Una proteína conservada de Babesia microti provoca una protección parcial contra la infección por Babesia y Plasmodium

Parásitos y vectores volumen 16, número de artículo: 306 (2023) Citar este artículo

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El parásito protozoario Babesia microti que causa la enfermedad zoonótica babesiosis reside en los eritrocitos de su huésped mamífero durante su ciclo de vida. Actualmente no se dispone de vacunas eficaces para prevenir las infecciones por Babesia microti.

Anteriormente identificamos un antígeno altamente seroactivo, llamado Bm8, como un antígeno asociado a la membrana de eritrocitos conservado de B. microti, mediante detección de chips de proteínas de alto rendimiento. Los análisis bioinformáticos y filogenéticos mostraron que esta proteína asociada a la membrana se conserva entre los hemoprotozoos apicomplejos, como los miembros de los géneros Babesia, Plasmodium y Theileria. Obtuvimos la proteína recombinante Bm8 (rBm8) mediante expresión y purificación en procariotas.

Los ensayos de inmunofluorescencia confirmaron que Bm8 y su homólogo de Plasmodium estaban localizados principalmente en el citoplasma del parásito. La proteína rBm8 fue reconocida específicamente por los sueros de ratones infectados con B. microti o P. berghei. Además, los ratones inmunizados con el polipéptido Bm8 tuvieron una carga parasitaria disminuida después de la infección por B. microti o P. berghei.

La inmunización pasiva con antisueros Bm8 podría proteger a los ratones contra la infección por B. microti o P. berghei hasta cierto punto. Estos resultados nos llevan a plantear la hipótesis de que la proteína Bm8 asociada a la membrana de los eritrocitos conservada de B. microti podría servir como una nueva vacuna candidata contra parásitos de amplio espectro, ya que provoca una respuesta inmune protectora contra la babesiosis y la infección por Plasmodium.

Los parásitos del género Babesia son protozoos intraeritrocíticos transmitidos por garrapatas que pertenecen al filo Apicomplexa. La babesiosis se ha convertido en una amenaza emergente para la salud pública y ha sido designada enfermedad infecciosa de declaración obligatoria a nivel nacional en muchos países [1,2,3]. Las principales especies de Babesia que se sabe que infectan a los humanos y, por lo tanto, funcionan como patógenos zoonóticos son B. microti, B. venatorum, B. canis y B. divergens [4, 5]. La presentación clínica de la babesiosis es predominantemente asintomática o con síntomas leves, pero los síntomas clínicos más graves se encuentran comúnmente en poblaciones de recién nacidos o pacientes inmunocomprometidos. Además, las infecciones por Babesia pueden poner en peligro la vida de los pacientes con esplenectomía [6, 7]. Plasmodium, otro género de parásitos protozoarios transmitidos por vectores, plantea una amenaza aún mayor para la salud mundial, ya que causa malaria. Solo en 2021, se estima que 619.000 muertes se atribuyeron a la malaria [8]. Tanto Plasmodium como Babesia son hemoprotozoos apicomplejos que pueden infectar y replicarse dentro de los eritrocitos del huésped. La citoadherencia de glóbulos rojos (RBC) infectados mediada por la invasión de parásitos y la invasión de RBC por parásitos son dos procesos diferentes e independientes. Como primer paso en la invasión de los glóbulos rojos, los merozoítos se adhieren a la membrana de los glóbulos rojos [9, 10], un proceso que depende en gran medida de las interacciones entre el parásito y las moléculas presentes en la superficie de la célula huésped [11,12,13]. Una serie de estudios en modelos animales han demostrado que la protección que brindan algunas proteínas implicadas en la invasión celular y la inmunidad es limitada; por lo tanto, hasta la fecha no hay ninguna vacuna disponible contra las infecciones por B. microti y se necesita mayor exploración [14,15,16,17,18,19]. La vacuna RTS,S, que es la primera y más desarrollada vacuna contra la malaria en el mundo, demostró sólo una eficacia modesta contra Plasmodium falciparum, con una longevidad relativamente corta [20].

Los esfuerzos actuales de desarrollo de vacunas se centran en el uso de inmunógenos definidos antigénicamente, en particular aquellas moléculas que interactúan con el proceso de invasión del parásito en los glóbulos rojos del huésped o lo interrumpen [21]. En nuestro estudio anterior de detección de proteoma de alto rendimiento, identificamos varias proteínas de B. microti con alta antigenicidad [19, 22]. Se evaluó la protección y el potencial diagnóstico de los péptidos señal de estas proteínas secretadas, incluida la proteína 44, denominada BmSP44 [23]. En el presente estudio, la detección de chips de proteoma de alto rendimiento y el análisis mediante bioinformática dieron como resultado la identificación de la proteína 8 asociada a la membrana de los eritrocitos de B. microti (llamada Bm8) como una proteína conservada entre los parásitos apicomplejos, como Plasmodium spp. y Theileria spp. Tras clonar y expresar la proteína y sintetizar uno de sus fragmentos peptídicos, evaluamos la protección inmune frente a la infección murina por Plasmodium y Babesia. El objetivo de este estudio fue identificar moléculas comunes que puedan usarse como referencia para la prevención y el control de los hemoprotozoos transmitidos por vectores.

Se obtuvieron ratones BALB/C hembra, de 6 a 8 semanas de edad, del Centro de Animales de Laboratorio de la Universidad de Soochow y se criaron en un entorno específico libre de patógenos (SPF). La cepa B. microti Peabody (ATCC: PRA-99) se obtuvo originalmente de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC, Manassas, VA, EE. UU.). Los dos parásitos utilizados en este estudio, a saber, B. microti y Plasmodium berghei ANKA, fueron proporcionados por el Instituto Nacional de Enfermedades Parasitarias (NIPD), el Centro Chino para el Control y la Prevención de Enfermedades (Beijing, China). Se infectaron dos ratones BALB/c de cada grupo mediante inyección intraperitoneal con parásitos de B. microti o P. berghei. Se recogieron muestras de sangre de todos los animales infectados de los párpados en tubos de anticoagulante que contenían EDTA entre 5 y 7 días después de la infección (cuando la parasitemia era aproximadamente del 60%). Luego, la sangre infectada se mezcló con solución salina tamponada con fosfato (PBS) en una proporción de 1:4, y a cada ratón BALB/c se le inyectó por vía intraperitoneal 100 µl de sangre diluida (aproximadamente 1 × 107 parásitos infectados en glóbulos rojos [iRBC]).

Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con los principios de uso ético de animales con fines médicos por el Ministerio de Salud de la República Popular China y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Soochow para uso de laboratorio. animales (Número de permiso: ECSU-201800091).

La alineación de la secuencia del gen objetivo asociado a la membrana de los eritrocitos de Plasmodium de especies de los géneros Babesia, Plasmodium y Theileria se realizó utilizando la herramienta MEGA versión X [24]. El análisis filogenético se realizó con métodos de máxima verosimilitud y de unión de vecinos, y se compararon las topologías de los árboles para obtener una filogenia sólida. La secuencia de B. microti (Número de acceso: XP_021338580.1), Babesia bovis (Número de acceso: XP_001610259.2), P. berghei (Número de acceso: XP_034420266.1), Plasmodium vivax (Número de acceso: SCO66108.1), Plasmodium falciparum (Número de acceso: XP_002585407.1) y Theileria annulata (Número de acceso: XP_952528.1) fueron criticados en línea [25]. Se seleccionó Toxoplasma gondii (Número de acceso: 37589.1) como grupo externo y se calcularon los valores de arranque con 1000 pseudoréplicas. Se utilizó SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/interactive) para generar el modelo de estructura tridimensional (3D) basado en la estructura cristalina del antígeno asociado a la membrana de eritrocitos de Plasmodium que se informó anteriormente.

Se utilizó ADN complementario de B. microti para amplificar el marco de lectura abierto (ORF) de Bm8. El ORF de longitud completa de Bm8 se clonó en el vector pGEX-6p-2 utilizando los sitios de restricción BamHI y XhoI y cebadores directos específicos del gen (TTCCAGGGGCCCCCTGGGATCCATGCATATCAACTACAAATTAATTA) e inverso (CACGATGCGGCCGCTCGAGTTAAGCAGCATTAGGTGTGTGAT). La proteína de fusión que contiene la etiqueta GST en Escherichia coli BL21 se expresó utilizando un protocolo similar al descrito en [23]. Después de la escisión de la etiqueta GST con proteasa Procession, se obtuvo la proteína recombinante Bm8 (®Bm8) y se verificó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) y ensayo de transferencia Western.

Se realizó un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) siguiendo procedimientos estándar. Brevemente, se recubrieron placas de microtitulación de 96 pocillos con 1 μg/ml (100 μl/pocillo) de rBm8 en tampón de recubrimiento de bicarbonato 0,1 M (pH 9,6) y se dejaron reposar durante la noche a 4 °C. Luego, las placas se lavaron 3 veces con 200 µl de PBS más Tween-20 al 0,05 % (Sigma–Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.), tras lo cual los pocillos se bloquearon con albúmina sérica bovina (BSA) al 1 % durante 1 h. a temperatura ambiente con 100 μl de tampón de bloqueo (PBS con 0,05% de Tween-20 y 5% de leche desnatada). Se diluyeron sueros combinados de ratones infectados con B. microti o P. berghei (6 ratones en cada grupo; sueros recolectados 14 días después de la infección; 100 µl) y una cantidad equivalente de sueros de ratón negativos (recogidos de ratones sanos) con BSA al 1 %. (1:10, 1:100, 1:1000 y 1:10.000) y se incubaron durante 2 h. Después de la incubación con el anticuerpo de inmunoglobulina G (IgG) anti-ratón de conejo conjugado con peroxidasa durante 1 h, se añadió el sustrato TMB (Ebioscience, California, Estados Unidos) para aplicaciones de micropocillos de peroxidasa de rábano picante y se incubó durante 20 minutos para detectar la reacción. Se detuvo utilizando 100 μl de H2SO4 1 M. La densidad óptica (DO) a 450 nm se determinó con un lector de microplacas (modelo ELX800; BioTek, Winooski, VT, EE. UU.) Las pruebas ELISA se repitieron 3 veces para cada modelo infectado.

Se extrajo sangre de ratones cuando la parasitemia era de aproximadamente el 70%. Como primer paso, la sangre se untó en portaobjetos mediante centrifugación con citospin (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) y se fijó con paraformaldehído-PBS al 4% durante 10 minutos. Luego, los eritrocitos aislados en los portaobjetos se permeabilizaron con Triton al 0,4% durante 15 minutos y se bloquearon con suero bovino fetal (FBS) al 5% durante 30 minutos. Finalmente, los portaobjetos se incubaron con suero anti-Bm8 diluido 1:500 durante la noche a 4 °C. Después de incubar con IgG anti-conejo de cabra Alexa fluor 680 diluida 1:500 durante 1 h, se agregaron 0,5 ug/ml de DAPI y se tiñeron en la oscuridad durante 10 min. Las imágenes se realizaron utilizando el sistema de microscopía confocal Nikon C2+ (Nikon Corp., Tokio, Japón).

Los epítopos de anticuerpos de Bm8 se predijeron en línea mediante los recursos de análisis de Immune Epitope Database (IEDB) (//tools.immuneepitope.org/bcell/). Se analizó la antigenicidad de Bm8 y Sangon Biotech (Shanghai, China) seleccionó y sintetizó químicamente los polipéptidos diana (CYDPEKSNSAEW). Los antisueros de conejo se prepararon inmunizando al conejo con los polipéptidos sintetizados.

Para la inmunización activa, se inmunizaron cinco ratones de cada grupo con polipéptidos Bm8 (20 µg/ratón) mezclados con adyuvante completo de Freund, como inmunización subcutánea después de la emulsión. El grupo de control fue inmunizado únicamente con la mezcla de adyuvante de Freund y PBS. La inmunización de refuerzo (40 µg/ratón) se llevó a cabo 2 semanas después de la primera inmunización, seguida de una segunda inmunización de refuerzo (40 µg/ratón) 1 semana después. El suero se recogió 1 semana después de la tercera inmunización y los títulos de anticuerpos se midieron mediante ELISA. Si ELISA confirmaba la inmunización activa exitosa, los animales se exponían 1 semana después de la última inmunización de refuerzo con una infección intraperitoneal de glóbulos rojos que contenían 1 × 107 parásitos de P. berghei o B. microti.

Para la inmunización pasiva, se inmunizaron cinco ratones de cada grupo con antisueros del polipéptido Bm8 proporcionados por una empresa de péptidos sintéticos, Sangon Biotech (Shanghai, China) (200 µl cada uno) o con sueros de conejo normales. Después de 24 h, los animales fueron expuestos a una infección intraperitoneal de glóbulos rojos que contenían 1 x 107 parásitos de P. berghei o B. microti. Dos días después, los ratones de ambos grupos recibieron una inmunización de refuerzo con la misma dosis que la inmunización inicial.

La concentración de parásitos en la sangre periférica de ratones se determinó mediante examen de frotis de sangre y PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR). Se obtuvieron frotis de sangre de la punta de la cola de los ratones cada 3 días después de la infección. El número de eritrocitos infectados en cada campo visual se calculó promediando 50 recuentos de campos visuales bajo un microscopio después de la tinción de Giemsa. El grado de infección en cada ratón se expresó como porcentaje de parasitemia. Al mismo tiempo, se aplicó RT-PCR para amplificar el ARN mensajero (ARNm) para determinar la carga parasitaria. Brevemente, se utilizó el kit de aislamiento de ADN/ARN de Omega Bio-tek (Norcross, GA, EE. UU.) para extraer ARNm de la sangre de ratones infectados. La transcripción inversa se realizó con 5 × All-In-One RT Mastermix (abm, Shanghai, China). Se utilizaron los siguientes cebadores para el ensayo RT-qPCR: (i) cebadores directos (AGCGTTTTCGAAGGTATGTTGC) e inversos de ARN ribosomal (ARNr) de B. microti 18S (AGCGTTTTCGAAGGTATGTTGC); (ii) cebadores directos (AGCGTTTTCGAAGGTATGTTGC) e inversos (AGCAGATACATCCCTTACTAGGGAAA) del ARNr 18S de P. berghei; (iii) cebadores directos (AGAGGGAAATCGTGCGTGAC) e inversos (CAATAGTGATGACCTGGCCGT) de beta-actina de ratón (gen de control). El protocolo de qPCR consistió en una predesnaturalización a 95 °C durante 5 min, seguida de desnaturalización durante 10 s, recocido a 60 °C durante 10 s y extensión a 72 °C durante 30 s.

Además de medir la parasitemia y la carga parasitaria de Babesia o Plasmodium, también se evaluaron el peso, la temperatura y el nivel de hemoglobina (Hb) de los ratones para evaluar la gravedad de las infecciones por babesiosis o P. berghei. El peso y la temperatura anal se controlaron diariamente después de la infección con B. microti o P. berghei. Para medir la concentración de hemoglobina (Hb) de diferentes grupos, se diluyeron 10 µl de sangre en 2490 µl de reactivo de Drabkin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) en cada muestra y se cuantificaron a 540 nm utilizando un biofotómetro (Eppendorf , Hamburgo, Alemania). La absorbancia y la concentración de Hb se contaron utilizando una curva estándar de Hb disponible comercialmente.

Los datos se analizaron utilizando el software GraphPad Prism 9.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EE. UU.). Las diferencias de datos entre los grupos control y experimental se compararon mediante una prueba t de muestra independiente, con P <0,05 como criterio de significación estadística de los datos.

La secuencia codificante de Bm8 constaba de 1545 nucleótidos, que se predijo que produciría una proteína que constaba de 515 residuos de aminoácidos (archivo adicional 1: archivo de palabras S1). Se estimó que la proteína tenía un peso molecular de 56,65 kDa y un punto isoeléctrico de 7,91. Se utilizó el servidor TMHMM para realizar una búsqueda de dominio conservado, lo que indica que la proteína tiene un homólogo con una estructura de dominio SCOP conocida en las posiciones 274–423 y dos regiones transmembrana (con referencia a https://dtu.biolib.com/DeepTMHMM). como se muestra en la Fig. 1a. La alineación de secuencias múltiples realizada por ClustalW sugirió que Bm8 compartía homología con secuencias de los parásitos protozoos apicomplejos P. berghei (GenBank: XP_034420266.1), Plasmodium falciparum (GenBank: XP002585407.1) y Plasmodium vivax (GenBank: SCO66108.1) (Fig. 1b ). La secuencia conservada asociada a la membrana de Bm8 se analizó utilizando un árbol filogenético para compararla con homólogos de otras especies de protozoos apicomplejos, lo que reveló que Bm8 tiene una relación más estrecha con Plasmodium spp. y Theileria spp. El KFG37589.1. La secuencia de aminoácidos de la proteína asociada a la membrana conservada de Theileria gondii se utilizó como grupo externo (Fig. 1C).

Análisis bioinformático del antígeno conservado asociado a membrana, Bm8. una búsqueda de dominio conservado indicó que la proteína tiene un homólogo con una estructura conocida en 274–423; El servidor TMHMM detectó dos regiones transmembrana (https://dtu.biolib.com/DeepTMHMM). Los números del 0 al 500 representan la longitud de la secuencia de proteínas. La región transmembrana se muestra en azul. b Alineamiento de secuencias múltiples mediante ClustalW de las secuencias conservadas asociadas a la membrana de Babesia microti con otros protozoos apicomplejos (Plasmodium berghei, Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Babesia bovis, Theileria annulata y Toxoplasma gondii). El cuadro verde muestra las regiones polipeptídicas conservadoras sintéticas (es decir, todos los aminoácidos son idénticos); las áreas marcadas en amarillo representan regiones proteicas conservadas de forma incompleta (es decir, al menos 4 de las 6 muestras tienen aminoácidos idénticos). El cuadro verde muestra los polipéptidos conservados entre Babesia, Plasmodium, Theileria y Toxoplasma con los péptidos sintetizados de B. microti seleccionados en este estudio. c Árbol filogenético de la secuencia de las secuencias conservadas asociadas a la membrana con otras especies de protozoos apicomplejos. La barra de escala representa las sustituciones de nucleótidos por posición. Las longitudes de las ramas representan la cantidad de cambio de distancia genética entre las cepas. d Modelos estructurales tridimensionales de la proteína conservada de Bm8 asociada a la membrana de los eritrocitos predicha por el programa SWISS-MODEL. Las secuencias conservadas asociadas a la membrana de otros protozoos apicomplejos (P. berghei, P. vivax, B. bovis y T. annulata) se predijeron simultáneamente. Las regiones verdes representan los polipéptidos conservadores altamente antigénicos aplicados en este estudio. Bm8, proteína 8 de B. microti

Para confirmar aún más la conservación de este antígeno asociado a la membrana en los parásitos apicomplejos, se predijo la estructura tridimensional de estas proteínas. Se predijo que la estructura 3D predicha del antígeno conservado asociado a la membrana contendría siete hélices α, 22 hebras β y 279 rizos aleatorios (Fig. 1d) en Bm8. El modelado de homología se realizó con las proteínas de homología de B. microti, P. berghei y P. vivax, y los resultados muestran que sus estructuras de dominio predichas están bien conservadas. La parte de la estructura 3D de Bm8 que se muestra en verde (Fig. 1b) es el área predicha con alta inmunogenicidad y la región de los polipéptidos sintetizados. En este estudio se evaluó su eficacia de protección inmune, lo que demuestra que las estructuras de dominio previstas están bien conservadas.

Para investigar las características de la proteína Bm8 asociada a la membrana conservada, generamos una proteína recombinante con la etiqueta GST (aprox. 24 kDa). Aunque el rendimiento de la proteína rBm8 fue relativamente bajo en el sistema de expresión de E. coli, la proteína se purificó con éxito. El tamaño previsto de rBm8 fue de 57 kDa, lo que se confirmó mediante SDS-PAGE después de la purificación. El ensayo de transferencia Western se probó con sueros normales y con anti-B. Sueros de ratones microti infectados durante 2 semanas, respectivamente. Los resultados del ensayo de transferencia Western confirmaron no solo la purificación de rBm8, sino también la antigenicidad específica de rBm8 (archivo adicional 2: Figura S1 A, B). Teniendo en cuenta el bajo rendimiento de rBm8, sintetizamos los polipéptidos epítopos para inmunizar ratones. Los epítopos lineales predichos de los antígenos Bm8 se enumeraron en el archivo adicional 3: Figura S2 A, B, C.

Para validar la antigenicidad de rBm8, utilizamos un ELISA indirecto para detectar anticuerpos específicos de rBm8 de los sueros de ratones infectados con B. microti y P. berghei. Los resultados sugirieron que rBm8 podría ser reconocido por los sueros recolectados de ratones infectados con B. microti y P. berghei (Fig. 2a). Alternativamente, tanto B. microti como P. berghei podrían detectarse mediante sueros anti-rBm8 en los RBCS infectados por B. microti y P. berghei, respectivamente. Estos resultados sugirieron que Bm8 y su homólogo de Plasmodium están localizados en el citoplasma de B. microti y P. berghei. Como controles negativos, los iRBC de ratones infectados con B. microti o P. berghei no reaccionaron con los sueros combinados de ratones normales en los grupos de control (Fig. 2b, c).

Antigenicidad de rBm8 y su localización subcelular. a Evaluación de antigenicidad mediante ELISA con sueros combinados de 5 ratones infectados con B. microti o P. berghei, respectivamente. b Localización de Bm8 en iRBC de B. microti detectados por IFA: i, ii los iRBC se incubaron conjuntamente con sueros anti rBm8; iii coincubación de iRBC infectados con B. microti, con sueros combinados de ratones normales como grupos de control. c Localización de Bm8 en iRBC de P. berghei detectados por IFA: i, ii los iRBC se incubaron conjuntamente con sueros anti-rBm8; iii coincubación de iRBC infectados con P. berghei con sueros combinados de ratones normales como grupos de control. Barras de escala: 5 μm. iRBC, glóbulos rojos infectados con parásitos; IFA, ensayo inmunofluorescente; rBm8, proteína 8 recombinante de B. microti

En esta parte de nuestro estudio, evaluamos si la inmunización activa de ratones con polipéptido Bm8 afectaba la infección por Babesia. Después de la inmunización activa, se detectó un alto nivel de anticuerpo Bm8 en el suero de los ratones (archivo adicional 4: Figura S3 A, B). En comparación con el grupo de control, el número de copias del gen Babesia y el nivel de parasitemia de los ratones inmunizados el día 9 después de la infección se redujeron (Fig. 3a, b). Además, los cambios en el nivel de Hb, el peso corporal y la temperatura anal, que reflejan la gravedad de la babesiosis en ratones BALB/c, fueron comparables entre el grupo inmunizado y el de control. Aunque la parasitemia en el grupo inmune fue menor que en el grupo de control, no hubo diferencias significativas en los indicadores de gravedad de la enfermedad, como la concentración de hemoglobina, el peso corporal y la temperatura (Fig. 3c, i, ii, iii).

La inmunización activa protege contra la infección por B. microti en ratones BALB/c inducida por el polipéptido Bm8. a Detección del número de copias del gen de B. microti en ratones BALB/c los días 3, 6, 9 y 12 post-infección mediante qRT-PCR. Los asteriscos indican una diferencia significativa en **P <0,01 frente al grupo adyuvante (prueba t). b Comparación de parasitemia en ratones BALB/c infectados con B. microti los días 3, 6, 9 y 12 después de la infección detectada por microscopía. El asterisco indica una diferencia significativa en *P < 0,05 frente al grupo adyuvante (prueba t). c Gravedad de la babesiosis en ratones que recibieron inmunización activa con polipéptido Bm8 versus el grupo de control, los días 3, 6, 9 y 12 después de la infección: cambios i-iii en el nivel de Hb (i), peso corporal (ii) y temperatura corporal ( iii). Bm8, proteína 8 de B. microti; Hb, hemoglobina; ARNm, ARN mensajero; qRT-PCR, PCR cuantitativa en tiempo real

A continuación, evaluamos si la inmunización activa de ratones con polipéptido Bm8 afecta la infección por Plasmodium. El número de copias del gen de ARN de Plasmodium 18S el día 9 después de la infección fue menor en los ratones inmunizados que en el grupo de control (Fig. 4a, b). La temperatura anal fue mayor en los ratones del grupo inmunizado que en el grupo de control el día 9 después de la infección por P. berghei (Fig. 4 c, iii). No hubo diferencias significativas en la concentración de Hb y el peso corporal (Fig. 4c, i, ii).

Comparación de indicadores corporales entre ratones inmunizados y ratones control infectados con P. berghei después de la inmunización activa con polipéptido Bm8 o adyuvante, respectivamente. a Detección del número de copias del gen de P. berghei en ratones BALB/c los días 3, 6, 9 y 12 después de la infección mediante qRT-PCR. El asterisco indica una diferencia significativa en *P < 0,05 frente al grupo adyuvante (prueba t). b Comparación de parasitemia en ratones BALB/c infectados con P. berghei versus ratones control en los días 3, 6, 9 y 12 después de la infección detectada por microscopía. c Gravedad de la babesiosis en ratones que recibieron inmunización activa con polipéptido Bm8 versus el grupo de control: cambios i-iii en el nivel de Hb (i), el peso corporal (ii) y la temperatura corporal (iii) en ratones BALB/c expuestos a infección con P. berghei los días 3, 6 y 9 posteriores a la infección. El asterisco indica una diferencia significativa en *P < 0,05 frente al grupo adyuvante (prueba t). Bm8, proteína 8 de B. microti; Hb, hemoglobina; ARNm, ARN mensajero; qRT-PCR, PCR cuantitativa en tiempo real

Para investigar el efecto protector del antisuero Bm8 contra la infección por B. microti y P. berghei, a los ratones se les inyectó antisuero Bm8 24 h antes de ser expuestos a los parásitos. Se administró una vacuna de refuerzo 4 días después de la infección. Descubrimos que el número de copias del gen Babesia el día 3 después de la infección era menor en los ratones infectados con B. microti que en los ratones del grupo de control. Sin embargo, no hubo diferencias significativas en el peso corporal entre el grupo inmunizado y el grupo de control (Fig. 5a, b). La concentración de Hb en los días 3 y 6 después de la infección fue mayor en el grupo inmune en comparación con el grupo de control (Fig. 5c, i); no hubo diferencias significativas en el peso corporal y la temperatura entre el grupo inmune y el grupo de control (Fig. 5c, ii, iii). Después de la infección por P. berghei, el número de copias del gen Plasmodium y la parasitemia de los ratones inmunizados el día 9 después de la infección fueron menores que los del grupo de control. Nuevamente, no hubo diferencias significativas en el peso corporal entre el grupo inmunizado y el grupo de control (Fig. 6a, b). La temperatura anal de los ratones del grupo inmunizado fue ligeramente superior a la del grupo control después de 9 días de infección con P. berghei. (Figura 6c, iii); no hubo diferencias significativas en la concentración de Hb y el peso corporal entre el grupo inmune y el grupo de control (Fig. 6c, i, ii).

La inmunización pasiva protege contra la infección por B. microti en ratones BALB/c inducida por antisueros Bm8. a Detección del número de copias del gen de B. microti en ratones BALB/c los días 3, 6, 9 y 12 después de la infección mediante qRT-PCR. El asterisco indica significación en *P < 0,05 frente al grupo de suero control (prueba t). b Comparación de parasitemia en ratones BALB/c infectados con B. microti los días 3, 6, 9 y 12 después de la infección versus el grupo control detectado por microscopía. c Gravedad de la babesiosis de ratones en ratones que recibieron inmunización pasiva con antisueros de polipéptidos Bm8 versus aquellos que recibieron sueros de control: cambios i-iii en el nivel de Hb (i), peso corporal (ii) y temperatura corporal (iii) en ratones BALB/c expuestos a infección con B. microti los días 3, 6, 9 y 12 después de la infección. Los asteriscos indican una diferencia significativa frente al grupo de suero de control en *P < 0,05 y **P < 0,01 (prueba t). Bm8, proteína 8 de B. microti; Hb, hemoglobina; qRT-PCR, PCR cuantitativa en tiempo real; ARNm, ARN mensajero; PCR cuantitativa en tiempo real

La inmunización pasiva protege contra la infección por P. berghei en ratones BALB/c inducida por antisueros Bm8. a Detección del número de copias del gen de P. berghei en ratones BALB/c los días 3, 6, 9 y 12 después de la infección mediante qRT-PCR. El asterisco indica una diferencia significativa en *P < 0,05 frente al grupo adyuvante (prueba t). b Comparación de parasitemia en ratones BALB/c infectados con P. berghei los días 3, 6 y 9 después de la infección versus el grupo control detectado por microscopía. El asterisco indica una diferencia significativa en *P < 0,05 frente al grupo adyuvante (prueba t). c Gravedad de la babesiosis de ratones en ratones inmunizados pasivamente con el grupo de antisueros de polipéptidos Bm8 versus aquellos que recibieron sueros de control: cambios i, ii, iii en el nivel de Hb (i), peso corporal (ii) y temperatura corporal (iii) en ratones BALB/c. infección con P. berghei días 3, 6 y 9 post infección. a, b, c (i). Los asteriscos indican una diferencia significativa en ***P < 0,001 (prueba t). Bm8, proteína 8 de B. microti; Hb, hemoglobina; qRT-PCR, PCR cuantitativa en tiempo real; ARNm, ARN mensajero; PCR cuantitativa en tiempo real

Los parásitos sanguíneos transmitidos por vectores son responsables de algunas de las enfermedades más extendidas, graves y mal controladas a nivel mundial, incluida la malaria causada por Plasmodium y la babesiosis causada por Babesia spp. Existe una necesidad urgente de comprender mejor los mecanismos de transmisión y el proceso de invasión de estos parásitos a las células huésped para optimizar los métodos de control, incluido el desarrollo de vacunas [26]. En este estudio, clonamos y expresamos un nuevo antígeno altamente conservado asociado a la membrana de B. microti, conocido como Bm8, y realizamos una investigación funcional preliminar sintetizando uno de sus fragmentos peptídicos. Basándonos en la predicción estructural y el análisis de antigenicidad, encontramos que la proteína Bm8 tenía una alta homología en los protozoos apicomplejos, incluidos P. berghei, P. vivax, P. falciparum, B. bovis y T. annulata. Además, los miembros de Babesia y Plasmodium que pertenecen al mismo hemoprotozoo apicomplejo pasan por un ciclo de vida complejo que involucra vectores y huéspedes mamíferos y tienen algunas estructuras subcelulares similares. Estos dos protozoos parásitos pueden secretar múltiples membranas apicales de merozoitos y proteínas relacionadas con orgánulos que pueden desempeñar funciones importantes en el proceso de invasión de las células huésped por parte de estos protozoos [27, 28].

Curiosamente, una serie de estudios publicados identificaron que las aspartil proteasas (AP) de la familia de la pepsina de B. microti tienen una relación filogenética con los homólogos de las plasmepsinas de P. falciparum (PfPM I-X) y las aspartil proteasas de T. gondii (TgASP1-7). . Con base en estas analogías con las plasmepsinas plasmodiales, se creía que los AP representaban objetivos valiosos para el desarrollo de fármacos entre especies contra la infección por protozoos apicomplejos [29,30,31]. Además, a lo largo de los años se han informado una serie de casos de infección mixta por Babesia y Plasmodium en pacientes febriles en áreas endémicas de malaria ubicadas en la zona fronteriza entre China y Myanmar [32]. Se han notificado otros casos de infección mixta en la región de Kilosa en Tanzania, África, Guinea en África occidental y otras áreas endémicas de malaria [33,34,35]. Se cree ampliamente que cuando Babesia y Plasmodium coinfectan a un huésped, pueden interactuar entre sí y competir para invadir las células del huésped [36, 37]. Los autores de un estudio informaron que varios monos rhesus importados de China tenían una parasitemia baja de Plasmodium después de haber sido expuestos a infecciones. Un análisis más detallado reveló que estos monos rhesus de Guangxi, China, habían sido previamente infectados con B. microti, lo que sugiere que estos monos previamente infectados con Babesia pueden ser menos sensibles a la malaria o que el progreso de la malaria después de la infección es más lento que el de los animales de control. 36]. La existencia de coinfecciones con protozoos transmitidos por vectores nos ha llevado a considerar si se puede diseñar una vacuna para abordar múltiples infecciones por protozoos similares. Dadas las interacciones entre los parásitos Babesia y Plasmodium y la observación de que las moléculas de eritrocitos interactúan entre sí, los ligandos formados pueden desempeñar un papel en la interfaz del parásito para facilitar la invasión exitosa [10, 37]. Varias secuencias conservadas entre los protozoos apicomplejos y sus mecanismos de invasión y conservación relacionados sugieren que estos objetivos pueden inducir respuestas inmunes cruzadas durante la coinfección por Babesia y Plasmodium [38, 39].

Aunque se identificó una región conservada con alta antigenicidad en Bm8 mediante comparación de secuencias, ha habido pocos estudios relacionados sobre estas proteínas que contienen la misma secuencia conservadora. En el presente estudio, intentamos investigar el posible efecto protector del polipéptido Bm8 en un modelo murino infectado con B. microti o P. berghei. Según los resultados de la inmunización activa, el efecto protector del polipéptido Bm8 fue más evidente durante las etapas media y tardía de las infecciones por B. microti y P. berghei, particularmente el día 9 después de la infección. Sin embargo, el efecto protector inmunológico inducido por este antígeno diana fue relativamente débil, lo que puede estar relacionado con la mayor concentración de parásitos durante la infección de desafío y la menor concentración de los antisueros utilizados en nuestro experimento. En el estudio de inmunización activa en ratones infectados con P. berghei y el grupo de control, los resultados de qPCR mostraron que el día 9 después de la infección, el número relativo de copias de parásitos de sangre periférica en el grupo inmunizado era menor que en el grupo de control. . De manera similar, en el estudio de inmunización pasiva con antisueros Bm8 en el grupo infectado con B. microti y el grupo de control, los resultados de qPCR mostraron que el día 3 después de la infección, el número relativo de copias de los parásitos en la sangre periférica de los ratones inmunizados era más bajo que el de la sangre periférica del grupo de control. Estos resultados que muestran diferencias estadísticamente significativas mediante qPCR no son completamente consistentes con los resultados de los frotis de sangre periférica durante el mismo período. Una razón puede ser que la qPCR es un método más sensible para detectar concentraciones de gusanos que son biológicamente activos o en su ciclo de vida parasitario (por ejemplo, parásitos que invaden los eritrocitos), mientras que la detección de parasitemia mediante frotis de sangre es más intuitiva y concreta, pero relativamente por detrás de la infección. Otra razón para los resultados inconsistentes entre la qPCR y el frotis de sangre puede deberse a la débil protección inmune inducida por los péptidos diana y sus antisueros, de modo que la diferencia entre el grupo inmune y el grupo de control no fue significativamente suficiente. Otro problema que no se puede ignorar es que la eficiencia de clonación y expresión de la proteína objetivo Bm8 era baja, lo que resultó en una cantidad insuficiente de proteínas en los experimentos de protección inmune. Por lo tanto, se requiere una mayor optimización de los métodos experimentales para evaluar mejor la función de la secuencia conservadora, y la eficacia de Bm8 como antígeno protector debe verificarse mediante experimentos in vivo e in vitro.

La concentración de Hb, el peso corporal y la temperatura corporal son indicadores que reflejan la gravedad de la enfermedad y pueden ser claramente diferentes cuando se inducen protecciones obvias en el grupo inmune [23]. En este estudio, encontramos que la concentración de Hb fue significativamente mayor en el grupo inmune que en el grupo de control en los días 3 y 6 después de la inmunidad pasiva con respecto a la infección por Bm. Este resultado es consistente con la reducción obvia en el nivel del parásito y sugiere que la inmunidad pasiva del suero anti-Bm8 induce una protección contra las infecciones por Babesia.

En el grupo de control de infecciones por P. berghei, los resultados mostrados en las Figs. 4c y 6c muestran una comparación de la temperatura corporal del ratón. Descubrimos que la temperatura corporal del grupo inmunizado era más alta que la del grupo de control y más cercana a la de los ratones normales. Especulamos que la razón de esto es que aproximadamente 10 días después de la infección con P. berghei, los ratones infectados ya no tenían fiebre pero sí mostraron una reducción significativa en los glóbulos rojos, presentando anemia severa y una temperatura corporal que decrecía gradualmente, lo que puede deberse a una debilidad física extrema. La temperatura corporal era más cercana a la del grupo normal, lo que posiblemente indica que la gravedad de la enfermedad es menor que la del grupo de control.

Hay una serie de limitaciones para este estudio. En primer lugar, aunque IFA es un método comúnmente utilizado para marcar proteínas con anticuerpos fluorescentes para su localización [39, 40], no pudimos localizar claramente la proteína objetivo, Bm8, en este estudio. Se predijo que hay dos dominios transmembrana en esta proteína, pero el IFA no mostró la localización en la membrana y este aspecto requiere una evaluación adicional. Mientras tanto, especulamos que Babesia spp. Son eucariotas unicelulares con orgánulos. Por tanto, las proteínas localizadas en la membrana también pueden ser proteínas de la membrana plasmática del orgánulo. Si más experimentos verifican que Bm8 es una proteína en el citoplasma, entonces las vacunas de ARNm pueden ser vacunas prometedoras. El ARNm se puede introducir directamente en las células del cuerpo animal (vacuna inyectada en humanos) mediante la administración especial de fragmentos de genes (ADN o ARN) que codifican la proteína Bm8, produciendo proteína antigénica a través del sistema de síntesis de proteínas de las células huésped para inducir una respuesta inmune a ese antigénico. proteína con el fin de prevenir y tratar enfermedades [41]. También se ha demostrado en la literatura que los propios eritrocitos pueden actuar como portadores de sistemas que liberan sustancias como fármacos, enzimas, péptidos y antígenos in vivo; por lo tanto, si está claro que el parásito se localiza en el citoplasma después de la invasión de los eritrocitos, este mecanismo tiene implicaciones para el desarrollo de vacunas intracitoplasmáticas [42]. En segundo lugar, se ha informado que es posible la autoeliminación de los protozoos de Babesia, especialmente en casos de baja parasitemia. Este fenómeno también se ha descrito en infecciones causadas por varias especies de Babesia [43]. Clínicamente, la infección por B. microti en humanos en presencia de otras enfermedades subyacentes puede ser fatal, mientras que la mayoría de las infecciones no son relativamente graves [4, 44]. Este mecanismo de eliminación inmune funcionará inevitablemente como una interferencia en nuestro experimento de evaluación de protección. Comparamos la infección del grupo inmune y el grupo de control usando la misma dosis de infección al mismo tiempo. En tercer lugar, debido a la baja expresión de la proteína Bm8, sintetizamos los péptidos antigénicos conservados para realizar los experimentos de protección inmune. Los estudios de protección de esta investigación utilizaron los péptidos sintetizados, en lugar de la proteína Bm8 en sí. Mientras tanto, si podemos identificar algunos péptidos antigénicos conservados clave y diseñar vacunas a través de péptidos sintetizados, habremos desarrollado una forma eficaz de superar la complejidad de los procesos de expresión y purificación de proteínas, así como la incertidumbre del rendimiento. Por último, se necesitan más investigaciones sobre la interacción entre la proteína diana Bm8 y los receptores de la membrana de los eritrocitos.

Nuestro estudio identificó una proteína conservada asociada a la membrana eritrocítica de B. microti, denominada Bm8. Los resultados de nuestro estudio sugieren que Bm8 podría ser una prometedora vacuna candidata de subunidad dirigida a la etapa sanguínea de los hemoprotozoos, incluidas la babesiosis y las infecciones por Plasmodium transmitidas por vectores, según la protección observada en estudios de inmunización tanto activa como pasiva contra B. microti y P. Infecciones por Berghei en ratones. Además, dado que P. berghei se utiliza como modelo para la malaria humana, nuestros hallazgos podrían tener implicaciones para el desarrollo de vacunas eficaces contra la malaria. En general, este estudio proporciona nuevos conocimientos sobre la prevención y el control de las infecciones por protozoos intraeritrocíticos transmitidas por vectores.

Todos los datos se incluyen como figuras e Información complementaria en el artículo.

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Nos gustaría agradecer al Dr. Tingting Feng, Wen Pan y Zhen-yu Song por su asistencia técnica.

La investigación fue apoyada por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Subvención No. 81601784) y el Desarrollo del Programa Académico Prioritario de las Instituciones de Educación Superior de Jiangsu. Este proyecto también contó con el apoyo del Laboratorio Clave de Biología de Parásitos y Vectores del Ministerio de Salud con la subvención n.º WSBKFKT-201710.

Yao Wang y Qianqian Zhang han contribuido igualmente a este trabajo.

Facultad de Biología y Ciencias Médicas Básicas, Universidad de Soochow, No.199 Renai Road, Suzhou, 215123, República Popular China

Yao Wang, Wanruo Zhang y Xia Zhou

Institutos de Biología y Ciencias Médicas, Laboratorio Clave de Infección e Inmunidad de Jiangsu, Universidad de Soochow, No.199 Renai Road, Suzhou, 215123, República Popular de China

Qianqian Zhang y Jianfeng Dai

Instituto Nacional de Enfermedades Parasitarias, Centro Chino para el Control y la Prevención de Enfermedades (Centro Chino para la Investigación de Enfermedades Tropicales), Laboratorio Clave de Biología de Parásitos y Vectores, Comisión Nacional de Salud de la República Popular China (NHC), Organización Mundial de la Salud (OMS) Colaboración Centro de Enfermedades Tropicales, Centro Nacional de Investigación Internacional sobre Enfermedades Tropicales, Shanghai, 200025, China

Junhu Chen

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XZ y JD concibieron el estudio, recopilaron y analizaron los datos y redactaron el manuscrito. YW, QQZ y WRZ llevaron a cabo todo el experimento y revisaron el manuscrito. JHC concibió el proyecto y brindó apoyo técnico para la recopilación y el análisis de datos. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Jianfeng Dai o Xia Zhou.

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con los principios de uso ético de animales para laboratorio médico del Ministerio de Salud de la República Popular China y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Soochow para el uso de animales de laboratorio ( Número de permiso: ECSU-201800091). Todos los autores han leído y aprobado el manuscrito final.

Todos los autores dieron su consentimiento para publicar el artículo.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Secuencia de aminoácidos de la proteína diana Bm8 (indicada en línea como “proteína de Plasmodium conservada, función desconocida”).

Expresión y purificación de rBm8. Una purificación de rBm8 confirmada mediante electroforesis en SDS-PAGE, cargando con rBm8 sin etiqueta GST con un PM de aproximadamente 57 KDa. B Ensayo de transferencia Western del rBm8 purificado: a sondado con suero de ratón normal, b sondado con anti-B. suero de ratones microti. La flecha roja indica la posición de la banda de la proteína objetivo Bm8.

Figura S2: Predicción del epítopo lineal del antígeno Bm8 y síntesis del péptido diana (CYDPEKSNSAEW). Un análisis antigénico de Bm8, con cinco antígenos principales predichos. B Informe de síntesis del péptido diana. C Preparación de antisuero de conejo del péptido diana.

Figura S3: Evaluación de la afección de la inmunidad activa. En cada grupo, se utilizaron 5 ratones para configurar los modelos de inmunización activa. El grupo de control fue inmunizado con un adyuvante equivalente. A Determinación del título de anticuerpos inmunes activos del polipéptido Bm8 (antes de la infección por provocación con B. microti). B Determinación del título de anticuerpos inmunes activos del polipéptido Bm8 (antes de la infección por desafío con P. berghei).

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Reimpresiones y permisos

Wang, Y., Zhang, Q., Zhang, W. et al. Una proteína conservada de Babesia microti provoca una protección parcial contra la infección por Babesia y Plasmodium. Vectores de parásitos 16, 306 (2023). https://doi.org/10.1186/s13071-023-05825-x

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Recibido: 02 de marzo de 2023

Aceptado: 28 de mayo de 2023

Publicado: 30 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s13071-023-05825-x

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