El cribado funcional genotipado de clones Fab solubles permite en

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 13107 (2023) Citar este artículo

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Los anticuerpos monoclonales (mAb) y sus fragmentos se utilizan ampliamente en terapéutica, diagnóstico e investigación básica. Aunque los métodos de presentación, como la presentación en fagos, ofrecen un alto rendimiento, las afinidades de los anticuerpos individuales deben medirse con precisión en formato soluble. Hemos desarrollado una plataforma de detección capaz de proporcionar datos funcionales genotipados de un total de 9216 clones de fragmentos de unión a antígeno (Fab) individuales y solubles mediante el empleo de secuenciación de próxima generación (NGS) con indexación jerárquica. Las secuencias de dominio variable pareadas (VL-VH) de longitud completa están vinculadas a datos de detección funcionales, lo que permite un análisis en profundidad de los efectos de las mutaciones. La plataforma se aplicó a cuatro proyectos de detección de scFv/Fab seleccionados por presentación en fagos y a un proyecto de maduración por afinidad de VH con saturación de sitio. La detección funcional genotipada permitió simultáneamente la identificación de mutaciones que mejoran la afinidad en el dominio VH de Fab 49A3 que reconoce la proteína no estructural 1 (NS1) del serotipo 2 del virus del dengue e informó sobre las posiciones de los residuos de VH que no se pueden cambiar desde el tipo salvaje sin disminuir la afinidad. La identificación basada en el genotipo nos reveló el alcance de la variación de la señal intraclonal inherente a los datos de detección de un solo punto, un fenómeno que a menudo se pasa por alto en el campo. Además, el cribado genotipado eliminó la selección redundante de genotipos idénticos para estudios posteriores y proporcionó una nueva herramienta de análisis para evaluar el éxito de las selecciones de presentación de fagos y la diversidad clonal restante en los repertorios examinados.

La ingeniería de anticuerpos recombinantes es una historia de éxito en el campo de la biotecnología. Los anticuerpos monoclonales (mAb) y sus fragmentos, como el fragmento variable monocatenario (scFv) y el fragmento de unión a antígeno (Fab), se utilizan ampliamente en terapéutica, diagnóstico y como herramientas para la investigación básica1. A medida que se descubren nuevas moléculas objetivo para estas aplicaciones, se necesitan aglutinantes nuevos o mejorados con alta afinidad, especificidad y propiedades fisicoquímicas deseadas.

El tamaño más pequeño de los fragmentos de anticuerpo y la falta del dominio Fc ofrecen varios beneficios en comparación con la IgG de tamaño completo, incluida una mejor penetración en el tejido2,3 y una menor posibilidad de interferencia en los ensayos de diagnóstico in vitro4. Desde el punto de vista de la ingeniería de anticuerpos, la principal ventaja de la estructura simple de los fragmentos de anticuerpos es su expresión económica y fácil en E. coli, lo que permite su uso en la presentación en fagos5. Las tecnologías avanzadas de biblioteca de genes de anticuerpos recombinantes6,7 combinadas con métodos de visualización de alto rendimiento ofrecen una manera eficiente de enriquecer aglutinantes contra una amplia variedad de objetivos8.

Aunque los métodos de presentación tienen un alto rendimiento, la afinidad y especificidad de los aglutinantes individuales deben evaluarse mediante la detección de una gran cantidad de anticuerpos individuales en formato soluble. En algunos estudios se ha informado de pérdida de especificidad después de que los fragmentos de anticuerpos presentados en fagos se convirtieran a un formato soluble9,10. Esto podría explicarse por la conformación alterada del scFv después de perder el soporte de la proteína pIII, que es la pareja de fusión más común del scFv para su visualización10. También hay informes sobre la pérdida de afinidad después de la conversión directa del formato scFv a IgG11,12, lo que limita en gran medida las áreas de aplicación de los anticuerpos descubiertos. Además, la multimerización involuntaria de scFv conduce a una unión más fuerte a través de efectos de avidez, lo que no es deseable en la selección o selección de solubles13,14. Sin embargo, los Fab generalmente se consideran moléculas monoméricas, lo cual es el formato de detección ideal para ensayos de afinidad y, aunque no se puede descartar la existencia de partículas de fagos con múltiples Fab mostrados, el riesgo de enriquecimiento debido a efectos de avidez es menor con Fab que con scFv. bibliotecas de fagos13. Además de una estimación fiable de la afinidad, el cribado soluble permite la identificación de clones con buenos niveles de expresión.

Los inmunoensayos ligados a enzimas (ELISA) y la secuenciación de Sanger se han utilizado comúnmente en la detección y caracterización de anticuerpos15,16,17. Después de la selección primaria, el subconjunto de aglutinantes más prometedor se puede utilizar directamente o mejorar aún más mediante la maduración por afinidad18,19,20. Si bien los métodos ELISA pueden ampliarse fácilmente, la secuenciación de las muestras analizadas mediante secuenciación Sanger rápidamente se vuelve antieconómica (el precio fijo de la muestra, para nuestro laboratorio, oscila entre \(\sim \) 4 y 6 € en el momento de escribir este artículo, incluida la purificación del ADN con Thermo GenJet miniprep Kit) y laborioso al aumentar el tamaño de la muestra. Tradicionalmente, sólo se secuencian un puñado de clones seleccionados antes de una caracterización adicional15,16,17 y, a menudo, los mismos clones enriquecidos se secuencian varias veces. Además, la selección de clones candidatos basándose en un único punto de datos ELISA de los ensayos de detección deja el análisis susceptible al sesgo causado por la variación de la señal, por ejemplo afectado por diferencias de expresión. La combinación de genotipos y fenotipos que ya se encuentran en la fase de selección expondría la variación de la señal intraclonal y evitaría la expresión y secuenciación repetidas e innecesarias. El uso de tecnologías de secuenciación de alto rendimiento (por ejemplo, Illumina) con etiquetado de índice cuádruple anidado21,22,23 permite secuenciar miles de muestras individuales en una sola ejecución de secuenciación. Debido a las etiquetas únicas, las muestras se pueden agrupar para la preparación de la biblioteca, lo que reduce considerablemente el precio por muestra a medida que aumenta el número de muestras.

La NGS ya se ha aplicado ampliamente a la ingeniería de anticuerpos24, por ejemplo, para evaluar la calidad de las bibliotecas de anticuerpos sintéticos25 y evitar el paso de selección principal observando el enriquecimiento de las secuencias de anticuerpos entre las rondas de selección26. Los conocimientos adquiridos con NGS también se han utilizado para desarrollar nuevos anticuerpos con estabilidad27, selectividad y afinidad mejoradas28. Si bien la mayoría de los estudios actuales se centran en la secuenciación de conjuntos de bibliotecas de anticuerpos, la NGS también se ha empleado para secuenciar clones de anticuerpos de células de hibridoma individuales clasificados por FACS mediante códigos de barras por PCR29.

Aquí, hemos desarrollado una plataforma de detección de Fab soluble lista para la automatización, que proporciona datos de unión funcional vinculados al genotipo de miles de clones de Fab individuales. Illumina NGS se utiliza con indexación cuádruple anidada para secuenciar genes de dominio variable de todos, hasta 9216 clones seleccionados funcionalmente. Los códigos de barras anidados vinculan las secuencias con sus ubicaciones físicas en las placas de detección ELISA. Los códigos de barras exteriores indican el número de placa, mientras que los códigos de barras interiores indican las coordenadas del pozo. Para secuenciar completamente los genes de la región variable Fab con secuenciación de lectura corta y mantener el enlace VH-VL, ambos dominios se etiquetan con índices internos (pocillos) idénticos y se secuencian utilizando el modo de extremos emparejados (301 + 301 bases de cada dirección). Nuestra hipótesis fue que al utilizar NGS en paralelo al cribado funcional, se podrían construir mapas completos de genofenotipo a partir de datos de cribado de bibliotecas de mutantes dirigidos al sitio. Se pueden identificar clones verdaderamente únicos a partir de los datos funcionales, lo que aumenta la precisión del cribado y evita la selección de genotipos repetidos para una caracterización más detallada. Además, es posible un análisis retrospectivo de la calidad de las selecciones y la preparación de la biblioteca.

Para crear una plataforma de detección Fab sólida, rentable y lista para la automatización, capaz de proporcionar datos funcionales vinculados al genotipo de miles de clones en masa, se desarrolló una estrategia jerárquica de códigos de barras de índice cuádruple. A partir de una biblioteca Fab enriquecida con presentación en fagos, expresada en E. coli, se inocularon colonias individuales desde placas de agar hasta una primera reacción de PCR en placas de 96 pocillos, y desde allí hasta las coordenadas de pocillos correspondientes en placas de expresión con medios de cultivo. En el primer paso de la PCR, los genes de los dominios VH y VL se amplifican en la misma reacción con cebadores personalizados (Tabla 1), que contienen pares de índices únicos para cada pocillo y un saliente para la hibridación del cebador de indexación Illumina TruSeq. Después de la PCR de indexación de pocillos, las muestras de una sola placa se pueden combinar y purificar como una sola muestra. En un segundo paso de la PCR, a los índices de placa se les añaden cebadores de indexación Illumina TruSeq, después de lo cual todas las muestras se pueden volver a combinar y purificar en un solo lote. Después de la selección del tamaño y la cuantificación, la biblioteca está lista para secuenciarse en un secuenciador Illumina MiSeq. Paralelamente, se lleva a cabo un cribado funcional de los clones Fab en placas de 96 pocillos, lo que da como resultado datos de unión al antígeno. La plataforma actual tiene capacidad para codificar un total de 9216 pozos mediante indexación jerárquica. Como se incluyeron tres controles positivos y tres pocillos vacíos en cada placa de 96 pocillos, en este estudio se secuenciaron 8640 nuevos clones Fab en una única ejecución de Illumina. Se incluyeron Fabs de control positivo seleccionados de las mismas bibliotecas para mostrar si la expresión en esa placa fue exitosa. Los tres pocillos vacíos también sirvieron como controles negativos para la PCR con código de barras de los pocillos, y la ausencia de producto de amplificación se verificó mediante electroforesis en gel de agarosa de una a tres placas seleccionadas al azar de cada proyecto de detección (datos no mostrados). La estrategia de cribado diseñada se ilustra en la figura 1. Teniendo en cuenta el coste de los cebadores, la purificación del ADN, la preparación de la biblioteca, el control de calidad y la secuenciación con el kit MiSeq v3, el precio por muestra/pocillo fue de 0,35 €. En comparación, la secuenciación de Sanger habría costado aproximadamente 8,5 € por muestra, si los dominios VL y VH se secuenciaran por separado.

Estrategia de detección ilustrada. Los clones individuales se inoculan primero en la reacción de PCR con código de barras del pocillo y luego en las coordenadas correspondientes en la placa de expresión. Los dominios variables de todos los clones se amplifican con cebadores de índice de pocillos personalizados, seguido de la combinación y purificación de las 96 muestras en un solo lote. En la PCR con código de barras de placas, las muestras agrupadas de diferentes placas se etiquetan con adaptadores de índice TruSeq. Las muestras se agrupan nuevamente, se purifican por lotes y se preparan para la secuenciación en MiSeq. Paralelamente (derecha), se lleva a cabo el cribado funcional de clones Fab individuales. Los datos del inmunoensayo resultantes se combinan luego con datos de NGS, se identifican clones verdaderamente únicos y se seleccionan los mejores candidatos para una detección de afinidad más exhaustiva.

Antes de aplicar la estrategia a los proyectos de detección, las reacciones de PCR de indexación se probaron y optimizaron con ADN Fab de control para que funcionaran en volúmenes de reacción óptimos de 10 \(\upmu \)L para que fueran rentables, pero prácticamente factibles para el manejo de líquidos. Las secuencias de control Fab se verificaron con la secuenciación de Sanger para que fueran correctas y contenían los cuatro índices y las secuencias del adaptador Illumina TruSeq (Fig. S1). Además, el análisis de electroforesis en gel mostró que los 96 + 96 pares de cebadores de indexación funcionaron con una eficiencia de amplificación similar (Fig. S2), lo que permitió una combinación volumétrica simple de las muestras. Además, las secuencias VL y VH podrían amplificarse en una única PCR con dos pares de cebadores. La amplificación correcta para los códigos de barras VH y VL se verificó nuevamente con electroforesis, después de la digestión con PstI del amplicón VL para una mejor separación de los fragmentos VH y VL (Fig. S3).

Se examinaron fragmentos de anticuerpos Fab contra cuatro antígenos diferentes (SpyCatcher, DARPin, proteína no estructural 1 (NS1) del virus del dengue y proteína de la nucleocápside (NP) del SARS-CoV-2) utilizando la plataforma desarrollada. Excluyendo la biblioteca anti-NS1, los Fab se originaron a partir de selecciones de presentación en fagos de nuestras dos bibliotecas de scFv sintéticos. Las selecciones se iniciaron con tres o cuatro rondas de selección de fagos como scFv, seguidas de la conversión a bibliotecas Fab. La conversión contenía un paso de mezcla para pares ligeros variables (VL) y pesados ​​variables (VH), ya que los dominios primero se amplificaron por separado a partir de grupos de producción de fagos scFv y luego se clonaron con enzimas de restricción de tipo IIS o RCA selectivo en casetes Fab. Después de tres a cuatro rondas adicionales de selección de presentación en fagos, las bibliotecas de Fab enriquecidas se clonaron con enzima de restricción de tipo IIS en un vector de expresión, a partir del cual los Fab se expresaron como proteínas periplásmicas solubles con una etiqueta His en el extremo C del complejo pesado. cadena. La expresión y el cribado funcional con inmunoensayos de unión a antígeno se realizaron en placas de 96 pocillos. La concentración de antígeno para la detección soluble se eligió basándose en ensayos realizados con Fabs de control de estudios anteriores que proporcionaban el 20 % de la señal máxima en el ensayo de unión de saturación de antígeno. Se examinaron veinte placas de bibliotecas anti-SpyCatcher y anti-DARPin. La biblioteca anti-NP se dividió en dos subbibliotecas después de la conversión Fab. La primera subbiblioteca, posteriormente denominada "NP-1", fue una presentación en fagos enriquecida durante dos rondas para unirse al antígeno capturado por Fab N1G1 biotinilado (clon encontrado durante la selección previa de las bibliotecas). La segunda subbiblioteca, más tarde denominada "NP-2", se enriqueció mediante presentación en fagos durante dos rondas directamente contra el antígeno biotinilado. Se examinaron dieciocho placas de ambas bibliotecas de NP.

A diferencia de los otros tres proyectos, los Fabs anti-NS1 no se sometieron a selección de presentación de fagos. El motivo era ampliar el perfil de especificidad de un Fab 49A3 anti-NS1 existente para reconocer de manera más uniforme todos los serotipos 1-4 de NS1. Con este fin, nos centramos en la detección de variantes parentales anti-NS1 Fab 49A3 que contienen mutaciones de sustitución única contra el antígeno NS del serotipo 2 del dengue, que fue reconocido con la afinidad más baja por el Fab parental en comparación con los otros tres serotipos (datos no mostrados). La campaña de detección de NS1 se analiza en detalle en secciones posteriores. Para los cuatro proyectos de cribado, cada placa cribada incluía tres pocillos Fab de control (inoculados a partir de colonias de forma similar a los clones cribados) y tres pocillos de control vacíos.

En las cuatro campañas de detección, los pocillos de control negativo produjeron una señal de fluorescencia uniforme y de resolución temporal baja (TRF) en comparación entre diferentes placas. Los pocillos de control Fab positivo mostraron una señal uniforme y similar dentro de la misma placa en todas las bibliotecas excepto en anti-DARPin, donde se observó una gran variación entre los tres controles positivos dentro de las placas. La normalización de los datos se realizó dividiendo la señal TRF de los clones seleccionados por la de los pocillos vacíos (señal de fondo, S/B). El 57% de los clones seleccionados produjeron S/B inferior a 3, lo que indica pocillos con baja expresión de Fab o clones de bajo rendimiento. Las tasas de aciertos positivos con este límite fueron del 13, 84, 55 y 54 % para las bibliotecas anti-SpyCatcher, -DARPin, -NP-1 y -NP-2, respectivamente. Los datos de cribado funcional para cada proyecto se ilustran en la Fig. 2, y por placa cribada en las Figs. S4 y S5.

Resumen de cribado de repertorios Fab seleccionados de genotipo-fenotipo y visualización de fagos. (a) Gráficos de nubes de tormenta de datos de detección funcional del inmunoensayo de unión a antígeno para clones de biblioteca Fab contra SpyCatcher, DARPin y SARS-CoV-2 NP, en el orden respectivo de izquierda a derecha. La unión al antígeno se muestra en el eje y como unidades de fluorescencia resueltas en el tiempo divididas por la señal del pocillo de control vacío. La densidad de distribución relativa se ilustra como un gráfico de medio violín (púrpura). La mediana y los cuartiles se muestran con un diagrama de caja y la media con un rectángulo rojo. Los datos medidos de clones Fab individuales se muestran con un punto, separando los resultados positivos (azul) con S/B superior a tres de los resultados negativos (naranja). Además, los clones Fab de control están coloreados de verde. (b) Prevalencia de genotipos únicos como número de copias dentro de cada biblioteca analizada.

Se obtuvo un total de 15 millones de lecturas finales pareadas (301 + 301) con una puntuación de calidad Phred promedio de 32 por lectura a partir de la secuenciación con MiSeq. El 89,5 % de las lecturas se demultiplexaron correctamente según los índices de placa TruSeq automáticamente mediante el software Illumina. El 10,5% restante de las lecturas se marcaron como indeterminadas y luego se identificaron como secuencias de control PhiX con búsqueda BLAST. Esto estuvo a la par con la cantidad aumentada (10%) de control PhiX. Las lecturas identificadas se distribuyeron uniformemente entre los índices de la placa como se muestra en la Fig. 3a, lo que indica una buena normalización de la entrada por masa de ADN en el paso de preparación de la biblioteca. De manera similar, se observó una distribución de lectura equilibrada en placas individuales entre los índices de los pocillos (Fig. 3b). También se obtuvieron lecturas con índices de control (H10-H12), que no deberían tener plantilla de ADN. Hubo un promedio de 229 lecturas por índice de pocillo vacío en comparación con un promedio de 1540 lecturas con índices que se refieren a pocillos que contienen bacterias portadoras de plásmidos, respectivamente. Las lecturas del dominio VL fueron moderadamente más abundantes que las de VH. El noventa y ocho por ciento de las lecturas emparejadas se fusionaron con éxito, proporcionando dominios VL y VH de longitud completa con índices de pozos flanqueantes, lo que aumentó el puntaje de calidad Phred promedio por lectura a 37. Después de demultiplexar los índices de pozos personalizados y recortar los adaptadores, el 92% de las lecturas calificaron. para análisis de secuencias VL y VH. La extracción de secuencias VH y VL se realizó mediante comandos UNIX con patrones de expresión regular personalizados. La alineación de las lecturas con secuencias Fab de control conocidas verificó aún más el éxito de la secuenciación de índice dual. Las estadísticas de secuenciación se muestran con más detalle en la Tabla 2a.

Distribución del recuento de secuencia total dentro de los índices de placa (a) y distribución media del recuento de secuencia dentro de los índices de pozo (b). (a) Se observa una distribución uniforme de los recuentos totales de lecturas dentro de las placas. Los recuentos de secuencias totales de la biblioteca anti-NS1 son ligeramente inferiores, ya que sólo se secuenciaron los dominios VH. Las bibliotecas SpyC, DARPin, NS1, NP-1 y NP-2 están ilustradas con colores azul, naranja, verde, rojo y morado, respectivamente. (b) De manera similar, la distribución media equilibrada del recuento de lecturas se observa dentro de los índices de los pozos después de la demultiplexación. Las secuencias VL (azul) son moderadamente más abundantes en los datos que las secuencias VH (naranja). Un número muy bajo de lecturas se originan en los pocillos H10-H12, ya que sirvieron como pocillos de control vacíos en la selección sin clones de E. coli que expresaran Fab en ellos.

Para nuestra sorpresa, se observaron varias secuencias diferentes que contenían el mismo ID de pozo después de colapsar las lecturas con FASTX-Toolkit. Para la mayoría de los clones, observamos secuencias únicas distintas de VH y VL con una gran abundancia, que supusimos que era la secuencia correcta para ese par de índices específico. Sin embargo, quedaron múltiples muestras sin una secuencia principal clara (el 20% de las muestras tenían menos del doble de diferencia entre los recuentos de lectura de secuencia más abundante y el segundo más abundante). Las secuencias de fondo contaminantes, que también consisten en secuencias VH/VL de longitud completa, exhibieron patrones específicos de la biblioteca. Se identificaron motivos de secuencia idénticos en diferentes índices de pocillos y placas dentro de la misma biblioteca, pero no en repertorios secuenciados de Fabs contra diferentes antígenos. También se descubrieron amplicones completamente nuevos de tamaño correcto, no identificados como secuencia principal VH o VL de ningún clon, lo que respalda aún más la teoría de la formación de quimeras por PCR. Las quimeras pueden surgir durante la PCR con código de barras en placa, en la que los 93 clones de ADN estaban presentes como plantillas en la misma reacción y, debido a la alta similitud de secuencia, pueden cebarse entre sí y generar nuevas variantes. Optimizamos aún más la PCR cambiando la polimerasa a Q5 de Phusion y reduciendo el número de ciclos a ocho desde los 20 originales. Después de una nueva secuenciación, se observó una clara mejora en la claridad de la secuencia. Al excluir los índices de pozos vacíos de los análisis, se observó una mejora promedio de 1,3 y 2,5 veces en el recuento de la secuencia superior (principal) con respecto al recuento total y en el recuento de la secuencia superior con respecto al segundo recuento de secuencia más abundante dentro del mismo índice, respectivamente (proporciones y veces cambios mostrados en las figuras S6, S7).

Después de la PCR de códigos de barras optimizada, aún persistía cierto nivel de secuencias de fondo en todas las posiciones del índice. Los pocillos vacíos exhibieron recuentos de lectura significativamente más bajos para cada dominio variable (que van de 5 a 677, con una mediana de 95) en comparación con los pocillos experimentales (que van de 4 a 4378, con una mediana de 720). Además, las proporciones de los recuentos de secuencias más abundantes con respecto a la segunda secuencia más abundante fueron, en promedio, 31 veces mayores en los pocillos de muestra que en los pocillos vacíos, respectivamente. Para garantizar una asignación de secuencia sistemática y objetiva para cada pozo, se desarrolló un método de filtrado. El análisis de los recuentos totales de lecturas recuperados de pocillos individuales de una placa de 96 pocillos nos guió para desarrollar un método de filtrado basado en dos criterios: (1) la relación entre la lectura más abundante y el número total de lecturas por pocillo es mayor que la relación equivalente calculado a partir de controles de pozos vacíos y (2) la proporción de la lectura más abundante a la segunda lectura abundante es superior al doble. Como los recuentos de secuencia total variaron ligeramente entre las ID de placa, el primer filtro se calculó individualmente para cada placa. El valor de umbral doble establecido para el segundo filtro se consideró como un indicador confiable de la asignación correcta de la secuencia a un pozo, según los datos verificados de la secuenciación de Sanger (no mostrados). Después de los dos filtros, el recuento de clones que contenía la secuencia VH y VL (o solo VH para la biblioteca anti-NS1) fue 6378 (69% del número máximo teórico de clones, incluidos los controles de pocillos vacíos de las 96 placas de detección). El número de clones que pasaron por ambos filtros por biblioteca analizada (excluyendo los tres pocillos que se dejaron vacíos intencionalmente para el control) fue 1691 (91%), 1374 (74%), 1520 (81,7%), 1143 (68%) y 1615 (97%). %) para las bibliotecas anti-SpyC, anti-DARPin, anti-NS1, anti-NP 1 y anti-NP 2, respectivamente. Como filtro final, las secuencias que no fueron reconocidas como secuencias variables de anticuerpos mediante la herramienta de numeración de anticuerpos ANARCI se descartaron antes de la selección de clones para la detección de EC\(_{50}\). Esto dio como resultado la exclusión de 126 clones adicionales, todos los cuales tenían codones de parada en cualquiera de sus secuencias de dominio variable traducidas. El 80,9% de los pozos Fab de control pasaron todos los filtros, y la mayoría de los clones que no pasaron pertenecen al proyecto anti-DARPin. Las estadísticas de filtrado se muestran en la Tabla 2b. En la Fig. 4 se muestra un ejemplo del filtrado aplicado a los datos de secuencia de una placa de detección de NP anti-SARS-CoV-2 número S079. Todos los clones en la placa S079 pasaron el filtro ANARCI.

Para verificar la fidelidad de las secuencias obtenidas mediante la demultiplexación de los datos NGS de doble índice y los métodos de filtrado aplicados, la placa de 96 pocillos denominada "RS016" que contiene clones NP Fab anti-SARS Cov-2 se secuenció mediante secuenciación Sanger y los resultados se compararon con los Secuencias derivadas de NGS. 130 de 156 (83,3%) secuencias de Sanger de buena calidad coincidieron completamente con secuencias obtenidas con MiSeq. Entre las secuencias de Sanger que no coincidían, una muestra contenía una secuencia doble como resultado de seleccionar dos colonias superpuestas de una placa de agar. El resto de las secuencias no coincidentes asignadas determinadas por NGS se identificaron como otras secuencias Fab de la misma salida de la biblioteca (19 clones), lo que posiblemente indica una contaminación cruzada menor o un error humano en la selección de colonias. No hubo diferencias significativas entre el número de secuencias no coincidentes en VH (n = 16) y VL (n = 14). Aunque el tamaño de la muestra fue limitado, los resultados sugieren que la gran mayoría de las secuencias de clones son correctas. Sin embargo, es importante reconocer que todavía existe la posibilidad de una asignación de secuencia errónea debido al manejo manual de las placas. Se realizó un control de calidad adicional comparando secuencias de las posiciones del índice Fab del control positivo interno de cada placa de detección con secuencias Fab de control conocidas. Las secuencias VL y VH demultiplexadas y anotadas que pasaron el método de filtrado desarrollado coincidieron perfectamente (100%) con las secuencias Fab de control conocidas en todas las bibliotecas.

Filtrado aplicado sobre placa de cribado NP anti-SARS-CoV-2 S079. Cada subtrama representa un pozo en una placa de cribado, que se muestra en los ejes x e y. Los clones que pasaron los filtros se muestran en verde y los que no pasan en color rojo. El número en la parte superior de la subtrama muestra el número total de lecturas de secuenciación obtenidas de los índices de ese pozo. La claridad de las secuencias VL (izquierda) y VH (derecha) se muestra como barras, que muestran la proporción del recuento de secuencias más abundante (barra blanca) de ese pozo en comparación con el segundo recuento de secuencias más abundante (barra gris).

La identificación del genotipo antes de seleccionar clones individuales para un examen secundario más exhaustivo elimina el riesgo de realizar un examen secundario del mismo clon repetidamente, lo que ahorra recursos y tiempo. Al seleccionar clones basándose en señales de ensayo TRF de un solo punto, estuvieron presentes genotipos repetidos entre los 10 clones principales con mayor S/B. Las proporciones de clones verdaderamente únicos fueron 8/10, 1/10, 8/10, 9/10 y 9/10 para las bibliotecas anti-SpyC, anti-DARPin, anti-NS1, anti-NP 1 y anti-NP 2, respectivamente. . El número de clones verdaderamente únicos fue aún menor cuando se seleccionaron a ciegas 20 clones, siendo 15/20, 3/20, 13/20, 12/20 y 14/20 en el mismo orden. Las selecciones para la biblioteca anti-NS1 se muestran en las Fig. 5a, b y para las cinco bibliotecas en las Figs. T8-T12.

El enriquecimiento exitoso de aglutinantes contra el antígeno de interés se puede evaluar retrospectivamente mediante detección genotipada. Las proporciones de combinaciones únicas de VH+VL fueron del 79, 8, 42 y 41% del número total de filtros que pasaron clones para las bibliotecas anti-SpyC, anti-DARPin, anti-NP 1 y anti-NP 2, respectivamente. En las bibliotecas anti-NP 1 y anti-NP 2 el enriquecimiento fue claramente visible, ya que el 23 y el 42% de los genotipos estaban representados entre 2 y 65 veces con medianas de 2 y 3, respectivamente. Debido a la gran diversidad de secuencias de los clones seleccionados a partir de la selección de la biblioteca anti-SpyC, el enriquecimiento no fue completo en la etapa de selección, ya que solo el 13% de los genotipos estuvieron representados en los datos más de una vez, la mayoría de los cuales fueron descubiertos 2– 10 veces. El carácter incompleto de la selección de presentación en fagos fue respaldado aún más por los datos de detección funcional, ya que los repertorios anti-SpyC seleccionados tuvieron la tasa de aciertos más baja (S/B > 3) entre las bibliotecas seleccionadas de presentación en fagos. Entre los genotipos encontrados al menos tres veces en la campaña de detección, el 66,7% no se unió al antígeno SpyCatcher (S/B < 3), mientras que, de los genotipos restantes, el 28,9% mostró una relación S/B tanto por encima como por debajo del estableció una relación de umbral triple, y el 4,4 % fueron positivos (S/B > 3) en todos los casos (6,7 % si se calcula con S/B > 2). Por el contrario, la biblioteca anti-DARPin estaba sobreenriquecida en relación con el número de clones seleccionados, con sólo 76 genotipos únicos, el 43% de los cuales estaban representados entre 2 y 331 veces con una desviación estándar (DE) de 47. Tres genotipos, incluido uno utilizado como control, estaban presentes con 170 clones o más. El bajo número de clones únicos en el repertorio Fab anti-DARPin es consistente con el esquema de selección, ya que se llevaron a cabo cuatro rondas de selecciones de fagos Fab con la biblioteca anti-DARPin en contraste con tres con la biblioteca anti-SpyC y de una a dos. con bibliotecas anti-NP. Los números de copias del genotipo por biblioteca se muestran en la Fig. 2b.

Como el método revela genotipos de todos los clones seleccionados, los datos de la señal TRF se pueden agrupar según la identidad del clon. Cuanto mayor sea el tamaño de la muestra, más fiable será la estimación cuantitativa de la fuerza de unión del clon en comparación con clones pares y más fiable será la estimación de la variación de la señal intraensayo. Al analizar la varianza en la magnitud de la señal del ensayo obtenida de clones idénticos, se cuantificó el error aleatorio de la plataforma de detección. Esto se muestra para los clones anti-NS1 en la Fig. 5b. La variación intraclonal fue mayor en la biblioteca anti-DARPin, y cuando se estudiaron los cuatro genotipos más abundantes, se encontró que el coeficiente de varianza (cv) estaba entre 40 y 52% (Fig. 5c). Ser capaz de ver la variación natural permite una evaluación más precisa de la precisión del cribado y, por lo tanto, tomar decisiones elaboradas basadas en evidencia ponderada.

Para estudiar más a fondo la variación de la señal del ensayo de detección intraclonal, se realizó una detección simulada de una placa que contenía un único clon (anti-DENV2 NS1 Fab S055B12) y controles con el protocolo estándar. Los valores de cv para las señales TRF del ensayo de unión con sustracción de fondo fueron 12,2, 8,7 y 11,1% para concentraciones de antígeno de 30, 50 y 100 ng/ml, como se ve en la Fig. 5d. Además, estudiamos cómo la varianza afecta la confiabilidad de la selección y clasificación de clones mediante la realización de una simulación in silico simplificada. La simulación se realizó con dos grupos de muestra de iguales tamaños (n = 2–20) que siguieron una distribución normal con medias S/B asignadas de tres y seis, respectivamente (para imitar el límite de tasa de aciertos establecido anteriormente y una diferencia de señal doble). ). Los grupos de muestra se compararon con una prueba t de dos colas bajo la influencia de una varianza cambiante (5–50%) iterando la simulación 1000 veces para obtener estimaciones más precisas de los valores p promedio. Como se muestra en la Fig. S13, un tamaño de muestra de 3 es suficiente para distinguir de forma confidencial una diferencia doble (p <0,05) en la señal funcional para datos distribuidos normalmente con una varianza inferior al 20%. Para una variación mayor, por ejemplo, 40 y 50 %, como se observa en la detección anti-DARPin, cada grupo necesitaría tamaños de muestra de 7 u 11, respectivamente, para ver la diferencia. Por ejemplo, para ver una diferencia estadísticamente significativa entre las señales TRF medias de los clones anti-DARPin vh4vl42 y vh18vl25 (variaciones 52,1 y 42,8%, respectivamente) utilizando la prueba t de dos colas, se requirió un tamaño de muestra mínimo de 12, verificado por iteraciones con muestreo aleatorio de cada grupo de genotipo.

Selección de clones Fab individuales para el cribado secundario. ( a, b ) Selección de clones a partir de la detección de la biblioteca Fab anti-NS1 utilizando una concentración de bio-DENV2-NS1 de 50 ng/ml. El violín gris representa la distribución de los puntos de datos individuales. (a) Se seleccionaron 10 clones con la mayor señal de fondo sin conocer sus genotipos, lo que resultó en la selección de dos genotipos, Y98W y Y98L, dos veces. En el gráfico se muestran 300 clones con el S/B más alto. (b) Se seleccionaron 10 genotipos únicos con la señal más alta al fondo, evitando la selección repetida y mostrando variación dentro de la señal de unión de cada clon del ensayo TRF. (c) Variación de la señal TRF de los cuatro genotipos más abundantes en la detección de la biblioteca anti-DARPin. Los valores medios se muestran como una línea horizontal. (d) Detección simulada de 96 pocillos con anti-DENV2 NS1 Fab S055B12, variación de la señal de unión de demostración del inmunoensayo con concentraciones de antígeno de 30, 50 y 100 ng/ml. El coeficiente de varianza promedio fue del 10,7%.

Para investigar si la construcción de la biblioteca anti-NS1 fue exitosa, se estudiaron las mutaciones y se contaron los genotipos únicos. La biblioteca anti-NS1 constaba de 20 subbibliotecas, cada una con un único codón asignado al azar en una ubicación específica en CDRH2 o CDRH3. Se analizó una placa por subbiblioteca con controles similares a los anteriores. Cada placa de selección incluía tres pocillos Fab de control (inoculados a partir de colonias de forma similar a los clones seleccionados) y tres pocillos de control vacíos. Se encontraron mutaciones en las posiciones correctas en todas las subbibliotecas y la cobertura de cada aminoácido único varió entre 11 y 20. Esto indica una construcción exitosa de las subbibliotecas, con excepción de dos posiciones objetivo H52 y H52A (numeración kabat). donde la diversidad fue menor (el ámbar stop y la prolina estaban sobrerrepresentados). Los datos de detección funcional genotipados para cada subbiblioteca se muestran en las figuras 6a a d.

La detección funcional genotipada permite un análisis en profundidad de los efectos de las mutaciones en cada posición objetivo en la biblioteca de mutagénesis de saturación de sitio. (a – d) Datos de detección funcional anti-NS1 que muestran cada sustitución (símbolo) y tipo de aminoácido (color) para las subbibliotecas dirigidas a CDRH2 (a, c) y CDRH3 (b, d). La señal TRF medida en el eje y se normaliza en relación con el fondo del pozo vacío (a, b) y con el clon parental que contiene los pozos (c, d). Un único punto de datos de sustitución N58E se excluyó de la subtrama (c) (señal a los padres de 8.16). La posición de la mutación (Kabat) se muestra en el eje x encima del genotipo Fab 49A3 parental (cursiva). Los genotipos presentados en la subtrama (e) están anotados con círculos, flechas y contornos de símbolos en negrita. La línea discontinua de color azul oscuro en las subtramas (c, d) indica el nivel de señal del clon parental. (e) Afinidades aparentes de clones Fab seleccionados medidas con inmunoensayo EC\(_{50}\).

Las afinidades aparentes de los clones Fab seleccionados se midieron con inmunoensayos EC\(_{50}\) y se compararon con los datos de detección tradicionales. La clasificación de clones basada en el valor S/B de la selección tradicional no predijo perfectamente la clasificación basada en los valores EC\(_{50}\) en ninguna de las subbibliotecas (Fig. S14), ya sea que la clasificación primaria se haya realizado para individuos aparentes. clones o genotipos identificados como grupo. En comparación con el Fab parental, se observaron valores de EC\(_{50}\) más bajos solo para dos nuevos genotipos, Y98L e Y98F, los cuales mostraron una mejora menor de 1,37 o 1,24 veces, respectivamente. La mayoría de los clones restantes mostraron una CE\(_{50}\) de dos a siete veces mayor que la de los padres. Sin embargo, la plataforma permite una rápida identificación de mutaciones beneficiosas a partir de mutaciones desventajosas en una posición específica, como se muestra en la Fig. 6. Por ejemplo, la sustitución de tirosina por leusina en la posición H98 muestra una mejora en la unión del antígeno sobre el genotipo Fab de control, lo que también se puede observar. como una mejora de la afinidad aparente (ver Fig. S14). Del mismo modo, se pueden identificar posiciones con residuos ya óptimos (H50, H52A, H93-95, H100 y H100A) a partir de posiciones que permiten sustituciones y tienen margen para posibles mejoras.

En este artículo describimos una plataforma de detección de Fab soluble, capaz de proporcionar datos funcionales genotipados de miles de aglutinantes individuales mediante la utilización de secuenciación de próxima generación (NGS) con indexación jerárquica. Conocer cada clon por la secuencia del dominio variable de su anticuerpo permite un análisis en profundidad de los efectos de la mutación y revela la variación intraclonal en los datos de detección primaria. De esta manera, se pueden realizar selecciones de candidatos más informadas para avanzar en el desarrollo de anticuerpos. Además, la calidad de la biblioteca y el éxito de las selecciones previas a la selección se pueden evaluar retrospectivamente. Además, se puede evitar la selección de clones con genotipos compartidos, ahorrando tiempo y recursos valiosos. A partir de bibliotecas de maduración por afinidad construidas con mutagénesis de saturación de sitio, nuestra plataforma puede revelar rápidamente mutaciones beneficiosas y no beneficiosas en cada posición a partir de datos de detección genotipados, algo que no sería posible a partir de datos de detección convencionales. Conocer los efectos de la mutación ya en el momento de la detección primaria puede acelerar notablemente el proceso de ingeniería de anticuerpos. Las sustituciones favorables se pueden estudiar más a fondo por separado o combinándolas para obtener un posible efecto aditivo sobre la función, evitando al mismo tiempo mutaciones desventajosas.

Las tasas de aciertos positivos (S/B > 3) y la distribución de los datos de detección funcional difirieron entre los proyectos de detección derivados de fagos. A pesar de someterse a 4 + 4 rondas de presentación de fagos, parece que la biblioteca anti-SpyCatcher no se enriqueció completamente y podría haberse beneficiado potencialmente de una ronda adicional de selección de presentación de fagos o una reconsideración de la estrategia de selección. La campaña de selección involucró varios antígenos, incluidos SpyCatcher biotinilado químicamente, scFv-SpyCatcher y proteínas Spy- y SdyCatcher biotiniladas in vivo, con el objetivo de mejorar la unión hacia el receptor en lugar del conector SA-biotina. El enriquecimiento insuficiente se evidencia por el bajo número de genotipos idénticos en el conjunto seleccionado y una tasa de acierto relativamente baja del 13%. La baja tasa de aciertos también se puede observar en la distribución de los datos de la señal funcional (Fig. 2), que tiene una gran ponderación inferior. En los tres proyectos restantes, las tasas de acierto fueron más altas y también los genotipos compartidos más abundantes. En el caso de la biblioteca anti-DARPin, la selección podría haberse examinado después de la tercera ronda en lugar de la cuarta ronda de análisis, ya que en los datos solo estaban representados unos pocos genotipos, que también tenían una señal funcional distribuida de manera bastante uniforme. Tanto NP-1 como NP-2 provienen del mismo origen de biblioteca de fagos convertidos con Fab, pero los datos funcionales entre ellos son muy diferentes, y NP-2 tiene señales distribuidas de manera más uniforme entre clones. Esto era de esperar, ya que las dos últimas rondas de selección y los formatos de ensayo fueron diferentes. Los Fab NP-2 se unieron primero a los pocillos, seguido de la adición de antígeno biotinilado y se detectaron con estreptavidina marcada con Eu, mientras que los Fab NP-1 se seleccionaron para unirse al antígeno capturado por el Fab N1G1 de control y la presencia de E. coli. Los Fab-AP expresados ​​se detectaron con un anticuerpo antifosfatasa alcalina marcado con europio.

Se seleccionó un proyecto de maduración de afinidad anti-NS1 para probar diferentes tipos de muestras con nuestra plataforma de detección funcional genotipada. Tener mutaciones en posiciones conocidas y específicas facilita enormemente el análisis de datos y la visualización de los efectos de las mutaciones. En el marco de este estudio, se cribó una única placa, es decir, 90 clones desconocidos, por posición de sustitución. Sería necesario analizar más clones por subbiblioteca para obtener un mayor número de réplicas y predecir con mayor precisión los efectos de la mutación teniendo en cuenta la varianza inherente.

Hasta donde sabemos, este es el primer informe sobre el uso de NGS para identificar miles de Fabs funcionalmente caracterizados producidos en formato soluble en E. coli. Como se mencionó anteriormente, en la ingeniería de anticuerpos, la NGS se ha aplicado principalmente a poblaciones de secuencias, por ejemplo, grupos de presentación de fagos enriquecidos25,26,28 o poblaciones de clasificación FACS27. Dado que tanto los dominios variables pesados ​​como los ligeros contribuyen a la unión del antígeno, conservar su enlace en la secuenciación suele ser crucial. A menudo se requieren compromisos para vincular VL y VH, especialmente cuando se utilizan tecnologías de secuenciación de lectura corta como Illumina. Con los scFv, las CDR se han secuenciado a partir de un único amplicón mediante la lectura de CDRL1 a CDRH330, comprometiendo solo partes de las regiones estructurales. Es posible obtener información de las secuencias VL y VH vinculadas de clones Fab con el kit de ciclo Illumina MiSeq 500 colocando cuidadosamente los cebadores de secuenciación cerca de los bucles de CDR y optimizando los números de ciclo de las longitudes de lectura de los extremos emparejados (lectura 1: 270 bases que cubren las CDR VL). + leer 2: 230 bases que cubren CDRH1 y -H2)31. Sin embargo, existe el riesgo de perder información importante debido a la pérdida de calidad de la base hacia el final de las lecturas de MiSeq32. Barreto et al. propusieron otra estrategia para mantener el vínculo VH-VL. En su estudio, utilizaron la mutagénesis de Kunkel para eliminar las regiones estructurales intermedias entre los dominios CDR para combinar CDRL3-CDRH3 o CDRL3-CDRH1-CDRH2-CDRH3 en plásmidos individuales, donde podrían amplificarse para la secuenciación en Ion Torrent33. El enfoque de Kunkel todavía depende de la longitud de lectura de la secuencia, que debe cubrir el tamaño objetivo truncado. En nuestra plataforma, VL y VH se secuencian a partir de diferentes amplicones unidos mediante ID de índice jerárquico (Fig. 1), siguiendo un enfoque similar demostrado en el proceso de descubrimiento de anticuerpos de hibridoma realizado por Chen et al.29 Sin embargo, la secuenciación de índice jerárquico no necesita limitarse a dos amplicones, ya que un número personalizado de objetivos de secuenciación podría amplificarse y vincularse con los índices de los pozos para su identificación.

Debido a la disponibilidad y la compatibilidad garantizada con las celdas de flujo de Illumina, elegimos utilizar cebadores de indexación patentados por Illumina del kit TruSeq Custom Amplicon para códigos de barras de placas. Sin embargo, nuestros cebadores de índice personalizados también deben ser totalmente compatibles con los cebadores iTru, descritos en la serie Adapterama22,23,34, que incluyen todos los elementos necesarios para la secuenciación con cebadores de secuenciación universales de Illumina. Se han desarrollado 384 secuencias índice únicas para ambos pares de cebadores en el sistema iTru. Por lo tanto, en el futuro, el rendimiento de nuestra plataforma de detección podría aumentarse aún más desde los 9216 actuales hasta 14.155.776 (12 \(\times \) 8 \(\times \) 384 \(\times \) 384), si así se desea. . En promedio, obtuvimos 1540 lecturas de índices que se refieren a pocillos que contienen bacterias portadoras de plásmidos, por lo que un aumento de diez veces en el tamaño de la muestra aún daría como resultado 150 o más lecturas por muestra. Esto sigue siendo suficiente para la identificación del genotipo, suponiendo que no haya cambios en la proporción de secuencia dominante frente a secuencias de fondo por pocillo. Sin duda, aumentar el número de muestras requeriría una total automatización de los procesos. La plataforma podría automatizarse con bastante facilidad utilizando robots de manipulación de líquidos y recolectores de colonias automatizados disponibles comercialmente o incluso combinaciones personalizadas de bajo costo, como las demostradas por Hartley et al.35.

Durante este estudio de prueba de concepto, la selección de colonias para PCR, el cultivo y el pipeteo se realizaron manualmente, y reconocemos el riesgo de error humano y sus efectos en los datos de detección. Las principales fuentes de error en la manipulación manual suelen ser inocular el mismo pocillo dos veces u omitir un pocillo en la fase de cultivo o al agregar material de plantilla a las placas de PCR. En nuestros datos observamos tanto una baja cantidad de lecturas (que no pasan el filtro de "pocillo vacío") de pocillos con una señal funcional mensurable, lo que indica un bajo número de bacterias inoculadas en la reacción de PCR, como dos clones distintos con un alto número de copias (que no pasan el filtro de “claridad”), que también se verificaron con la secuenciación de Sanger de la placa de cultivo almacenada.

El análisis de las secuencias de amplicones indexadas jerárquicamente se complicó por la presencia de secuencias de fondo inesperadas existentes con una frecuencia de copia baja en cada muestra de secuenciación de pocillos demultiplexada. Una inspección más detallada de las lecturas contaminantes reveló que se podían encontrar secuencias idénticas en diferentes índices de pocillos y placas, con el factor común de que las placas en cuestión estaban orientadas contra el mismo objetivo. No se encontraron secuencias de fondo idénticas en los repertorios seleccionados frente a otros objetivos. Esto indica que, de hecho, se generaron durante la segunda PCR, donde se amplificaron 96 muestras de ADN bien indexadas de la misma placa como un conjunto con cebadores de indexación TruSeq. Naturalmente, se podían encontrar secuencias idénticas a partir de diferentes ID de placas de la misma campaña de selección, ya que estaban presentes clones idénticos en placas de selección paralelas. Además, se descubrieron secuencias VL y VH completamente nuevas. Esta es una clara indicación de la generación de quimeras a través de la recombinación por PCR, que es un problema conocido desde hace mucho tiempo cuando se amplifican simultáneamente secuencias con alta similitud36,37. Mitigamos la formación de quimeras reduciendo los ciclos del original 20 a 8, según lo recomendado por Lahr et al.38 y cambiando la polimerasa de Phusion a Q5. Aunque pudimos mejorar la claridad de la secuencia principal por índice, se mantuvo cierto nivel de trasfondo. Reducir aún más la cantidad de ADN molde podría resultar beneficioso38. La purificación individual del ADN de los amplicones de PCR con códigos de barras, como lo demostraron Chen et al.29, también daría como resultado un número menor de secuencias distintas para cada pocillo. Sin embargo, es importante señalar que un enfoque de este tipo aumentaría significativamente el costo y la carga de trabajo de proyectos de esta escala. Para eliminar aún más la posibilidad de formación de quimeras en el futuro, se podrían agregar índices de placa externa mediante ligación en lugar de PCR con alta precisión mediante el uso de enzimas de restricción de tipo II, de manera similar a lo que hicieron como primer paso de indexación Bayona-Vásquez et al.34.

Otra estrategia de indexación más incluye aumentar el número de cebadores de indexación únicos, como hicieron Wittmann et al. en 202239. En su estudio, el gen de interés se amplificó a partir de cultivos congelados de E. coli, utilizando un número bajo de ciclos y cebadores específicos con salientes para el recocido del cebador índice. En el segundo paso de la PCR, que aún se realiza para cada pocillo por separado, los amplicones se amplificaron aún más con cebadores índice personalizados. Se utilizaron un total de 96 cebadores directos indexados de forma única para etiquetar las coordenadas de los pocillos y 96 cebadores inversos indexados de forma única para indicar las ID de las placas. Esto permitió agrupar 9216 muestras individuales y realizar una mayor preparación de la biblioteca en un solo lote, de manera similar a nuestro enfoque. Después de la purificación y la selección del tamaño, la muestra podría enviarse a un proveedor de servicios de secuenciación, ya sea para analizarla entre otras muestras de clientes con índices de Illumina únicos o utilizar toda la celda de flujo, aumentando la profundidad de lectura. Los beneficios de este enfoque incluyen la eliminación de la formación de quimeras, ya que las reacciones de PCR solo contienen una muestra única, y la posibilidad de comprar una "ranura" de secuenciación del proveedor en lugar de utilizar toda la celda de flujo.

Aunque nuestro grupo de investigación ha llevado a cabo la detección de clones scFv y Fab solubles con inmunoensayos TRF de forma rutinaria durante más de dos décadas40, el estudio nos reveló por primera vez la verdadera variación intraensayo presente en matrices de anticuerpos expresados ​​en 96 pocillos. La variación intraclonal en la señal del ensayo se debe muy probablemente a niveles variables de expresión de clones Fab. Como todos los clones son únicos, sus tasas de crecimiento específicas pueden diferir entre sí, lo que resulta en una fase de crecimiento no uniforme en la inducción, lo que a su vez da como resultado cantidades variables de Fab expresado. Además, los Fab expresados ​​pueden sobrecargar el metabolismo de la célula huésped dependiendo de los detalles de la secuencia, lo que lleva a efectos tóxicos y rendimientos de Fab variables41. También se observó una variación bastante alta en un experimento controlado con el mismo clon Fab, donde el coeficiente de variación de la señal TRF del inmunoensayo de unión al antígeno fue de alrededor del 11%. Si la magnitud de la varianza medida en el experimento de control fuera generalizable a todos los experimentos de detección, se necesitarían al menos tres réplicas biológicas para observar una diferencia doble en la señal del inmunoensayo funcional con alta confianza, como se muestra con nuestros datos simulados. Para bibliotecas con bajo enriquecimiento, no se pueden evaluar diferencias definitivas entre genotipos. Además de la tasa de crecimiento, varias personas diferentes que realizan las expresiones y la selección funcional también pueden afectar las diferencias en la varianza de los datos.

En conclusión, hemos desarrollado una nueva plataforma de detección de Fab soluble, que produce datos de unión funcional vinculados al genotipo de miles de aglutinantes en masa, al tiempo que conserva el enlace VH-VL. La plataforma fue validada con cuatro proyectos de selección, lo que demuestra su versatilidad para ayudar en la selección de candidatos en función del análisis de varianza y el nivel de enriquecimiento alcanzado en los experimentos de selección. Aunque nuestros datos son suficientes para demostrar y validar la plataforma, sin duda se requiere automatización para una verdadera detección de alto rendimiento y datos de detección de mejor calidad. Además, la precisión de la plataforma podría mejorarse iniciando la indexación desde la placa de cultivo de E. coli en lugar de mover cada colonia de un pocillo a otro, además de las estrategias de mitigación de quimeras analizadas anteriormente.

Se utilizó E. coli XL-1 Blue (recA1 endA1 gryA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F' proAB lacI q Z\(\Delta \)M15 Tn10 (Tet r)]), adquirido originalmente en Stratagene (EE.UU.). para todas las selecciones de presentación de fagos y expresión de Fab en el cribado. Se utilizó el vector fagémido pEB32x6 (más tarde “vector de visualización”) en la presentación de fagos. Se usaron los vectores pLK06H6 y pAK40042 para expresar Fabs en formato soluble para el cribado. Se utilizó el vector pUC19 (New England Biolabs, EE. UU.) para la secuenciación de Sanger. Para la clonación, se utilizaron las enzimas de restricción SfiI, LguI, HindIII y BamHI y la ADN ligasa T4 de acuerdo con las recomendaciones del fabricante, todas adquiridas en Thermo Fisher Scientific, EE. UU. La transformación a E. coli se realizó con electroporación usando Gene Pulser Xcell (Bio-Rad, EE. UU.) a 1250 V, 25 \(\upmu \)F, 200 ohmios, con cubetas Gene Pulse de 1 mm (Bio-Rad, EE. UU.). Después de la electroporación, se permitió que las células se recuperaran en 1 ml de medio SOC (triptona 20 g/l, extracto de levadura 5 g/l, NaCl 0,5 g/l, KCl 2,5 mM, MgCl2 10 \(\upmu \)M, 3,6 g/L D-Glucosa, pH 7,0) durante 1 h a 37\(^\circ \)C con agitación a 300 rpm, seguido de la inoculación en placas de agar con 1 % de glucosa y antibióticos adecuados (10 \(\upmu \) g/mL de tetraciclina y 25 \(\upmu \)g/mL de cloranfenicol para vectores pAK400 o 100 \(\upmu \)g/mL de ampicilina para pLK06H). Todos los antibióticos utilizados se adquirieron en Sigma Aldrich (EE. UU.).

Se llevaron a cabo cuatro proyectos de detección de Fab separados para demostrar el rendimiento de la plataforma desarrollada. Tres de las bibliotecas, dirigidas a SpyCatcher43 (más tarde “anti-SpyC”), DARPins44 (“anti-DARPin”) o la proteína de la nucleocápside del SARS-CoV 2 (que consta de dos subbibliotecas, “anti-NP 1” y “anti-NP 2” ) se enriquecieron a partir de nuestras bibliotecas de presentación en fagos de anticuerpos sintéticos ScFvM y ​​ScFvP6. Brevemente, los scFv clonados en el vector de presentación se seleccionaron utilizando perlas magnéticas, en la primera ronda saturando el antígeno de interés de la superficie de la perla, y en las dos o tres rondas restantes con antígeno en solución, se mezclaron fagos y se recuperaron con perlas magnéticas. Después de las selecciones de scFv, la conversión a Fabs se realizó con RCA45 selectivo (anti-SpyC) o con un método basado en enzimas de restricción tipo II, de manera similar a lo publicado anteriormente46, seguido de la clonación nuevamente para mostrar el vector. Se llevaron a cabo nuevamente de tres a cuatro rondas panorámicas en formato Fab, de manera similar a antes. Después de la selección, las bibliotecas se clonaron en vectores de expresión (pLK06H para anti-NP1 y pAK400 para el resto). La biblioteca anti-NS1 fue un proyecto de maduración de afinidad construido con mutagénesis de saturación de sitio (ilustrado en la figura S15). Brevemente, se usó ADN anti-NS1 Fab 49A3 (descubierto en el Departamento de Tecnologías Vitales de la Universidad de Turku) como plantilla para generar un total de 20 subbibliotecas, cada una con un único codón aleatorizado en CDRH2 (9 subbibliotecas) o CDRH3 (11 subbibliotecas). -bibliotecas) utilizando cebadores NNK pedidos a Sigma Aldrich, EE. UU. Las bibliotecas generadas se clonaron directamente en el vector de expresión pAK400 para su selección. En los materiales complementarios se puede encontrar información más detallada sobre las selecciones de presentación de fagos, las conversiones y construcciones de Fab, incluidas las secuencias de Fab de control.

Las minipreparaciones, extracciones en gel y purificaciones por PCR se realizaron con kits GeneJet (Thermo Scientific, EE. UU.) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante, a menos que se indique lo contrario. La secuenciación de Sanger se compró como servicio a Macrogen Inc. (Corea del Sur). Se diseñaron y ordenaron a Sigma Aldrich dos conjuntos (para VH y VL) de 12 cebadores de índice de códigos de barras de pocillos directos y 8 inversos, que contienen hibridación de dominio variable, índices personalizados (con una distancia de edición mínima de 3) y secuencias de hibridación del adaptador de índice personalizado Illumina TruSeq ( EE.UU.) (que se muestra en la Tabla 1). Se utilizaron cebadores del kit TruSeq Custom Amplicon (Illumina inc., EE. UU.) como índices externos para los códigos de barras de las placas.

Las pruebas iniciales de los pares de cebadores de índice de pocillos se realizaron utilizando 1 ng de ADN plasmídico purificado del conocido anti-microcistina Fab 226A2 (descubierto en el Departamento de Tecnologías de la Vida de la Universidad de Turku) como plantilla para amplificar por PCR VH y VL en 20 \(\ upmu \)L volúmenes de reacción. Posteriormente, el volumen de reacción se redujo a 10 \(\upmu \)L y se evaluó la amplificación simultánea de los dos dominios variables tanto a partir de ADN plasmídico purificado como de una única colonia XL1 que expresa Fab como plantilla. La amplificación se evaluó con electroforesis en gel de agarosa al 1%. La reacción de PCR con código de barras del pozo consistió en 0,025 U/\(\upmu \)L de ADN polimerasa FirePol (Solis Biodyne, Estonia), 1\(\times \) tampón BD, 1,5 mM MgCl\(_2\), 25 \(\upmu \) \)M dNTP y cebadores 0,2 \(\upmu \)M. El termociclado fue de 35 ciclos de 95 \(^\circ \)C (30 s), 56 \(^\circ \)C (60 s) y 72 \(^\circ \)C (60 s) con un 95 \ (^\circ \)C (15 min) desnaturalización inicial al principio y 72 \(^\circ \)C (4 min) paso de elongación final al final. La siguiente reacción de PCR con código de barras en placa consistió en 0,02 U/\(\upmu \)L de ADN polimerasa de alta fidelidad Q5 (New England Biolabs, EE. UU.), 1\(\times \) tampón de reacción Q5, 200 \(\upmu \)M. dNTP y cebadores 0,5 \(\upmu \)M y el ciclo térmico fue de 8 ciclos de 98 \(^\circ \)C (10 s), 67 \(^\circ \)C (15 s) y 72 \( ^\circ \)C (30 s) con una desnaturalización inicial de 98 \(^\circ \)C (3 min) al principio y un paso de elongación final de 72 \(^\circ \)C (4 min) al final .

Además de la electroforesis, la fidelidad de las secuencias variables cuádruples indexadas de Fab 226A2 fueron secuenciadas por Sanger. Primero, se agregaron los sitios de restricción HindIII y BamHI con cebadores de hibridación P5 y P7 (TH260_BamHI-P5: 5\(^{\prime }\)-cggggatccAATGATACGCGACCACCGAG-3\(^{\prime }\) y TH261_HindIII-P7: 5\ (^{\prime }\)-tgcaagcttCAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-3\(^{\prime }\)) con una mezcla de reacción similar para la ADN polimerasa de alta fidelidad Q5 como antes y un ciclo térmico de 25 ciclos de 98 \(^\circ \) C (10 s), 69 \(^\circ \)C (30 s) y 72 \(^\circ \)C (30 s) con una desnaturalización inicial de 98 \(^\circ \)C (3 min) al principio y 72 \(^\circ \)C (4 min) paso de elongación final al final. Los amplicones se clonaron en el vector pUC19 digiriéndolos con BamHI y HindIII, seguido de extracción en gel y finalmente ligación usando ADN ligasa T4. Las construcciones se transformaron en XL1 mediante electroporación, se recuperaron y se sembraron como se describió anteriormente. A la mañana siguiente, se inocularon cuatro colonias de placas VH y VL en 5 ml de SB (triptona 30 g/l, extracto de levadura 20 g/l, MOPS 10 g/l), se cultivaron o/n, se usaron para minipreparaciones y se envió el ADN a secuenciación con el cebador LMB: 5\(^{\prime }\)-ATGTGCTGCAAGGCGATTAAG-3\(^{\prime }\).

Para la expresión de Fab soluble, se inocularon colonias individuales de XL1 desde una placa de agar primero al pocillo de PCR con código de barras que contenía 10 \(\upmu \)L de mezcla de reacción, y desde allí al cultivo primario al pocillo correspondiente en una placa de 96 pocillos que contenía 200 \\. (\upmu \)L de medio SB (30 g/L de triptona, 20 g/L de extracto de levadura, 10 g/L de MOPS) suplementado con 1 % de D-glucosa y antibióticos adecuados, seguido de incubación durante la noche a 37 \(^\circ \)C, 900 rpm. Después de la incubación, las células se inocularon en un cultivo de expresión, con cuatro inmersiones utilizando un replicador de 96 pocillos, en SB fresco suplementado con D-glucosa al 0,05% y antibióticos y se incubaron a 37 \(^\circ \)C con agitación estándar durante 4 h. Las placas de cultivo originales se almacenaron a -70 \(^\circ \)C después de agregar glicerol hasta una concentración final del 16 %. La expresión se indujo añadiendo IPTG a una concentración final de 200 \(\upmu \)M y reduciendo la temperatura a 26 \(^\circ \)C durante 16 h. Las células se sedimentaron mediante centrifugación a 4 \(^\circ \)C, 3200\(\times \)g durante 30 min. El sedimento se resuspendió en tampón de lisis (1 mg/ml de lisozima de clara de huevo de gallina L6876 (Sigma Aldrich, Reino Unido), 0,025 U/\(\upmu \)L de Pierce Universal Nuclease (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.) en PBS (20 mM). fosfato de sodio, cloruro de sodio 300 mM, pH 7,4), seguido de una incubación de 30 minutos a temperatura ambiente con agitación lenta y, finalmente, congelación a -70 \(^\circ \)C. El lisado se clarificó mediante centrifugación antes del inmunoensayo.

La unión al antígeno diana se midió con inmunoensayos basados ​​en fluorescencia resuelta en el tiempo (TRF). Se utilizaron concentraciones de antígeno que representan valores de EC\(_{20}\) de los Fabs de control. Los clones denominados S001E03 y N1G1 se utilizaron como controles positivos para la detección anti-SpyC y anti-NP1 y 2, respectivamente. Se descubrieron mediante el cribado previo de una sola placa (93 clones + 3 controles vacíos) y se seleccionaron en función de señales altas de TRF, lo que indica una unión a antígeno específica y niveles de expresión adecuados. Fabs 49A3 (el clon parental para el proyecto anti-NS1) y 248G12 (el control positivo para la detección anti-DARPin) se descubrieron en proyectos anteriores en el Departamento de Tecnologías de la Vida de la Universidad de Turku, y demostraron tener buenos niveles de expresión y antígeno. vinculante (no publicado). Las secuencias Fab de control, con excepción de 49A3, se enumeran en la Tabla S3. Los inmunoensayos se realizaron en placas recubiertas con estreptavidina (Kaivogen Oy, Finlandia) o con IgG antihumana de cabra (específica de Fab, más adelante denominada "GAH") (Sigma Aldrich, EE. UU.). Las placas GAH se prepararon mediante recubrimiento pasivo sobre placas C12 MaxiSorp (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.), que se describen en detalle en el material complementario. Todas las diluciones para inmunoensayos se realizaron usando Assay Buffer Red y lavados usando tampón Kaivogen Wash, ambos adquiridos de Kaivogen. Para el lavado de placas se utilizó el instrumento Delfia Plate Wash (Wallac, Turku Finlandia). Todas las incubaciones se realizaron a temperatura ambiente con agitación lenta. Las placas de inmunoensayo se leyeron con Victor 1420 Multilabel Counter (Wallac).

Para Fabs anti-SpyCatcher, se agregaron 100 \(\upmu \)L de dilución 1:5 de lisado clarificado por pocillo en una placa GAH y se incubó durante 1 h, seguido de 2 lavados. Se agregaron 100 \(\upmu \) L de SpyCatcher marcado con N1-Europio 62,35 nM (producido y etiquetado en el Departamento de Tecnologías de la Vida de la Universidad de Turku) y se incubaron durante 1 h, seguido de 4 lavados y la adición de 200 \(\upmu \) \)L Solución de mejora Delfia (Kaivogen). Después de 10 minutos de incubación, se midió el TRF Víctor.

De manera similar, para Fabs anti-DARPin, se agregaron 100 \(\upmu \)L de dilución 1:5 de lisado clarificado por pocillo en una placa GAH y se incubó durante 1 hora, seguido de 2 lavados. Se agregaron 100 \(\upmu \)L de 62,7 nM de BiLib DARPin-SpyC biotinilado (producido y etiquetado en el Departamento de Tecnologías de la Vida, Universidad de Turku, ver Materiales suplementarios) y se incubaron durante 1 h, seguido de 2 lavados y adición de 100 \(\upmu \)L de estreptavidina marcada con N1-Europio (más tarde SA-Eu, comprada en BioSpa, Italia y etiquetada en el Departamento de Tecnologías de la Vida, Universidad de Turku). Después de 20 minutos de incubación, los pocillos se lavaron dos veces y se agregaron 200 \(\upmu \)L de solución de mejora Delfia (Kaivogen), seguido de 10 minutos de incubación y medición de TRF con Victor.

Para la detección de Fab anti-NS1, se utilizó como antígeno la proteína no estructural biotinilada del virus del dengue 2 (bio-NS1) (comprada en The Native Antigen Company, Reino Unido y biotinilada con EZ-Link NHS-PE\(G_4\)-Biotina con 12\(\times \) exceso molar de biotina, según el protocolo del fabricante). El inmunoensayo se realizó igual que para los Fab anti-DARPin, siendo la concentración de bio-NS1 de 50 ng/ml. La detección anti-NP-2 también se realizó en placas GAH con un protocolo similar, aunque con tiempos de incubación más cortos para el lisado y el antígeno (30 min). La proteína de nucleocápside del SARS-CoV-2 con etiqueta GST (proporcionada amablemente por el Prof. Julkunen, Instituto de Biomedicina de la Universidad de Turku, consulte los materiales complementarios) se biotiniló internamente de manera similar a bio-NS1 y se usó como antígeno para la detección en concentración. de 10 nM. El mejor candidato Fab, RS016D01, se eligió basándose en el análisis de datos de selección preliminar, se expresó igual que se describió anteriormente y se purificó con NiNTA y cromatografía de exclusión por tamaño. RS016 se biotiniló de manera similar a antes y se usó como Fab de captura para la detección anti-NP-1.

A diferencia de otras campañas de detección, la detección anti-NP-1 se realizó en placas de estreptavidina amarillas (Kaivogen Oy, Finlandia). Se agregaron 60 \(\upmu \)L de bio-RS016 Fab 30 nM a los pocillos prelavados y se incubaron durante 30 minutos, seguido de 4\(\times \) lavado y la adición de 60 \(\upmu \)L de 10 nM. Antígeno N-GST. Después de otros 30 minutos de incubación y 2 lavados, se añadió una dilución 1:5 de lisado clarificado por pocillo y se incubó durante 30 minutos, seguido de 2 lavados. 60 \(\upmu \)L de anticuerpo policlonal antifosfatasa alcalina (AP) marcado con N1-Eu (anti-AP pAb) (LifeSpan Biosciences, Inc., EE. UU., etiquetado en el Departamento de Biotecnología, Universidad de Turku15) en concentración Se añadió 125 ng/mL por pocillo, se incubó durante 30 min y se lavó 2 veces. La mejora y medición se hicieron igual que arriba.

Paralelamente al cribado funcional de los Fab, se realizaron dos reacciones de PCR de indexación, dirigidas a dominios variables de Fab. Se recogió una única colonia bacteriana de la placa de agar en una mezcla de reacción de PCR con código de barras de 10 \(\upmu \)L de pocillos, se preparó en placas de PCR Armadillo de 96 pocillos (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.) y de allí a la expresión como se describe en la subsección anterior. La PCR con código de barras del pozo consistió en 0,025 U/\(\upmu \)L de ADN polimerasa FirePol (Solis Biodyne, Estonia), 1\(\times \) Buffer BD, 1,5 mM MgCl\(_2\), 25 \(\upmu \). )M dNTP y 0,2 \(\upmu \)M cebadores de indexación personalizados. El termociclado fue de 35 ciclos de 95 \(^\circ \)C (30 s), 56 \(^\circ \)C (60 s) y 72 \(^\circ \)C (60 s) con un 95 \ (^\circ \)C (15 min) desnaturalización inicial al principio y 72 \(^\circ \)C (4 min) paso de elongación final al final. Se agruparon 5 \(\upmu \)L de cada pocillo y se purificaron por lotes utilizando el kit de purificación por PCR GeneJet. Después de la reacción de PCR con código de barras en la placa, también se concluyó en placas Armadillo de 96 pocillos con un volumen de 20 \(\upmu \)L. La PCR original consistió en 1 ng de ADN molde, 0,02 U/\(\upmu \)L Q5 ADN polimerasa de alta fidelidad (Thermo Scientific, EE. UU.), 1 \(\times \) X PhusionTM HF Buffer, 200 \(\upmu \(\upmu \)L \)M dNTP, y cebadores 0,5 \(\upmu \)M con ciclado térmico de 20 ciclos de 98 \(^\circ \)C (10 s), 72 \(^\circ \)C (40 s) con una desnaturalización inicial de 98 \(^\circ \)C (3 min) al principio y un paso de elongación final de 72 \(^\circ \)C (4 min) al final. Después del descubrimiento de la formación de quimeras, la reacción de PCR se optimizó de la siguiente manera; 2 ng de ADN molde, 0,02 U/\(\upmu \)L Q5 ADN polimerasa de alta fidelidad (New England Biolabs, EE. UU.), 1 x tampón de reacción Q5, 200 \(\upmu \)M dNTP y 0,5 \( \upmu \)M cebadores con ciclado térmico de 8 ciclos de 98 \(^\circ \)C (10 s), 67 \(^\circ \)C (15 s) y 72 \(^\circ \)C (30 s) con una desnaturalización inicial de 98 \(^\circ \)C (3 min) al principio y un paso de elongación final de 72 \(^\circ \)C (4 min) al final. Se combinaron y purificaron en lotes 15 \(\upmu \)L de cada muestra dentro de las mismas bibliotecas, de manera similar a lo anterior. El producto de PCR restante se usó como control de calidad y se usó para análisis de electroforesis ejecutándolo en gel de agarosa al 1% a 70 V durante 90 minutos.

Para la selección del tamaño de la biblioteca y la normalización de la entrada por biblioteca por dominio, los genes de los dominios VH y VL completamente indexados se separaron con electroforesis en gel de agarosa al 2%, se ejecutaron a 70 V durante 2 h, seguido de la extracción de ADN con el kit de extracción en gel GeneJet. Todas las muestras resultantes se agruparon en proporciones molares iguales. La secuenciación se compró como servicio del Centro Genómico Funcional de Finlandia (Turku, Finlandia), donde la calidad de la biblioteca se evaluó por primera vez utilizando un bioanalizador 2100 con un kit de ensayo de ADN de alta sensibilidad (Agilent, EE. UU.) y se cuantificó utilizando Qubit (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.). Se secuenció una biblioteca de 9 pM suplementada con PhiX Sequencing Control V3 al 10 % (Illumina, EE. UU.) en MiSeq utilizando el MiSeq Reagent Kit v3 (600 ciclos) (Illumina).

Después de la secuenciación de los cinco clones de la biblioteca Fab, Sanger verificó aún más la fidelidad de la plataforma secuenciando una de las placas de 96 pocillos seleccionadas (placa RS016 de anti-NP-2). Se inocularon células de la placa de preparación de glicerol en SB fresco en placas de 96 pocillos y se cultivaron durante la noche igual que antes. A la mañana siguiente, se usó 1 \(\upmu \)L de células en una reacción de PCR, similar a la codificación de barras de pozo, para amplificar los genes Fab usando los cebadores ULa03_20: TCCGGCTCGTATGTTGTGTGG y SAk_06: CGAGAAAGGAAGGGAAGAAAGCGAAAGGAG. El ciclo térmico fue de 30 ciclos de 95 \(^\circ \)C (30 s), 65 \(^\circ \)C (30 s) y 72 \(^\circ \)C (2 min) con un 95 \(^\circ \)C (3 min) desnaturalización inicial al principio y 72 \(^\circ \)C (4 min) paso de elongación final al final. El ADN se purificó utilizando el kit de purificación por PCR PureLink Pro 96 (Invitrogen, EE. UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante y se envió a secuenciación con los cebadores WO375: TCACACAGGAAACAGCTATGAC o HS003: ATCTTCTGCCGACTGCTGCG. Se compararon secuencias de VH y VL sanger de buena calidad con las secuencias más abundantes en cada posición de índice de NGS (coincidencia exacta).

La calidad de los archivos FASTQ después de cada paso se analizó utilizando FASTQC47 v0.11.9 junto con MultiQC48 v1.11. Los pares de lectura se fusionaron y prefiltraron usando PEAR49 v0.9.11 con parámetros -v 25 -m 600 -n 400 -q 20 -y 4G -j 6. El software Illumina realizó automáticamente la demultiplexación de los códigos de barras de placas (índices TruSeq) al generar FASTQ sin formato archivos. El origen de las lecturas "indeterminadas" se analizó utilizando BLAST50. La demultiplexación de códigos de barras y la separación y extracción de secuencias VH y VL se realizaron mediante un bucle a través de archivos FASTQ fusionados y una lista de índices con un script UNIX personalizado usando expresiones regulares. En este punto, los archivos se convirtieron al formato FASTA. La comparación de índices se realizó con la herramienta UNIX agrep51 para permitir una discrepancia y la extracción de dominio variable con egrep, ambas disponibles gratuitamente en los repositorios de Ubuntu. Las secuencias únicas de cada muestra se colapsaron y contaron con fastx_collapser de FASTX-toolkit52. Se extrajeron el recuento de secuencia total y los dos recuentos de secuencia más abundantes para cada muestra y se utilizaron para filtrar muestras sin secuencia Fab (Fórmula 1) o fondo de secuencia alta (Fórmula 2). Los códigos y scripts UNIX que describen el análisis de datos hasta el filtrado se pueden encontrar al final de los materiales complementarios. Se utilizaron muestras en las que tanto las secuencias VH como VL pasaron los filtros para las selecciones de candidatos. Los límites para los filtros se establecieron en base a los datos de la verificación de secuenciación de Sanger de la placa RS016.

Los datos tabulados de inmunoensayo y secuenciación se analizaron utilizando Python 3.8 con los paquetes pandas (v1.4.3), numpy (v.1.22.3), scipy (v1.7.3) y se visualizaron utilizando los paquetes matplotlib (v3.5.1) y seaborn (v0. 11.2). Las secuencias de ADN se tradujeron utilizando el módulo Seq del paquete Biopython53 (v1.79) y las secuencias de aminoácidos traducidas se numeraron utilizando ANARCI54 (v2020.04.23) hasta AbNumber (v0.2.7). Se ajustó una función logística de cuatro parámetros a los datos de EC\(_{50}\) con scipy (v1.8.0) para estimar las afinidades aparentes. Todos los paquetes de Python usados ​​están disponibles gratuitamente en los repositorios de Anaconda. Se utilizó la prueba U de Mann-Whitney de dos colas del paquete scipy para comparar las señales deficientes de TRF del genotipo anti-NS1 desde la detección con el genotipo parental. Se seleccionaron cinco clones de diferentes subbibliotecas para comparar.

La simulación de la prueba T también se realizó con Python. Para generar los datos, se usó la función ttest_ind del módulo de estadísticas del paquete scipy en bucle con datos generados aleatoriamente con distribución normal usando la función normal del módulo aleatorio de numpy. Ambos grupos se generaron con la misma desviación estándar (calculada a partir de cv) con valores medios de 3 y 6 (= diferencia doble). Brevemente, se probaron tamaños de grupos de dos a 20 con un cv que oscilaba entre el 5 y el 50 % con intervalos del 5 %. Para cada combinación de tamaño de muestra: cv, los datos se regeneraron 1000 veces y luego se ejecutó la prueba t bilateral y los valores p de cada iteración recopilada. El tamaño de muestra mínimo requerido para una diferencia doble estadísticamente significativa para una varianza dada se calculó a partir de los valores p medios, estableciendo el nivel de significancia en p \(\le \) 0,05.

Las selecciones de clones se realizaron en función de la relación señal a fondo (S/B) del inmunoensayo de detección dividiendo la señal de fluorescencia resuelta en el tiempo de cada clon con la señal media de los controles vacíos de la misma placa de detección. Se realizaron y compararon selecciones ciegas y asistidas por genotipo de clones candidatos de cada biblioteca seleccionada. El genotipo de cada clon se definió como una combinación única de secuencias VH y VL, excepto para la biblioteca anti-NS1, donde cada clon solo tenía una mutación en una posición específica de CDRH2 o CDRH3. En la selección ciega, los clones excluyendo los pocillos de control conocidos se clasificaron según el S/B y se seleccionaron los 10 o 20 mejores clones y se contó el número de genotipos únicos. En la selección asistida por genotipo, los datos de inmunoensayo funcional se agruparon por genotipo y las selecciones se realizaron en función del S/B máximo de cada grupo de genotipo. Para la evaluación retrospectiva de la calidad de la biblioteca, se calculó el número de genotipos únicos y el recuento de clones dentro de los grupos. Para las bibliotecas anti-NS1, se calculó el número de residuos de aminoácidos únicos en cada posición mutada. A modo de comparación, también se seleccionaron genotipos de bajo rendimiento de la biblioteca anti-NS1. Los genotipos con más de tres clones y con una diferencia estadísticamente significativa en el ensayo de detección S/B (p <0,05, prueba U de Mann-Whitney de dos colas) en comparación con los parentales se consideraron candidatos para el ensayo EC\(_{50}\).

Los inmunoensayos EC\(_{50}\) TRF se concluyeron en placas GAH (ver Materiales complementarios). Todas las incubaciones se realizaron a temperatura ambiente con agitación lenta. Brevemente, los lisados ​​clarificados de cultivos de expresión de 5 ml (aumentados a partir de la expresión en placa de 96 pocillos) se diluyeron 1:5 (anti-NS1) o 1:10 (anti-DARPin) en AB y se agregaron 100 \(\upmu \)L. a cada pozo. Las placas se incubaron durante 1 h, seguido de la adición de 100 \(\upmu \)L de antígeno biotinilado por triplicado, con excepción de dos concentraciones más fuertes para las cuales solo se usó un pocillo. Diluciones de 1000, 500, 50, 25, 5, 1, 0,1, 0,01 y 0,001 ng/mL de bio-DENV2-NS1 y 10.000, 2000, 1000, 500, 250, 75, 10, 1 y 0,1 ng/mL en AB se utilizaron para ensayos anti-NS1 y anti-DARPin, respectivamente. Para los aglutinantes anti-NS1 deficientes, se eliminaron dos de las concentraciones más bajas y se aplicaron dos más fuertes por triplicado. Después de la adición del antígeno, las placas se incubaron durante 2 h, seguido de dos lavados y la adición de 100 \(\upmu \)L de SA-Eu filtrado, 100 ng/mL. Después de 15 minutos de incubación, los pocillos se lavaron dos veces y se agregaron 200 \(\upmu \) L de solución de mejora Delfia. Finalmente, después de 10 minutos de incubación, la señal TRF se midió utilizando el contador multietiqueta Victor 1420.

Los datos sin procesar de NGS generados y analizados durante el estudio actual están disponibles en Sequence Read Archive (SRA), con el número de acceso PRJNA951910. Los datos relacionados con los aglutinantes NS1 anti-Dengue están disponibles previa solicitud al autor correspondiente.

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Este estudio fue financiado por la Escuela de Graduados de la Universidad de Turku (UTUGS), Business Finland (Subvención No. 2448/31/2018) y el Programa Insignia InFLAMES de la Academia de Finlandia (Número de decisión: 337530). Los autores desean agradecer al Centro Finlandés de Genómica Funcional apoyado por la Universidad de Turku, la Universidad Åbo Akademi y Biocenter Finland por el servicio de secuenciación MiSeq. Por último, les gustaría extender nuestro sincero agradecimiento al Dr. Stuart Prince por su meticulosa revisión del manuscrito y sus invaluables comentarios para mejorar la claridad y calidad del texto.

Departamento de Ciencias de la Vida, Universidad de Turku, 20520, Turku, Finlandia

Sami Oksanen, Roope Saarinen, Anttoni Korkiakoski, Urpo Lamminmäki y Tuomas Huovinen

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SO realizó los experimentos, analizó los datos y escribió el artículo. TH y SO diseñaron la estrategia de indexación y los cebadores y planificaron los experimentos. TH y UL revisaron el manuscrito y dieron notas para mejorarlo. AK y RS ayudaron con la detección funcional de los Fabs anti-DARPin y anti-NS1 solubles, respectivamente.

Correspondencia a Sami Oksanen o Tuomas Huovinen.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Oksanen, S., Saarinen, R., Korkiakoski, A. et al. La detección funcional genotipada de clones Fab solubles permite un análisis en profundidad de los efectos de las mutaciones. Representante científico 13, 13107 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-40241-2

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Recibido: 04 de abril de 2023

Aceptado: 07 de agosto de 2023

Publicado: 11 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-40241-2

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