La disminución de la adhesión al endotelio conduce a un recuento elevado de granulocitos de neutrófilos en pacientes con angioedema hereditario

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 13366 (2023) Citar este artículo

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Dado que muchos aspectos del angioedema hereditario (AEH) debido a la deficiencia del inhibidor C1 (INH-C1) (AEH-C1-INH) no pueden explicarse únicamente con un nivel elevado de bradicinina, recientemente ha quedado claro que otros factores también desempeñan un papel importante en la patogénesis. Uno de estos factores podría ser el recuento elevado de granulocitos (NG) de neutrófilos, que se asocian con una mayor activación de NG en pacientes con AEH-INH-C1; sin embargo, hasta el momento no se ha dilucidado su origen. Aquí, nuestro objetivo fue investigar si el exceso de NG se debe a una maduración alterada, un equilibrio sesgado del grupo circulante/marginado o una eliminación reducida. Inscribimos a 20 pacientes con C1-INH-HAE libres de ataques junto con 21 controles sanos y recolectamos muestras de sangre. Comparamos marcadores de maduración de la superficie celular, moléculas de adhesión, receptores de citoquinas y movilización de Ca2+ de NG mediante citometría de flujo, marcadores de activación mediante ELISA y adhesión de NG/células endoteliales mediante un sistema de pipeteo automatizado. Los marcadores de la superficie celular mostraron una maduración normal de los NG en pacientes con AEH-INH-C1. La adhesión de los NG a las células endoteliales pretratadas con lipopolisacárido o forbol 12-miristato 13-acetato fue significativamente más débil en muestras de pacientes con C1-INH-HAE y la bradicinina no tuvo ningún efecto sobre la adhesión. Los NG de pacientes con C1-INH-HAE estaban en un estado activado cuando se evaluaron mediante marcadores de activación solubles sin ninguna estimulación. Nuestros datos respaldan que la maduración de los NG en pacientes con C1-INH-HAE es normal, mientras que las propiedades de adhesión de los NG derivados del paciente al endotelio se reducen en comparación con las de los controles sanos, lo que indica un sesgo entre los grupos de NG circulantes y marginados en pacientes. Es posible que la bradicinina no sea responsable de la reducción de las propiedades de adhesión de los NG.

El angioedema hereditario (AEH) debido a la deficiencia del inhibidor de C1 (INH-C1) (AEH-C1), un tipo de angioedema mediado por bradicinina (BK), es un raro trastorno hereditario autosómico dominante caracterizado por una inflamación intermitente e impredecible del tejido subcutáneo. y/o tejidos submucosos. Diferentes mutaciones en el gen SERPING1 dan como resultado una producción reducida de INH-C1 o una proteína1 disfuncional.

C1-INH juega un papel importante en la regulación de la permeabilidad vascular y la inflamación. El endotelio vascular tiene un papel importante en la patogénesis del C1-INH-HAE. C1-INH inhibe varias serina proteasas plasmáticas en las vías clásica y del complemento de lectina, coagulación intrínseca (sistema de contacto), fibrinolítica y cinina-calicreína2. Estos sistemas enzimáticos plasmáticos se activan en la deficiencia de C1-INH y se liberan una serie de sustancias que en conjunto aumentan la permeabilidad vascular por extravasación de plasma a los tejidos. La BK, generada en el sistema cinina-calicreína (KKS), es el principal mediador vasoactivo3. Los procesos bioquímicos que tienen lugar en el plasma están bien estudiados. Se dispone de datos limitados sobre el papel de las células endoteliales (CE) y los elementos celulares en la sangre durante la patogénesis de C1-INH-HAE, en parte porque se necesitarían sistemas experimentales in vitro específicos para estudiar estos tipos de células.

Anteriormente, nuestro grupo de investigación descubrió que el recuento de glóbulos blancos (WBC) (1,58 veces), y especialmente el recuento de granulocitos neutrófilos (NG) (1,95 veces), era significativamente mayor de lo esperado a partir de la hemoconcentración calculada únicamente a partir de la diferencia en el recuento de glóbulos rojos4. También investigamos este fenómeno de manera más detallada y descubrimos que los pacientes con C1-INH-HAE tenían niveles más altos de NG incluso en un estado asintomático que los controles sanos. Además, las mediciones de mieloperoxidasa (MPO) y elastasa de neutrófilos (ELA2) mostraron que los NG en pacientes con C1-INH-HAE en estado asintomático estaban más activados que aquellos en controles sanos. La activación de los NG fue aún más significativa en los estados prodrómicos y de ataque5,6.

Los NG son la principal población de leucocitos en la sangre. Su función principal es la fagocitosis rápida y eficaz de patógenos extracelulares, principalmente bacterias y hongos, y la posterior destrucción de microbios. Se pueden observar recuentos elevados de NG en varias enfermedades; sin embargo, pocos procesos fisiopatológicos son directamente responsables de la neutrofilia. En primer lugar, en caso de granulopoyesis excesiva, salen más NG de la médula ósea; sin embargo, en este caso, los progenitores de neutrófilos también se pueden encontrar en la circulación, caracterizados por una morfología nuclear (es decir, promielocitos, mielocitos, metamielocitos y formas en bandas) y marcadores de maduración de la superficie celular (CD11b, CD13, CD16 y CD66b). El recuento de NG también puede estar elevado si la vida media normal, bastante corta, de los neutrófilos se prolonga de alguna manera (defecto en la maquinaria de muerte celular programada, o un defecto en el mecanismo de destrucción celular, que frecuentemente se asocia con la muerte de neutrófilos). Finalmente, la neutrofilia puede ser causada por una adhesión reducida a las CE, lo que resulta en menos NG en los tejidos y adherencia a las paredes de los vasos.

Como nuestra hipótesis inicial del estudio actual (visualizada en la Fig. 1), probamos todas las posibilidades mencionadas anteriormente. Nuestro objetivo fue investigar la presencia de progenitores de NG, la expresión de moléculas de adhesión y receptores de citocinas, la producción de moléculas/sistemas efectores de NG, como MPO, trampa extracelular de neutrófilos (NET), ELA2, proteinasa 3 (PRTN3) y especies oxidativas reactivas. (ROS), la movilización de Ca2+ intracelular en respuesta a N-formilmetionil-leucil-fenilalanina (fMLP) y BK, y la comparación de las características adhesivas con las CE en pacientes con AEH-INH-C1 y controles sanos.

Resumen del estudio. (A) Hipótesis del estudio. (B) Diseño del estudio con métodos. (creado con BioRender.com).

Observamos una tendencia a una mediana más alta del recuento de NG en las muestras de C1-INH-HAE que en las muestras de control (la mediana y los rangos intercuartílicos fueron 2431 NG/μl (1764,47; 2909,18) frente a 2002 NG/μl (1756,12; 2522,92), respectivamente mediante citometría de flujo, sin embargo, la diferencia no fue estadísticamente significativa (prueba de Mann Whitney p = 0,1035).

Para probar si la neutrofilia es causada por una tasa elevada de eflujo de la médula ósea, medimos los marcadores de maduración de NG CD11b, CD13, CD16, CD33, CD66b, CD182 y CD184 mediante citometría de flujo. No encontramos diferencias significativas en la expresión de estos marcadores entre los controles sanos y los pacientes con C1-INH-HAE (Figura 1 complementaria y Tabla 1 complementaria).

Los NG (después de su preparación a partir de sangre) se unen a la anexina V, lo que indica su susceptibilidad a la endocitosis por parte de los macrófagos. Aunque los NG de pacientes con AEH-INH-C1 se unieron ligeramente menos a Anexina V que los NG de los controles (medianas de intensidad de fluorescencia (MFI) y rangos intercuartílicos: 18,5 [6,2–39,5] frente a 38,8 [9,3–60,7]), la diferencia no fue estadísticamente significativo (p = 0,1826, prueba de Mann-Whitney) (Figura complementaria 1).

También evaluamos el patrón de las moléculas de adhesión más importantes y los receptores de citoquinas que regulan la adherencia de neutrófilos/células endoteliales o neutrófilos/células estromales. Encontramos una diferencia estadísticamente significativa pero menor en la expresión de CD61 (Figura 1 complementaria y Tabla 1 complementaria, p = 0,0071).

Las NG son un tipo de célula muy sensible y la preparación de NG puede modificar fácilmente las funciones de los neutrófilos. El agotamiento rápido de los glóbulos rojos de la sangre anticoagulada con EDTA que carece de múltiples pasos de centrifugación puede preservar las funciones de los neutrófilos mejor que otros métodos que implican múltiples pasos de centrifugación. Por lo tanto, para verificar que los NG conservaran su función después de la preparación, realizamos mediciones de movilización de Ca2+ tanto en sangre sin glóbulos rojos como en NG purificados mediante citometría de flujo y un lector de placas de fluorescencia, respectivamente. Como el efecto de movilización de Ca2+ intracelular de fMLP medido por citometría de flujo fue muy similar al observado en NG purificados medidos con un lector de placas de fluorescencia (Fig. 2A, B, C, D), las preparaciones de NG purificadas parecían ser funcionales.

Medición de la movilización de Ca2+ intracelular a partir de sangre empobrecida en glóbulos rojos y de NG aislados. Se usó ionóforo de Ca como control positivo y la señal de fluorescencia inducida por otros agentes se expresó como el porcentaje de la señal de fluorescencia inducida por ionóforo de Ca. Se marcó una alícuota de sangre lisada con ACK con 1 µM de Fluo-4-AM. A continuación, se midieron 300 µl de suspensión celular marcada con Fluo-4-AM usando un citofluorímetro CytoFlex, se agregaron 30 µl de ionóforo de Ca 1 µM o 30 µl de fMLP 1 µM 20 s después de que se inició la medición y se recogieron los datos. durante 5 min. (A) La movilización de Ca2+ intracelular se midió mediante citometría de flujo (sangre total, puerta de granulocitos) y se calculó la integral del área bajo la curva. (B) Las intensidades de señal máximas se calcularon a partir de la medición de la movilización de Ca2+ intracelular con citometría de flujo (sangre completa, puerta de granulocitos). Se sembraron NG teñidos con Fluo-4-AM en una concentración de 2 x 105 células/pocillo en una placa inferior negra en forma de V de 96 pocillos. Utilizamos 0,1 μM de fMLP, 1 μM de Ca-ionóforo (calcimicina), 20 μM y 2 μM de BK en HBSS como tratamientos en una medición cinética de 3 minutos en tres paralelos. (C) Se midió la movilización de Ca2+ intracelular con un lector de microplacas (granulocitos neutrófilos aislados) y se calculó la integral del área bajo la curva (3 paralelos/sujeto). (D) Las intensidades de señal máximas se calcularon a partir de la medición de la movilización de Ca2+ intracelular con un lector de microplacas (granulocitos neutrófilos aislados, 3 paralelos/sujeto). Los NG de los pacientes se indican con puntos rojos; Los NG de controles sanos se indican con puntos azules. BK= bradicinina; fMLP= N-formilmetionil-leucil-fenilalanina. Utilizamos la prueba de Mann-Whitney (A, B) y ANOVA de dos factores (C, D) para el análisis estadístico.

Después de validar la función de las NG purificadas, utilizamos un lector de placas de fluorescencia para detectar la movilización de Ca2+ en las NG aisladas. fMLP indujo una movilización de Ca2+ igualmente alta (normalizada a la respuesta del ionóforo de Ca (calcimicina), 1 μM) en NG de pacientes y controles. BK en una concentración de 20 μM indujo una movilización de Ca2+ significativa (tratamientos p < 0,0001) pero más moderada en ambos grupos de estudio que en fMLP (Fig. 2C,D), pero no hubo diferencias en la movilización de Ca2+ entre los NG de pacientes y controles. .

Examinamos el estado de activación básico y la capacidad de activación de NG de pacientes y controles. Medimos los marcadores de activación de NG en sobrenadantes de células y descubrimos que los NG de los pacientes produjeron MPO, ELA2 y NET significativamente más altos en comparación con los NG de los controles (Fig. 3A, B, C, D, controles versus pacientes p = 0,0004, p = 0,0125 , p = 0,0027, respectivamente). Independientemente de su origen, las células produjeron niveles significativamente más altos de MPO, ELA2 y NET durante 24 h de tratamiento que 4 h de tratamiento (4 h vs. 24 h p <0,0001, p <0,0001, p <0,0001, respectivamente). También medimos la producción de ROS de NG. Aunque los distintos estímulos dieron como resultado una producción de ROS bastante diferente (es decir, aumentada con forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) mientras que disminuida con BK), encontramos que los NG de los pacientes produjeron más ROS que los NG de los controles, ya sea en presencia o ausencia. de cualquier tratamiento (Fig. 3E, controles vs. pacientes p = 0,0265).

Estado de activación y activabilidad de granulocitos neutrófilos aislados de pacientes y de controles sanos. Niveles de (A) mieloperoxidasa (MPO), (B) trampa extracelular de neutrófilos (NET), (C) proteinasa 3 (PRTN3) y (D) elastasa de neutrófilos (ELA2) producida por neutrófilos aislados, (E) producción de ROS por neutrófilos Se midieron los granulocitos. Para los paneles A, B, C y D, se sembraron 5 × 105 NG/pocillo en placas inferiores en forma de U de 96 pocillos. Las células se trataron con 100 ng/ml de LPS, 50 µM de HIS, 2 µM y 20 µM de BK o 100 nM de PMA en 200 µl de medio RPMI. Las células se incubaron a 37 °C en una incubadora de CO2 durante 4 o 24 h. Después de la incubación, el sobrenadante se recogió y se centrifugó a 10.000 g durante 10 minutos para sedimentar los restos celulares. El sobrenadante recogido se dividió en alícuotas y se almacenó a -80 °C hasta su uso. Para el panel E, se sembraron 0,5 × 105 NG/pocillo en una placa inferior negra en forma de V de 96 pocillos. Utilizamos 100 nM de PMA, 20 μM y 2 μM de BK, y 100 nM de PMA + 20 μM de BK juntos disueltos en HBSS como tratamiento. Como sustrato utilizamos 50 μM de Amplex Ultra Red (AUR) + 0,2 U/ml de peroxidasa de rábano picante/pocillo en una medición cinética de 25 min en dos paralelos. La pendiente de la curva cinética (calculada con GraphPad Prism v9.1.2 mediante regresión lineal) fue proporcional al H2O2 producido por los NG. Los NG de los pacientes se indican con puntos rojos; Los NG de controles sanos se indican con puntos azules. C = control, LPS = lipopolisacárido, HIS = histamina, BK = bradicinina, PMA = forbol 12-miristato 13-acetato. Utilizamos ANOVA de tres vías (A, B, C, D, E) para el análisis estadístico.

También examinamos si podíamos encontrar alguna diferencia entre la propiedad de adhesión de los NG de pacientes o controles. La adhesión se evaluó de acuerdo con cuatro variables: (a) origen de los NG: controles frente a pacientes, (b) presencia frente a ausencia de C1-INH, (c) tratamiento de los CE frente a cotratamiento de los CE y NG, y (d ) diferentes estímulos de activación, consideramos estos resultados como valores medios +/− SD en la Fig. 4A. Para simplificar, todos los valores de p se muestran en la Fig. 4A,C. Descubrimos que tanto el lipopolisacárido (LPS) como el PMA aumentaron significativamente la adhesión de NG a las CE, independientemente del origen de los neutrófilos, la presencia de C1-INH y el tipo de célula tratada. Curiosamente, 20 μM de BK solo aumentaron moderadamente la adhesión cuando las EC y NG se trataron conjuntamente durante 1 h (Fig. 4A). Para analizar más a fondo las propiedades de adhesión, agrupamos los datos de adhesión por estímulo (variable d), realizando un ANOVA de tres vías utilizando las otras tres variables (variables a, byc) (Fig. 4B). Descubrimos que los NG de los pacientes se vinculaban menos a las CE que los NG de los controles para todos los estímulos (variable a). Se encontraron NG más adherentes cuando solo las CE fueron tratadas con LPS durante 24 h que cuando las CE y las NG fueron cotratadas durante 1 h (variable c). Curiosamente, el tratamiento con 20 μM de BK dio como resultado NG más adherentes cuando las CE y las NG se trataron conjuntamente durante 1 h que cuando solo se trataron las CE durante 24 h (variable c). Encontramos una interacción significativa entre el origen de las NG y el tipo de tratamiento de células diana solo para el tratamiento con LPS (variable a ↔ c) (Fig. 4C). Sorprendentemente, la presencia o ausencia de C1-INH no influyó en la adhesión entre EC y NG (variable b).

Adhesión de granulocitos neutrófilos a células endoteliales. Cultivamos células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) en placas de 96 pocillos con una confluencia del 100 %. Utilizamos 100 ng/ml de LPS, 50 μM de histamina, 20 μM o 2 μM de BK o 100 nM de PMA como tratamiento en presencia o ausencia de C1-INH (200 μg/ml). Tratamos HUVEC durante 24 h o cotratamos HUVEC y NG durante 1 h. Marcamos 17 × 106 NG con tinte verde Oregón (2 μg/ml). Agregamos 0,5 × 106 NG teñidos con verde Oregon/pocillo a la placa cubierta con HUVEC. Después de la incubación conjunta de los dos tipos de células durante 1 h, se eliminaron los NG no adherentes utilizando un sistema de pipeteo automatizado (EpMotion 5070, dispositivo de pipeteo automático Eppendorf SE) y se midió la señal de fluorescencia residual de los NG marcados con Oregon Green. (A) Se establecieron cuatro condiciones de evaluación de la adhesión según la preestimulación y la presencia de C1-INH. En cada grupo, la adhesión en respuesta a diferentes estímulos se normalizó con respecto a su propio control no estimulado. Se presentan los valores de adhesión medios relativos (+/- DE) de pacientes y controles, y se realizaron pruebas estadísticas ANOVA unidireccionales. (B) Para mostrar los efectos de cada estímulo según la fuente de NG (pacientes o controles), la presencia o ausencia de C1-INH y las células tratadas (es decir, CE durante 24 h o NG y CE cotratadas durante 1 h ), se utilizó un formato de diagrama de dispersión y se realizó un análisis ANOVA de tres factores. Los pacientes se indican con puntos rojos; Los controles sanos se indican con puntos azules. (C) La tabla resume los valores p significativos del ANOVA de tres vías. C = control, LPS = lipopolisacárido, HIS = histamina, BK = bradicinina, PMA = forbol 12-miristato 13-acetato.

Cuando hace unas décadas se comenzó a investigar la patogénesis del angioedema (especialmente C1-INH-HAE), C1-INH y BK se convirtieron en el foco de la investigación. Posteriormente, las CE resultaron tener suma importancia en la patogénesis7,8,9. Aunque investigaciones exhaustivas han revelado muchos detalles sobre esta enfermedad, todavía quedan sin respuesta varias preguntas importantes, como el recuento elevado de NG y el estado de NG activado en pacientes con AEH-INH-C1.

En el estudio actual, observamos una tendencia hacia recuentos elevados de neutrófilos en pacientes con AEH-INH-C1, similar a nuestros resultados anteriores4,5,6; sin embargo, la diferencia no fue estadísticamente significativa. Una posible razón para esta discrepancia es que realizamos el recuento de NG después de un protocolo de aislamiento de neutrófilos de varios pasos. Este proceso provocó una variación significativa en el recuento de NG medido. La segunda razón es el bajo tamaño de la muestra. En nuestro estudio actual, realizamos extensos ensayos in vitro, lo que nos permitió incluir solo un número limitado de pacientes y controles, lo que reduce el poder de las estadísticas.

Tak et al.10 y Summers et al.11 resumieron varios procesos fisiopatológicos distintos que pueden ser la base de recuentos elevados de NG. En primer lugar, los recuentos elevados de NG podrían ser consecuencia de una tasa elevada de generación de neutrófilos en la médula ósea y/o de la elevada movilización de neutrófilos desde la médula ósea. Nuestros resultados basados en citometría de flujo mostraron que la maduración de los neutrófilos era normal en pacientes con AEH-INH-C1.

La vida media circulatoria y la eliminación de NG de los grupos circulantes y marginados también pueden afectar el recuento de NG. Los macrófagos en el bazo y el hígado absorben fácilmente los NG senescentes, en los cuales CXCR4 y P-selectina regulan la localización y la fagocitosis inducida por fosfatidilserina a través de la anexina V son componentes clave11. La expresión de CXCR4 y P-selectina, así como la capacidad de unión a Anexina V, fueron similares en NG aislados de pacientes con C1-INH-HAE y controles sanos; además, no hubo diferencias en la muerte celular espontánea según lo evaluado mediante la incorporación de 7AAD, lo que sugiere que la eliminación de NG parece estar intacta en pacientes con C1-INH-HAE.

Aunque el grupo marginado de NG puede comprender casi el 50% de los NG intravasculares11, no es fácil estudiar esta fracción. No encontramos diferencias entre la expresión de moléculas de adhesión y receptores de quimiocinas en los NG de pacientes con C1-INH-HAE en comparación con su expresión en los NG de controles sanos; sin embargo, ciertamente no se evaluó la expresión de receptores/ligandos asociados por parte de las CE.

Cuando examinamos el estado de activación de los NG en ausencia de estímulos, se encontró que los NG de los pacientes estaban más activados que los de los controles, lo que concordaba completamente con nuestros estudios anteriores5,6. Ehrenfeld et al.12 revisaron el efecto de las cininas sobre las NG durante la inflamación y encontraron que la estimulación del receptor B1 de BK provoca una rápida activación de las proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPK) ERK1/2 y p38, lo que lleva a la exocitosis de la activación de NG. marcadores (por ejemplo, MPO). Curiosamente, en contraste con las citas anteriores, la estimulación con BK no tuvo ningún efecto o incluso inhibió la activación de NG en nuestro estudio, aunque 20 µM de BK indujeron una movilización de Ca2+ intracelular esperada. En un estudio reciente, describimos complejos calicreína/INH-C1 elevados en pacientes con INH-C1 y AEH (durante períodos libres de síntomas) en comparación con controles sanos y también al inicio de los ataques de AEH (período de seguimiento cinético)13. También está bien establecido que la activación de KKS puede ocurrir en la superficie de NG y NET5,14,15. Teniendo en cuenta el efecto de las enzimas BK y KKS sobre los NG y el efecto de la actividad de NG sobre los KKS, no podemos decidir si los NG o sus productos NET inducen la activación de KKS durante los ataques de AEH o, por el contrario, la activación de KKS atrae y activa los NG, pero estos Los resultados sugieren un bucle de amplificación entre la activación de NG y KKS. Los antecedentes de esta desafiante interacción requieren investigaciones más exhaustivas.

Encontramos resultados muy similares cuando probamos las propiedades de adhesión de NG a EC con nuestro ensayo de adhesión recientemente desarrollado: curiosamente, BK tuvo ningún efecto o tuvo un efecto insignificante sobre la adhesión de NG a EC.

En contraste con este efecto menor de BK sobre la adhesión celular, los NG no estimulados de los pacientes se adhirieron menos a la superficie de las CE que los de los controles. Cuando utilizamos estímulos de LPS o PMA en las CE, la diferencia de adhesión entre las NG adheridas a la superficie de pacientes con C1-INH-HAE y los controles fue mucho más sorprendente. Además, la diferencia en las propiedades de adhesión no fue causada por ninguna serina proteasa inhibible por C1-INH liberada por los NG o por el propio C1-INH, ya que C1-INH no tuvo ningún efecto sobre la adhesión. Nuestros hallazgos contrastan con los resultados de Cai et al.16, quienes encontraron en un sistema in vitro que el C1-INH puede unirse a las selectinas E y P en la superficie de las HUVEC y, a través de esta interacción, puede prevenir la adhesión de los leucocitos. La diferente configuración del estudio puede explicar esta contradicción; por ejemplo, Cai et al. Usamos HBSS puffer durante la incubación, mientras que usamos medios MCDB con contenido de FBS.

Dado que en nuestros experimentos de adhesión funcional, no encontramos diferencias en la fuerza de adhesión cuando tratamos las CE solas o cuando tratamos conjuntamente las CE y las NG, y que el patrón de las moléculas de adhesión superficial de las NG fue muy similar en pacientes con C1-INH-HAE y en los controles, podemos anticipar que los tratamientos afectaron principalmente las propiedades de adhesión de las CE y no las de las NG. Sugeriría que las CE o el plasma de pacientes con C1-INH-HAE portan un factor que cambia la adhesión CE/NG. Un factor podría ser la E-selectina soluble (sE-selectina), una molécula de adhesión desprendida de las CE. El papel potencial de la sE-selectina también puede estar respaldado por nuestros hallazgos previos: describimos concentraciones elevadas de sE-selectina en el plasma de pacientes con C1-INH-HAE17, que se elevó aún más durante los ataques18 y puede actuar como una molécula señuelo para la E-EH. ligandos de selectina. La diferente cobertura de las moléculas de adhesión involucradas en la unión de los NG a la pared del vaso puede causar una relación sesgada de NG entre los grupos marginados y los que circulan libremente en pacientes con C1-INH-HAE. Esta hipótesis de adhesión alterada entre las CE y los neutrófilos fue respaldada aún más por nuestros experimentos previos de adhesión in vitro, donde la adhesión de las células dPLB-985 (que son células diferenciadas similares a los neutrófilos) a las CE fue totalmente inhibida por la sE-selectina19. Además, Ruchaud-Sparagano et al.20 encontraron que la sE-selectina podría aumentar la producción de ROS de los NG, y también encontramos que la producción de ROS aumentó en los NG de pacientes en comparación con los de controles sanos.

Nuestro estudio tiene varias limitaciones. En primer lugar, el tamaño de la muestra es muy pequeño (C1-INH-AEH es una enfermedad rara y la mayoría de los pacientes utilizan varias terapias profilácticas), aunque nuestra población de estudio es bastante grande y está más emparejada por edad y sexo que otros estudios. en el campo C1-INH-HAE. Otra limitación es que nuestro estudio solo investigó los NG pero no los EC en la parte del estudio de adhesión celular. Esto se debe a que no existe ningún método para obtener células endoteliales de pacientes con C1-INH-HAE. Además, debido a la naturaleza retrospectiva de nuestro estudio, no podemos incluir algunos controles adicionales y análisis más profundos (como la expresión de la ECA de neutrófilos o el uso de icatibant, un potente antagonista del receptor 2 de BK).

Nuestros resultados, junto con la falta de evidencia de inflamación crónica en los pacientes con AEH-INH-C121, sugieren que los recuentos elevados de NG en estos pacientes pueden ser causados por una adhesión alterada a las CE que sesga la proporción entre los grupos marginados y circulantes, mientras que solo un La activación leve de las NG circulantes se produce como consecuencia de serina proteasas plasmáticas más activas y/o de los niveles elevados de selectina E soluble. Se desconoce en gran medida si esta activación leve de los NG tiene consecuencias positivas o negativas para los pacientes con INH-AEH C1, pero vale la pena investigar más a fondo.

En el estudio se inscribieron veinte pacientes con INH-AEH C1 tratados y seguidos en el Centro Húngaro de Referencia y Excelencia de Angioedema (Budapest, Hungría) y 21 controles sanos de la misma edad y sexo. El diagnóstico de los pacientes con AEH-INH-C1 se basó en los antecedentes familiares, el historial médico del paciente, el examen físico y dos pruebas de laboratorio del complemento completo [cascada clásica del complemento total, C3, C4, nivel de concentración de INH-C1 y actividad funcional de INH-C1, anticuerpos anti-C1-INH (IgA, M, G)] realizados con 1 a 2 meses de diferencia. En todos los casos se realizó análisis genético del gen SERPING1. Se recogieron muestras de sangre completa de controles y de pacientes con INH-AEH libres de ataque en tubos que contenían EDTA (3 ml) y 5 ml de PBS + 100 µl de heparina sódica (25 000 UI) que contenían un tubo de centrífuga (35–45 ml) entre 09/01/2020 y 30/06/2021. Los pacientes con INH-C1 no habían tomado concentrado de INH-C1 ni icatibant en los 5 días anteriores a la recogida de la muestra. Los controles sanos no tomaban ningún medicamento ni estaban bajo ningún tratamiento médico. Todos los sujetos dieron su consentimiento informado de acuerdo con la Declaración de Helsinki. El protocolo del estudio fue aprobado por la autoridad reguladora húngara (BPR/021/03928–8/2014). Los datos demográficos detallados de pacientes y controles se resumen en la Tabla 1.

Recogimos 35-45 ml de sangre en un tubo de centrífuga de 50 ml que contenía 5 ml de PBS + 100 μl de heparina sódica (25.000 UI) con una aguja de 18G sin el uso de vacío. Agregamos 5 ml de dextrano al 6% (Dextrano de Leuconostoc spp. Mr 450.000–650.000, Sigma-Merck) y lo mezclamos con sangre. Después de la sedimentación durante 15 a 30 minutos, la fracción de plasma se pipeteó en un tubo de centrífuga nuevo y se centrifugó a 1500 rpm, a temperatura ambiente durante 5 minutos. Se aspiró el sobrenadante y se añadieron 5 ml de HBSS-Prep (HBSS sin Ca2+ y Mg2+ suplementado con 20 mM de HEPES) y las células se mezclaron suavemente. Las células se colocaron en capas sobre 5 ml de Ficoll (GE 17-1440-02, Merck KGaA, Alemania), luego se centrifugaron a 2500 rpm, a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se aspiró el sobrenadante, se añadieron 10 ml de HBSS-Prep y luego las células se centrifugaron (5 min, temperatura ambiente, 1500 rpm). Después de la aspiración del sobrenadante, se agregaron 5 ml de NaCl al 0,2 % para la lisis de los glóbulos rojos (RBC) durante 60 s, luego se agregaron 5 ml de NaCl al 1,6 % para detener la lisis. Las células se centrifugaron (5 min, temperatura ambiente, 1500 rpm). Se aspiró el sobrenadante y las células se lavaron dos veces con 10 ml de HBSS-Prep. Después de la segunda centrifugación, se añadió 1 ml de HBSS-Prep y se contaron las células. Cambiamos el tampón HBSS-Prep inmediatamente antes de usar las células en diferentes experimentos.

Utilizamos 0,5 × 105 NG/pocillo en una placa inferior negra en forma de V de 96 pocillos. Utilizamos 100 nM de PMA, 20 μM y 2 μM de BK, y 100 nM de PMA + 20 μM de BK juntos disueltos en HBSS como tratamientos. Como sustrato utilizamos 50 μM de Amplex Ultra Red (AUR) + 0,2 U/ml de peroxidasa de rábano picante/pocillo en una medición cinética de 25 min en dos paralelos. Calculamos la pendiente para cada pocillo en GraphPad Prism v9.1.2 (GraphPad Software Inc.) mediante regresión lineal ajustada a los datos de medición cinética y utilizamos la pendiente calculada como el valor de la producción de ROS.

Utilizamos 2 × 105 NG/pozo teñidos con Fluo-4-AM (F14217 Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, 1:500) en una placa inferior negra en forma de V de 96 pocillos. Utilizamos 0,1 μM de fMLP, 1 μM de Ca-ionóforo (calcimicina, sal de hemimagnesio de ionóforo de calcio A23187, C9400, Sigma-Aldrich), 20 μM y 2 μM de BK en HBSS como tratamientos en una medición cinética de 3 minutos en tres paralelos. Se utilizó Ca-ionóforo como control positivo y las señales de fluorescencia causadas por otros agentes se presentaron como porcentaje de la señal de fluorescencia causada por Ca-ionóforo.

Cultivamos células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) en placas de 96 pocillos con una confluencia del 100 % (como modelo de la pared del vaso). Utilizamos 100 ng/ml de LPS, 50 μM de histamina (HIS), 20 μM o 2 μM de BK o 100 nM de PMA como tratamiento en presencia o ausencia de C1-INH (200 ug/ml). Tratamos HUVEC durante 24 h o cotratamos HUVEC y NG durante 1 h. Marcamos 17 × 106 células NG con tinte verde Oregón (CellTrace™ Oregon Green™ 488 carboxi-DFFDA, SE, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, 1 mg/ml) en una dilución 1:500 (HBSS-Prep) y las incubamos a 4 ºC durante 20 min. Luego, centrifugamos las células a 1500 rpm durante 5 min. Incubamos las células en 5 ml de HBSS-Prep a 4 ° C durante 20 minutos, las resuspendimos en 1 ml de medio de cultivo celular MCDB después de la centrifugación y las contamos. Agregamos 0,5 × 106 NG teñidos con verde Oregon/pocillo a la placa cubierta con HUVEC. Después de la coincubación de los dos tipos de células durante 1 h, se eliminaron los NG no adherentes utilizando un sistema de pipeteo automatizado (EpMotion® 5070, dispositivo de pipeteo automático Eppendorf SE que proporciona fuerzas de vacío uniformes a cada pocillo) y se midió la señal de fluorescencia residual. para NG con etiqueta Oregon Green.

Sembramos 5 × 105 NG/pocillo en placas inferiores en forma de U de 96 pocillos. Las células se trataron con 100 ng/ml de LPS, 50 µM de HIS, 2 o 20 µM de BK o 100 nM de PMA en 200 µl de medio RPMI. Las células se incubaron a 37 °C en un termostato de CO2 durante 4 o 24 h. Después de la incubación, el sobrenadante se recogió y se centrifugó a 10.000 g durante 10 minutos para sedimentar los restos celulares. El sobrenadante recogido se dividió en alícuotas y se almacenó a -80 °C hasta su uso.

Para determinar los niveles de las enzimas mieloperoxidasa (MPO), elastasa de neutrófilos (ELA2) y proteinasa 3 (PRTN3), utilizamos KITS ELISA disponibles comercialmente de R&D Systems (DY3174, DY9167-05 y DY6134-05) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. . Para medir las trampas extracelulares de neutrófilos (NET), utilizamos un método ELISA interno publicado anteriormente5.

Las mediciones de fluorescencia (ROS-, Ca2+ intracelular -movilización- y adhesión) y OD (ELISA) se realizaron utilizando un lector de microplacas Infinite® M1000 PRO.

La sangre anticoagulada con EDTA se lisó con tampón de lisis de glóbulos rojos de amonio-cloruro-potasio (ACK) en la oscuridad a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después de la centrifugación, los sedimentos se llevaron al volumen de sangre original con PBS y se marcaron 50 µl de alícuotas con anticuerpos (para obtener más detalles, consulte la Tabla complementaria 2) durante 20 minutos, luego se lavaron y se midieron 100 000 células utilizando un citofluorímetro Beckman Coulter CytoFlex®. . Se marcó una segunda alícuota de sangre lisada con ACK con 1 μM de Fluo-4-AM (ThermoFisher) durante 30 minutos y se equilibró en HBSS durante 30 minutos. A continuación, se midieron 300 µL de suspensión celular marcada con Fluo-4-AM en un citofluorímetro CytoFlex®, se agregaron 30 µL de ionóforo de Ca 1 µM o 30 µL de fMLP 1 µM 20 s después de que se inició la medición y se recogieron los datos. durante 5 min. Se usó ionóforo de Ca como control positivo y la señal de fluorescencia inducida por otros agentes se expresó como el porcentaje de la señal de fluorescencia inducida por ionóforo de Ca.

Los datos se evaluaron utilizando CytExpert 2.4 y el software Kaluza® C. Se comparó el porcentaje de poblaciones positivas y negativas y/o los valores medios de intensidad de fluorescencia entre controles sanos y la población C1-INH-HAE.

Los resultados de las mediciones ELISA se analizaron e interpretaron utilizando GraphPad Prism v9.1.2 (GraphPad Software Inc.). El análisis estadístico se realizó mediante la prueba de normalidad de D'Agostino y Pearson, ANOVA de una vía, ANOVA de dos vías, ANOVA de tres vías y prueba de Mann-Whitney para la medición de ROS, medición de la movilización de Ca2+ intracelular con un lector de microplacas y mediciones de marcadores de activación. del sobrenadante celular y la adhesión de NG para la medición de CE.

Como la mayoría de las distribuciones no eran normales, utilizamos valores medianos de intensidad de fluorescencia. Calculamos la relación entre los valores medios de intensidad de fluorescencia para el marcador dado y su control de isotipo. Utilizamos estos índices y los comparamos (entre controles y pacientes con AEH) con la prueba t de Student en mediciones de citometría de flujo.

P < 0,05 se consideró estadísticamente significativo en cada caso.

Los conjuntos de datos generados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a solicitud razonable.

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