U/mL) seguido de formaldehído tamponado neutro al 4%. Las cabezas enteras se recogieron y almacenaron en formaldehído tamponado neutro al 4% durante una semana antes del análisis. La nucleocápside del SARS-CoV-2 se detectó en su totalidad en el hocico y el cerebro de hámsteres infectados utilizando el protocolo iDISCO+ publicado previamente85 con modificaciones mínimas. Todos los tampones se complementaron con 0,01% de azida sódica (Sigma-Aldrich). El hocico, que contiene la mucosa olfatoria y el nervio olfatorio, y el cerebro se diseccionaron y procesaron por separado para optimizar la manipulación del tejido.

Todas las muestras se deshidrataron primero en metanol (Sigma-Aldrich) utilizando diluciones del 20-40-60-80-100-100% en agua destilada (de 1 a 2 horas cada concentración). La eliminación de lípidos complejos se logró incubando las muestras en una mezcla 2:1 de diclorometano (Sigma-Aldrich) y metanol durante la noche. Luego las muestras se lavaron dos veces en metanol al 100% y se blanquearon durante la noche usando una solución de H2O2 al 5% en metanol. Luego todas las muestras se rehidrataron usando una serie de metanol (80-60-40-20%). Para aumentar la permeabilidad ósea, los hocicos se descalcificaron mediante incubación en solución de Morse (ácido fórmico al 45% y citrato de sodio al 20%). Finalmente, todas las muestras (cerebros y hocicos) se lavaron en PBS, luego en PBS-T (PBS con 0,2% Triton X-100 [Sigma-Aldrich]) y se incubaron en tampón de permeabilización (20% DMSO [Sigma-Aldrich] y 2,3% de glicina [Sigma-Aldrich] en PBS-T) a 37 °C durante la noche. Antes de la inmunotinción, las muestras se bloquearon (gelatina al 0,2% [Sigma-Aldrich] en PBS-T) a 37 °C durante 24 h. Para revelar el SARS-CoV-2 y la vasculatura, se combinaron tres anticuerpos primarios: anticuerpo de nucleocápside anti-SARS CoV2 de conejo (GTX135357, GeneTex) diluido 1:1000; Anti-CD31 de cabra (AF3628, R&D Systems) diluido 1:300; y antipodocalixina de rata (MAB1556, R&D Systems) diluida 1:1000. Después de una incubación de 2 semanas en anticuerpo primario, las muestras se lavaron (PBS suplementado con 0,2% de tween-20 [Sigma-Aldrich] y 2 U/mL de heparina [Sigma-Aldrich]) y se incubaron 10 días con el siguiente anticuerpo secundario. Anticuerpos: burro anti-conejo Alexa 555 (A-31572, Thermo Fisher Scientific), burro anti-cabra Alexa 647 (A-21447, Thermo Fisher Scientific) y pollo anti-rata Alexa 647 (A-21472, Thermo Fisher Scientific) todos diluido a 1:500. Todos los anticuerpos se diluyeron en una solución de bloqueo y se incubaron a 37 °C agitando suavemente. Después de la inmunotinción, las muestras se lavaron, se deshidrataron en metanol (20-40-60-80-100-100%), se incubaron durante 3 h en una mezcla 2:1 de diclorometano y metanol, se lavaron dos veces (15 min cada una) en diclorometano. 100% y se aclaró por inmersión en éter dibencílico.

Se tomaron imágenes de muestras de cerebro y hocico utilizando un LaVision Ultramicroscope II equipado con objetivos corregidos al infinito, líneas láser OBIS-561nm 100 mW y OBIS-639nm 70 mW, y filtros 595/40 y 680/30 para Alexa 555 y Alexa 647 respectivamente. Se tomaron imágenes de los bulbos olfatorios con un objetivo de 4 × 0,35 NA, utilizando un láser NA de 0,3 y un tamaño de paso de 2 µm obteniendo imágenes con una resolución de 1,63 × 1,63 × 2 µm/píxel. Se tomaron imágenes de los hocicos con un objetivo de 1,3X, ajustando el láser NA a 0,3 y un tamaño de paso de 5 µm obteniendo imágenes con una resolución de 5 × 5 × 5 µm/píxel. Todas las adquisiciones se realizaron con el software ImSpector (v.7.0.127.0, Lavision Biotec GmbH). Las pilas 3D obtenidas se analizaron utilizando Bitplane Imaris 9.2 (instrumentos Oxford).

A 4 ppp, los animales infectados con SARS-CoV-2/Wuhan_nLuc, Wuhan/ΔORF7ab_nLuc y SARS-CoV-2/Delta_nLuc fueron anestesiados con una inyección intraperitoneal de ketamina (200 mg/kg; Imalgène 1000, Merial) y xilacina (10 mg /kg; Rompun, Bayer). A continuación, se inyectaron interperitonealmente 0,45 µmoles del sustrato nLuc (sustrato in vivo Nano-Glo®, CS320501, Promega) fluorofurimazina (FFz) y los animales se colocaron en una caja de confinamiento y se tomaron imágenes utilizando un sistema de imágenes in vivo IVIS® Spectrum (PerkinElmer ) dentro de los 5 minutos posteriores a la inyección de FFz. Se registraron imágenes de bioluminiscencia bidimensionales y se cuantificó la emisión de fotones (p/s/cm2/sr) en una región de interés definida utilizando el software Living Image (v. 4.7.4, PerkinElmer). Después de obtener imágenes in vivo, se sacrificó a los animales, se recogieron los pulmones y los cerebros y se colocaron rápidamente en una placa de seis pocillos. Las placas se colocaron en una caja de confinamiento y se tomaron imágenes como se describe anteriormente.

Los fragmentos de pulmón fijados durante 7 días en formalina tamponada neutra al 10% se incluyeron en parafina. Se cortaron secciones de cuatro µm de espesor y se tiñeron con tinción con hematoxilina y eosina. La IHC se realizó en Leica Bond RX utilizando un anticuerpo antiproteína de la nucleocápsida del SARS (1:500, NB100-56576, Novus Biologicals) y un anticuerpo secundario Ig anti-conejo de cabra biotinilado (1:600, E0432, Dako, Agilent). Luego, las diapositivas se escanearon utilizando el escáner de diapositivas Axioscan Z1 (Zeiss) y las imágenes se analizaron con el software Zen 2.6 (Zeiss).

Las células madre neurales humanas (hNSC, ENStem-A, SCC003, EMD-Millipore) se mantuvieron en placas de 6 pocillos recubiertas con geltrex (A1413302, Gibco) en una densidad de 4,5 x 105 células/cm2 en CTS Knock-out DMEM/F12. medio (A1370801, Gibco) suplementado con suplemento neural StemPro al 2 % (A1050801, Gibco), glutamax 2 mM (35050038, Gibco), FGFb 20 ng/ml (PHG0026, Gibco) y EGF 20 ng/ml (PHG0311, Gibco) en 37 °C en 5% de CO2. Las células A549-ACE2-TMPRSS2 (proporcionadas amablemente por el Pr. Olivier Schwartz, Institut Pasteur) se mantuvieron en medio F12K Nut Mix (21127022, Gibco) suplementado con suero de ternera bovino al 10 % y 10 µg/ml de blasticidina (12172530, Gibco) a 37 °C en 5% CO2. Para generar las redes neuronales epiteliales, utilizamos chips de microfluidos adquiridos en MicroBrain Biotech (Brainies™, Cat#: MBBT5; Marly le Roi, Francia). Brainies™ MBBT5 es un chip que contiene 4 diodos neuronales. Un diodo neuronal incluye 2 cámaras de cultivo rectangulares (volumen ~1 µL), cada una conectada a 2 depósitos y separadas por una serie de microcanales asimétricos de 500 µm de largo (3 µm de alto, que se estrechan de 15 µm a 3 µm)36. Brainies™ se recubrieron con poli-L-ornitina (P4957, Sigma-Aldrich) y laminina (L2020, Sigma-Aldrich) y se sembraron 1 x 105 hNSC en las cámaras derecha e izquierda y se incubaron a 37 °C en 5 %. CO2 durante 24 horas. Luego, el medio se reemplazó por un medio de diferenciación neuronal compuesto de medio neurobasal (10888022, Gibco) suplementado con un suplemento de B27 al 2 % (17504044, Gibco), un suplemento de CultureOne al 1 % (A3320201, Gibco), glutamax 2 mM (35050038, Gibco), y ácido ascórbico 200 µM (A4403, Sigma Aldrich) y se incubaron a 37 °C en CO2 al 5% durante 14 días, reemplazando la mitad del medio cada dos días. Finalmente, se agregaron 2 × 104 células A549-ACE2-TMPRSS2 sobre las neuronas en las cámaras derecha e izquierda en medio de diferenciación neuronal a 37 ° C en CO2 al 5% durante 48 horas. Para evaluar el movimiento axonal retrógrado del SARS-CoV-2, las cámaras derechas se infectaron con una MOI de 1 de SARS-CoV-2 Wuhan, Wuhan/ΔORF7ab, Gamma, Delta u Omicron/BA.1 y se incubaron a 37 °. C en 5% CO2 durante 72 horas. Para evaluar el movimiento axonal anterógrado del SARS-CoV-2, se infectaron las cámaras izquierdas en las mismas condiciones mencionadas anteriormente. Para evitar la difusión pasiva de los conjuntos, se aplicó presión hidrostática agregando un exceso de medio en los depósitos de las cámaras receptoras86. Para bloquear el transporte retrógrado axonal, se agregaron 100 µM de ciliobrevina D (250401, Calbiochem) al medio durante la infección y durante todo el período de incubación. Luego, las células se fijaron con PFA al 4% (15444459, Thermo Scientific), se lavaron en PBS, se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,5% durante 10 minutos, se lavaron una vez en PBS y se bloquearon con suero de cabra normal al 10% (10000 C, Invitrogen). durante 30 minutos seguido de una incubación durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios: anticuerpo anti-β-tubulina III (neuronal) de ratón (1:1000, T8578, Sigma-Aldrich) y anticuerpo de nucleocápside anti-SARS-CoV-2 de conejo (1:1000, T8578, Sigma-Aldrich) :1000, GTX135361, GeneTex). Luego, las células se lavaron en PBS y se incubaron con los siguientes anticuerpos secundarios: AlexaFluor 647 anti-ratón de cabra (1:1000, A21235, Invitrogen) y AlexaFluor 546 anti-conejo de cabra (1:1000, A11035, Invitrogen) durante 2 horas a 4°C. Luego se lavaron las células, se tiñeron los núcleos con Hoechst 33342 20 µM (62249, Thermo Scientific) y se almacenaron en PBS. Las imágenes se obtuvieron utilizando el sistema de imágenes de células EVOS FL (Thermo Scientific) con objetivos de 10x o 20x y los cubos de fluorescencia DAPI, RFP y CY5.5. Utilizando el mismo método descrito, las redes neuronales epiteliales en dispositivos de microfluidos también se infectaron con los virus recombinantes Wuhan_nLuc, Wuhan/ΔORF7ab_nLuc y Delta_nLuc a una MOI de 0,5 (limitación de volumen máxima debido al título viral stock). La actividad nanoluciferasa en los sobrenadantes se evaluó secuencialmente a 1, 2 y 3 ppp. Brevemente, se mezclaron 20 µL de sobrenadante con 20 µL de sustrato nLuc (N1110, Promega) en una placa blanca de 96 pocillos y la luminiscencia, expresada como Unidad de luz relativa (RLU), se adquirió durante 100 ms utilizando el lector de placas VICTOR Nivo. y el software de control Victor Nivo (v.4.0.7, Perkin Elmer).

El análisis estadístico se realizó utilizando Prism 9 (GraphPad, versión 9.5.1, San Diego, EE. UU.), considerándose significativo p < 0,05. Los datos cuantitativos se compararon entre grupos mediante la prueba de rango logarítmico, la prueba de Mann-Whitney de dos colas o la prueba de Kruskal-Wallis seguida de la prueba de comparaciones múltiples de Dunn. Se lograron análisis estadísticos multivariados sobre parámetros clínicos y sobre inflamación tisular mediante el Análisis de Componentes Principales. La aleatorización y el cegamiento no fueron posibles debido a condiciones de alojamiento predefinidas (aisladores separados entre animales infectados y no infectados). Los análisis ex vivo e in vitro fueron cegados (muestras codificadas). Para los experimentos in vivo se realizaron 2 réplicas independientes con 4 animales cada una; para experimentos in vitro se realizaron 3 réplicas independientes.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Todos los datos relevantes que respaldan los hallazgos clave de este estudio están disponibles en el manuscrito principal y su información complementaria. Los datos originales se proporcionan con este documento.

OMS. Panel de control de la OMS sobre la enfermedad por coronavirus (COVID-19). https://covid19.who.int/ (2022).

Paterson, RW y cols. El espectro emergente de la neurología COVID-19: hallazgos clínicos, radiológicos y de laboratorio. Cerebro: un J. Neurol. 143, 3104–3120 (2020).

Artículo de Google Scholar

Chou, tímido. et al. Incidencia global de manifestaciones neurológicas entre pacientes hospitalizados con COVID-19: informe para el consorcio GCS-NeuroCOVID y el consorcio ENERGY. Red JAMA. Abierto 4, e2112131 (2021).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Klimek, L. y col. Trastornos olfativos y gustativos en COVID-19. Alergia. J. Int. 31, 243–250 (2022).

Thakur, KT y cols. Neuropatología de COVID-19 en el Centro Médico Irving de la Universidad de Columbia/Hospital Presbiteriano de Nueva York. Cerebro: un J. Neurol. 144, 2696–2708 (2021).

Artículo de Google Scholar

Ruz-Caracuel, I. et al. Hallazgos neuropatológicos en COVID-19 fatal y sus manifestaciones clínicas neurológicas asociadas. Patología 54, 738–745 (2022).

Christensen, PA y cols. Señales de un avance de la vacuna significativamente mayor, menores tasas de hospitalización y una enfermedad menos grave en pacientes con enfermedad por coronavirus 2019 causada por la variante Omicron del síndrome respiratorio agudo severo por coronavirus 2 en Houston, Texas. Soy. J. Pathol. 192, 642–652 (2022).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Garrett, N. y col. Alta tasa de transporte asintomático asociado con la variante Omicron. medRxiv, 2021.2012.2020.21268130 (2022).

Vihta, K.-D. et al. Cambios asociados a Omicron en los síntomas del SARS-CoV-2 en el Reino Unido. Clínico. Infectar. Dis. 76, e133-e141 (2023).

Chen, M. y col. Evolución de las características de la infección nasal y olfativa de las variantes del SARS-CoV-2. bioRxiv, 2022.2004.2012.487379 (2022).

Boscolo-Rizzo, P. et al. Deterioro del olfato y el gusto relacionado con la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19) con difusión generalizada de la variante Omicron del síndrome respiratorio agudo severo-coronavirus-2 (SARS-CoV-2). En t. Foro Alerg. Rinol. 12, 1273–1281 (2022).

Cardoso, CC et al. Disfunción olfativa en pacientes con COVID-19 leve durante las ondas gamma, delta y ómicrón en Río de Janeiro, Brasil. JAMA 328, 582–583 (2022).

Butowt, R., Bilińska, K. y von Bartheld, C. ¿Por qué la variante Omicron ahorra en gran medida la función olfativa? Implicaciones para la patogénesis de la anosmia en la enfermedad por coronavirus 2019. J. Infect. Dis. 226, 1304–1308 (2022).

de Melo, GD et al. La anosmia relacionada con la COVID-19 se asocia con la persistencia viral y la inflamación en el epitelio olfativo humano y con la infección cerebral en los hámsteres. Ciencia. Traducción Medicina. 13, eabf8396 (2021).

Artículo PubMed Google Scholar

Chan, JF y cols. Simulación de las manifestaciones clínicas y patológicas de la enfermedad del coronavirus 2019 (COVID-19) en el modelo de hámster sirio dorado: implicaciones para la patogénesis y transmisibilidad de la enfermedad. Clínico. Infectar. Dis. 71, 2428–2446 (2020).

Sia, SF y cols. Patogenia y transmisión del SARS-CoV-2 en hámsteres dorados. Naturaleza 583, 834–838 (2020).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Käufer, C. y col. La microgliosis y la proteinopatía neuronal en el cerebro persisten más allá de la eliminación viral en el modelo de hámster SARS-CoV-2. eBioMedicina 79, 103999 (2022).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Bauer, L. y col. Diferencias en neuroinflamación en el bulbo olfatorio entre las variantes D614G, Delta y Omicron BA.1 SARS-CoV-2 en el modelo de hámster. bioRxiv, 2022.2003.2024.485596 (2022).

Halfmann, PJ y cols. El virus SARS-CoV-2 Omicron causa enfermedad atenuada en ratones y hámsteres. Naturaleza 603, 687–692 (2022).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mohandas, S. y col. Patogenicidad de la variante Omicron (R346K) del SARS-CoV-2 en hámsteres sirios y su neutralización cruzada con diferentes variantes preocupantes. eBioMedicina 79, 103997 (2022).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

McMahan, K. y col. Patogenicidad reducida de la variante omicrón del SARS-CoV-2 en hámsteres. Med 3, 262–268.e264 (2022).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Hayn, M. y col. El análisis funcional sistemático de las proteínas del SARS-CoV-2 descubre antagonistas inmunes innatos virales y vulnerabilidades restantes. Rep. celular 35, 109126 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Aliyari, SR y cols. La danza evolutiva entre las vías antivirales del huésped innato y el SARS-CoV-2. Patógenos 11, 538 (2022).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Su, C.-M., Wang, L. y Yoo, D. Activación de NF-κB e inducción de expresiones de citoquinas proinflamatorias mediadas por la proteína ORF7a del SARS-CoV-2. Ciencia. Rep. 11, 13464 (2021).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Fogeron, M.-L. et al. SARS-CoV-2 ORF7b: ¿es un homólogo de proteína del virus del murciélago una causa importante de los síntomas de COVID-19? bioRxiv, 2021.2002.2005.428650 (2021).

Kim, D.-K. et al. Un mapa a escala de proteoma del contactoma humano SARS-CoV-2. Nat. Biotecnología. 41, 140-149 (2023).

Mazur-Panasiuk, N. et al. Expansión de una variante Delta del SARS-CoV-2 con una deleción de 872 nt que abarca ORF7a, ORF7b y ORF8, Polonia, julio a agosto de 2021. Eur. Vigilar. 26, 2100902 (2021).

Artículo CAS Google Scholar

Panzera, Y. et al. Una deleción en el ORF7 del SARS-CoV-2 identificada en el brote de COVID-19 en Uruguay. Transfronterizo. Emergente. Dis. 68, 3075–3082 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gelatina, L. y col. Epidemiología genómica de Delta SARS-CoV-2 durante la transición de la eliminación a la supresión en Aotearoa Nueva Zelanda. Nat. Comunitario. 13, 4035 (2022).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pyke, AT y cols. Cinética de replicación de las variantes preocupantes del SARS-CoV-2 B.1.351 y B.1.1.7, incluida la evaluación de un mutante B.1.1.7 que porta un gen ORF7a defectuoso. Virus 13, 1087 (2021).

Renier, N. y col. iDISCO: un método simple y rápido para inmunomarcar muestras de tejido grandes para imágenes de volumen. Celda 159, 896–910 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Bauer, L. y col. La neuroinvasividad, el neurotropismo y la neurovirulencia del SARS-CoV-2. Tendencias Neurociencias. 45, 358–368 (2022).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chen, S. y col. La infección por SARS-CoV-2 provoca senescencia de las neuronas dopaminérgicas. Res Sq versión 1 (2021).

Bauer, L. y col. Cinética de replicación, tropismo celular y respuestas inmunitarias asociadas en modelos neuronales derivados de células madre pluripotentes inducidas por los virus SARS-CoV-2 y H5N1 humanos. mSphere 6, e00270–00221 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pepe, A., Pietropaoli, S., Vos, M., Barba-Spaeth, G. y Zurzolo, C. Los nanotubos de túneles proporcionan una ruta para la propagación del SARS-CoV-2. Ciencia. Adv. 8, eabo0171 (2022).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Peyrin, J.-M. et al. Diodos axónicos para la reconstrucción de redes neuronales orientadas en cámaras de microfluidos. Laboratorio de un chip 11, 3663–3673 (2011).

Artículo CAS Google Scholar

Sainath, R. & Gallo, G. El inhibidor de dineína Ciliobrevin D inhibe el transporte bidireccional de orgánulos a lo largo de los axones sensoriales y altera la regulación mediada por NGF de los conos de crecimiento y las ramas de los axones. Desarrollo. Neurobiol. 75, 757–777 (2015).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Matschke, J. y col. Neuropatología de pacientes con COVID-19 en Alemania: una serie de casos post-mortem. Lanceta Neurol. 19, 919–929 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Canción, E. et al. Neuroinvasión del SARS-CoV-2 en cerebro humano y de ratón. J. Exp. Medicina. 218, e20202135 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Meinhardt, J. y col. Invasión transmucosa olfativa del SARS-CoV-2 como puerto de entrada al sistema nervioso central en pacientes con COVID-19. Nat. Neurociencias. 24, 168-175 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Rutkai, I. et al. Neuropatología y virus en el cerebro de primates no humanos infectados con SARS-CoV-2. Nat. Comunitario. 13, 1745 (2022).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ferrén, M. et al. Modelado organotípico de hámster de la infección pulmonar y del tronco encefálico por SARS-CoV-2. Nat. Comunitario. 12, 5809 (2021).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pellegrini, L. et al. El SARS-CoV-2 infecta el plexo coroideo cerebral y altera la barrera sangre-LCR en los organoides del cerebro humano. Célula madre celular 27, 951–961.e955 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ramani, A. y col. El SARS-CoV-2 se dirige a las neuronas de los organoides cerebrales humanos tridimensionales. EMBO J. 39, e106230 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kong, W. y col. La neuropilina-1 media la infección de astrocitos en organoides cerebrales por SARS-CoV-2, lo que induce inflamación que conduce a disfunción y muerte de neuronas. mBio 13, e0230822 (2022).

Artículo PubMed Google Scholar

Khan, M. y col. Visualizar en pacientes fallecidos con COVID-19 cómo el SARS-CoV-2 ataca las mucosas respiratoria y olfatoria pero respeta el bulbo olfatorio. Celda 184, 5932–5949 (2021).

Helms, J. y col. Características neurológicas en la infección grave por SARS-CoV-2. N. inglés. J. Med. 382, 2268–2270 (2020).

Artículo PubMed Google Scholar

Yang, AC y cols. Desregulación de los tipos de células del cerebro y del plexo coroideo en casos graves de COVID-19. Naturaleza 595, 565–571 (2021).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Douaud, G. y col. El SARS-CoV-2 se asocia con cambios en la estructura del cerebro en el Biobanco del Reino Unido. Naturaleza 604, 697–707 (2022).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Abdelnabi, R. et al. La variante omicron (B.1.1.529) del SARS-CoV-2 que nos preocupa no infecta fácilmente a los hámsteres sirios. Antivirus. Res. 198, 105253 (2022).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Yuan, S. y col. Patogenicidad, transmisibilidad y aptitud del SARS-CoV-2 Omicron en hámsteres sirios. Ciencia 377, 428–433 (2022).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Hui, KPY y cols. Replicación de la variante Omicron del SARS-CoV-2 en bronquios y pulmones humanos ex vivo. Naturaleza 603, 715–720 (2022).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Armando, F. et al. La variante Omicron del SARS-CoV-2 causa patología leve en el tracto respiratorio superior e inferior de los hámsteres. Nat. Comunitario. 13, 3519 (2022).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Reyna, RA et al. La recuperación de la anosmia en hámsteres infectados con SARS-CoV-2 se correlaciona con la reparación del epitelio olfatorio. Ciencia. Rep. 12, 628 (2022).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Urata, S. et al. Perfiles de regeneración del epitelio olfativo después de la infección por SARS-CoV-2 en hámsteres sirios dorados. Química ACS. Neurociencias. 12, 589–595 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Messlinger, K., Neuhuber, W. y May, A. La activación del sistema trigémino como objetivo probable del SARS-CoV-2 puede contribuir a la anosmia en la COVID-19. Cefalalgia 42, 176–180 (2022).

Artículo PubMed Google Scholar

Kishimoto-Urata, M. et al. Impactos prolongados y extendidos del SARS-CoV-2 en el neurocircuito olfativo. Ciencia. Rep. 12, 5728 (2022).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zazhytska, M. et al. La alteración no autónoma de la arquitectura nuclear como causa potencial de la anosmia inducida por COVID-19. Celda 185, 1052–1064.e1012 (2022).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bourgon, C. y col. Los neutrófilos inician la destrucción del epitelio olfativo durante la infección por SARS-CoV-2 en hámsteres. bioRxiv, 2022.2003.2015.484439 (2022).

Schaecher, SR, Touchette, E., Schriewer, J., Buller, RM y Pekosz, A. Los productos del gen 7 del coronavirus del síndrome respiratorio agudo severo contribuyen a la apoptosis inducida por virus. J. Virol. 81, 11054–11068 (2007).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Timilsina, U., Umthong, S., Ivey, EB, Waxman, B. & Stavrou, S. SARS-CoV-2 ORF7a inhibe potentemente el efecto antiviral del factor huésped SERINC5. Nat. Comunitario. 13, 2935 (2022).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schaecher, SR y cols. Un modelo de hámster dorado sirio inmunodeprimido para la infección por SARS-CoV. Virología 380, 312–321 (2008).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Silvas, JA et al. Contribución de las proteínas accesorias del SARS-CoV-2 a la patogenicidad viral en ratones transgénicos ACE2 humanos K18. J. Virol. 95, e00402–e00421 (2021).

Artículo CAS PubMed Central Google Scholar

Imai, M. y col. Los hámsteres sirios como modelo animal pequeño para la infección por SARS-CoV-2 y el desarrollo de contramedidas. Proc. Acad. Nacional. Ciencia. Estados Unidos 117, 16587–16595 (2020).

Artículo ADS CAS PubMed Central Google Scholar

Bryche, B. y col. Daño transitorio masivo del epitelio olfatorio asociado con la infección de células sustentaculares por SARS-CoV-2 en hámsteres sirios dorados. Comportamiento cerebral. Inmune. 89, 579–586 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Frere, JJ et al. La infección por SARS-CoV-2 en hámsteres y humanos produce perturbaciones sistémicas únicas y duraderas después de la recuperación. Ciencia. Traducción Medicina. 0, eabq3059 (2022).

Artículo CAS Google Scholar

Bulfamante, G. et al. Neuropatología del tronco encefálico en dos casos de COVID-19: tráfico de SARS-CoV-2 entre cerebro y pulmón. J. Neurol. 268, 4486–4491 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

DosSantos, MF et al. Neuromecanismos del SARS-CoV-2: una revisión. Frente. Neuroanat. 14, 37 (2020).

Ueha, R. y col. La inoculación oral de SARS-CoV-2 causa una infección viral nasal que conduce a una infección del bulbo olfatorio: un estudio experimental. Frente. Celúla. Infectar. Microbiol. 12, 924725 (2022).

Dubé, M. et al. El transporte axonal permite la propagación de neurona a neurona del coronavirus humano OC43. J. Virol. 92, e00404-18 (2018).

Shi, J. y col. Infección por PHEV: un modelo prometedor de disfunción neurológica y olfativa asociada al betacoronavirus. Patógeno PLoS. 18, e1010667 (2022).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Planas, D. et al. Sensibilidad reducida de la variante Delta del SARS-CoV-2 a la neutralización de anticuerpos. Naturaleza 596, 276–280 (2021).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Planas, D. et al. Escape considerable del Omicron del SARS-CoV-2 hacia la neutralización de anticuerpos. Naturaleza 602, 671–675 (2022).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Baer, ​​A. y Kehn-Hall, K. Determinación de la concentración viral mediante ensayos de placa: uso de sistemas de superposición tradicionales y novedosos. Júpiter. 93, e52065 (2014).

Thi Nhu Thao, T. et al. Reconstrucción rápida del SARS-CoV-2 mediante una plataforma de genómica sintética. Naturaleza 582, 561–565 (2020).

ADS del artículo Google Scholar

Kouprina, N. & Larionov, V. Clonación por recombinación asociada a transformación (TAR) para estudios genómicos y biología sintética. Cromosoma 125, 621–632 (2016).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kouprina, N., Noskov, VN y Larionov, V. Aislamiento selectivo de grandes segmentos de genomas microbianos individuales y muestras de ADN ambiental mediante clonación por recombinación asociada a transformación en levadura. Nat. Protocolo. 15, 734–749 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Noskov, VN y cols. Un sistema de clonación general para aislar selectivamente cualquier región genómica eucariota o procariótica en levadura. BMC Genomics 4, 16 (2003).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Noskov, VN, Lee, NCO, Larionov, V. y Kouprina, N. Generación rápida de matrices de repetición de ADN en tándem largo mediante recombinación homóloga en levadura para estudiar su función en genomas de mamíferos. Biol. Procedido. En línea 13, 8 (2011).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lindenbach, BD Medición de la infectividad del VHC producida en cultivo celular e in vivo. en Hepatitis C: métodos y protocolos (ed. Tang, H.) 329-336 (Humana Press, Totowa, Nueva Jersey, 2009).

Lazarini, F., Gabellec, M.-M., Torquet, N. y Lledó, P.-M. La activación temprana de la microglía desencadena un deterioro duradero de la neurogénesis adulta en el bulbo olfatorio. J. Neurosci. 32, 3652–3664 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

AVMA. Directrices de la AVMA para la eutanasia de animales: edición 2020*, (Asociación Estadounidense de Medicina Veterinaria, Schaumburg, IL, 2020).

Corman, VM y cols. Detección del nuevo coronavirus 2019 (2019-nCoV) mediante RT-PCR en tiempo real. EUR. Vigilar. 25, 2000045 (2020).

Artículo de Google Scholar

Pfaffl, MW Un nuevo modelo matemático para la cuantificación relativa en RT-PCR en tiempo real. Ácidos nucleicos Res 29, e45 (2001).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Renier, N. y col. Mapeo de la actividad cerebral mediante análisis de volumen automatizado de genes tempranos inmediatos. Celda 165, 1789–1802 (2016).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gribaudo, S. et al. Propagación de cepas de alfa-sinucleína dentro de una red neuronal reconstruida humana. Representante de células madre 12, 230–244 (2019).

Artículo CAS Google Scholar

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La cepa SARS-CoV-2 fue suministrada por el Centro Nacional de Referencia de Virus Respiratorios alojado por el Institut Pasteur (París, Francia) y dirigido por el Pr. Sylvie van der Werf. La muestra humana de la que se aisló la cepa 2019-nCoV/IDF0372/2020 fue proporcionada por el Pr. X. Lescure y Pr. Y. Yazdanpanah del Hospital Bichat (París, Francia). La muestra humana de la que procede la cepa hCoV-19/Japan/TY7-501/2021 (variante gamma, JPN [P.1]) fue suministrada por el Instituto Nacional Japonés de Enfermedades Infecciosas (Tokio, Japón). El aislado SARS-CoV-2 Delta/2021/I7.2 200 (variante Delta, ID GISAID: EPI_ISL_2029113), el aislado SARS-CoV-2 Omicron/B.1.1.529 (variante Omicron BA.1, ID GISAID: EPI_ISL_6794907 ) y las células A549-ACE2-TMPRSS2 fueron suministradas por la Unidad de Virus e Inmunidad del Institut Pasteur y dirigida por el Pr. Olivier Schwartz. Agradecemos a Sanjay Vashee del Instituto J. Craig Venter (Rockville, MD, EE. UU.) por el plásmido YCpBAC-his3. Este trabajo fue apoyado por el Grupo de Trabajo SARS-CoV-2 (Proyecto NeuroCovid) del Institut Pasteur, por la convocatoria conjunta SARS-CoV-2 Institut Pasteur - Paris Brain Institute (Proyecto CoVessel), por el Programa Fédérateur de Recherche 1 (PFR-1) del Institut Pasteur - Genética Inversa). GDM reconoce la financiación de la Fondation pour la Recherche Médicale (subvención ANRS MIE202112015304). VP recibió una beca del Programa Marco Horizonte 2020 para Investigación e Innovación de la Unión Europea en virtud del Acuerdo de Subvención Específico No. 945539 (Proyecto Cerebro Humano SGA3). FA recibió una beca del Programa Fédérateur de Recherche 5 del Institut Pasteur (PFR-5 - Genómica funcional del ciclo viral). AC reconoce la financiación de la convocatoria de estudiantes de maestría Brain Axis SRA3 M2 2022-2023 del Institut Pasteur. ESL y RK agradecen el apoyo del Task Force del Institut Pasteur (proyecto SABSOS). ESL reconoce la financiación del programa INCEPTION (subvención Investissements d'Avenir ANR-16-CONV-0005). Nos gustaría agradecer a Yves Jacob por los fructíferos debates sobre el ORF7 del SARS-CoV-2. Agradecemos a Etienne Jacotot por sus conocimientos sobre cultivos neuronales en cámaras de microfluidos, así como a Bernadette Bung de MicroBrain Biotech. También agradecemos a Johan Bedel por la ayuda con la histopatología y a Emeline Perthame por sus conocimientos sobre los análisis estadísticos. Parte de este trabajo se realizó en la plataforma UtechS Photonic BioImaging (PBI) respaldada por el Institut Pasteur y la Región Ile-de-France (programa DIM1Health).

Estos autores contribuyeron igualmente: Victoire Perraud, Flavio Alvarez, Alba Vieites-Prado.

Estos autores supervisaron conjuntamente este trabajo: Florence Larrous, Hervé Bourhy.

Instituto Pasteur, Universidad Paris Cité, Unidad de Epidemiología y Neuropatología de Lyssavirus, F-75015, París, Francia

Guilherme Dias de Melo, Victoire Perraud, Seonhee Kim, Lauriane Kergoat, Anthony Coleon, Florence Larrous y Hervé Bourhy

Instituto Pasteur, Universidad Paris Cité, Unidad de Receptores de Canales, F-75015, París, Francia

Flavio Álvarez y Nicolás Wolff

Universidad de la Sorbona, Facultad de Doctorado, F-75005, París, Francia

Flavio Alvarez

Instituto del Cerebro y la Médula Espinal, Laboratorio de Plasticidad Estructural, Universidad de la Sorbona, INSERM U1127, CNRS UMR7225, 75013, París, Francia

Alba Vieites-Prado & Nicolás Renier

Instituto de Virología e Inmunología (IVI), Berna, Suiza; Departamento de Enfermedades Infecciosas y Patobiología, Facultad Vetsuisse, Universidad de Berna, Berna, Suiza

Bettina Salomé Trüeb

Instituto Pasteur, Universidad Paris Cité, Plataforma de Histopatología, F-75015, París, Francia

Magali Tichit y David Hardy

Instituto Pasteur, Universidad Paris Cité, Laboratorio de Regulación Espacial de Genomas, F-75015, París, Francia

Aurèle Piazza, Agnès Thierry y Romain Koszul

Institut Pasteur, Université Paris Cité, Unidad de Genética Molecular de Virus de ARN, F-75015, París, Francia

Sandy Munier

Institut Pasteur, Université Paris Cité, Grupo de Genómica Evolutiva de Virus de ARN, F-75015, París, Francia

Etienne Simon-Lorière

Centro Multidisciplinario de Enfermedades Infecciosas, Universidad de Berna, Berna, Suiza

Volker Thiel

Instituto Pasteur, Universidad Paris Cité, Inserm U1117, Unidad de Biología de la Infección, 75015, París, Francia

Marc Lecuit

Hospital Universitario Necker-Enfants Malades, División de Enfermedades Infecciosas y Medicina Tropical, APHP, Institut Imagine, 75006, París, Francia

Marc Lecuit

Instituto Pasteur, Universidad Paris Cité, Unidad de Percepción y Memoria, F-75015 París, Francia; CNRS UMR3571, 75015, París, Francia

Pierre-Marie Lledó

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Conceptualización: GDM, FL y HB Metodología: GDM, RK, VT, NR y FL Investigación: GDM, VP, FA, AVP, SK, LK, AC, MT, AP y AT Adquisición de financiamiento: GDM, ML, PML , NR, FL y HB Recursos: BST, DH, NW, SM, RK, ESL, NR, VT y FL Supervisión: Escritura HB—Borrador original: GDM y Escritura HB—Revisión y edición: todos los autores.

Correspondencia a Hervé Bourhy.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Rouhollah Habibey y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Un archivo de revisión por pares está disponible.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado al autor(es) original(es) y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

de Melo, GD, Perraud, V., Álvarez, F. et al. La neuroinvasión y la anosmia son fenómenos independientes tras la infección por SARS-CoV-2 y sus variantes. Nat Comuna 14, 4485 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-40228-7

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Recibido: 17 de octubre de 2022

Aceptado: 11 de julio de 2023

Publicado: 26 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-40228-7

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