Análisis patológico y susceptibilidad antimicrobiana de Chryseobacterium balustinum RTFCP 298 aislado de trucha arco iris enferma, Oncorhynchus mykiss

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 13268 (2023) Citar este artículo

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En este estudio, se caracterizaron seis aislamientos de Chryseobacterium balustinum a partir de alevines de trucha arco iris enfermos. Se investigaron las características de virulencia, patogenicidad y patrón de susceptibilidad a los antimicrobianos de estos aislados. La bacteria mostró resultados positivos para catalasa, citocromo oxidasa e hidrólisis de esculina, mientras que se obtuvieron resultados negativos para DNasa, gelatinasa, rojo de metilo, reacción de Voges-Proskauer, citrato de Simon, sulfuro de hidrógeno e hidrólisis de almidón. El análisis del metabolismo de los aminoácidos reveló la incapacidad de metabolizar la arginina, la lisina y la ornitina descarboxilasa. La caracterización molecular (ARNr 16S) y el análisis filogenético revelaron que los aislados de prueba eran C. balustinum, estrechamente relacionado con la cepa WLT (99,85 % de similitud) y C. balustinum P-27 (99,77 %). El ensayo de virulencia indicó actividad hemolítica y formación de biopelículas por parte de la bacteria de prueba. La prueba de provocación confirmó una patogenicidad moderada en la trucha arco iris y estableció los postulados de Koch. Las manifestaciones clínicas de la infección incluyeron erosión de las aletas, hemorragia de la superficie ocular y corporal, exoftalmia y licuefacción de órganos. Las concentraciones inhibidoras mínimas de varios antimicrobianos oscilaron entre 1 y > 256 µg ml-1. Los nuevos péptidos antimicrobianos sintéticos exhibieron CMI de 8 a > 256 µg ml-1, lo que sugiere un posible método de control. Estos hallazgos sugieren que C. balustinum es un patógeno oportunista con patogenicidad moderada en la trucha arco iris. Es necesaria más investigación sobre la relación huésped-patógeno para comprender las características de virulencia y patogenicidad en la acuicultura.

El establecimiento inicial del género Chryseobacterium implicó la reclasificación de seis taxones bacterianos previamente asignados al género Flavobacterium, a saber, F. balustinum, F. indologenes, F. gleum, F. meningosepticum, F. indoltheticum y F. scophthalmum1. Los avances recientes en biología molecular y biotecnología han contribuido a mejorar la claridad taxonómica y la identificación de nuevas especies de criseobacterias2. Como parte de los cambios taxonómicos dentro de la familia Flavobacteriaceae, dos especies inicialmente clasificadas en el género Chryseobacterium, a saber, C. meningosepticum y C. miricola, fueron posteriormente asignadas a un nuevo género llamado Elizabethkingia3. En 2006, el género Chryseobacterium se había expandido para abarcar 10 especies y actualmente comprende más de 60 especies4. Taxonómicamente, Chryseobacterium se clasifica en el Filo Bacteroidota, Clase Flavobacteriia, Orden Flavobacteriales, Familia Weeksellaceae y Género Chryseobacterium.

Criseobacterium spp. están asociados con diversas infecciones tanto en humanos como en animales. Entre ellas, C. meningosepticum es la especie más comúnmente implicada en infecciones humanas, causando afecciones como meningitis neonatal, neumonía, bacteriemia, sepsis e infecciones de tejidos blandos, que afectan principalmente a pacientes inmunocomprometidos5,6,7,8. Otras especies de Chryseobacterium, aisladas de diversas fuentes clínicas y ambientales, incluyen C. indologenes9 y C. gleum1. En animales, se han detectado criseobacterias en el intestino medio de mosquitos, el intestino de cucarachas, heces de milpiés, guano de pingüino, homogenados intestinales de copépodos de agua dulce, plumas de aves, leche de vaca, carnes crudas y pollo10,11,12,13,14. 15,16,17,18,19,20. El género Chryseobacterium también ha sido identificado como un patógeno en varias especies de peces, y las especies de Chryseobacterium se consideran patógenos potenciales emergentes tanto en peces de agua dulce como marinos a nivel mundial4,21,22,23,24,25. C. balustinum se aisló inicialmente de escamas de fletán (Hippoglossus hippoglossus) en el Océano Pacífico26. En los últimos años, se han identificado varias especies de Chryseobacterium de diversas fuentes, incluidos los teleósteos, y se han asociado con enfermedades bacterianas de las branquias y septicemia hemorrágica sistémica en rodaballo, Scophthalmus maximus L, pez globo, trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss), salmón del Atlántico (Salmo salar ), y mahseer dorado (Tor putitora)21,22,23,24,27,28,29. La incidencia de la infección por Chryseobacterium en animales ha ido aumentando en Corea del Sur, lo que enfatiza la importancia del seguimiento y la investigación continuos sobre este patógeno emergente20. Además, las especies de Chryseobacterium han demostrado niveles elevados de resistencia a los antibióticos, incluida la resistencia a los antibióticos de último recurso, lo que genera preocupaciones sobre sus implicaciones clínicas y su potencial de transmisión zoonótica30,31.

En este estudio, nuestro objetivo fue investigar la aparición de infección por Chryseobacterium en truchas arco iris, criadas en canales de flujo en la India. Al emplear una combinación de técnicas de pruebas bioquímicas y moleculares, identificamos con éxito la bacteria. Para evaluar su patogenicidad, realizamos pruebas de virulencia y un ensayo de provocación. Además, nuestra investigación descubrió una estrategia distintiva para controlar el crecimiento de Chryseobacterium in vitro mediante la determinación de su concentración inhibidora mínima contra nuevos péptidos antimicrobianos sintéticos y otros antibióticos.

Los protocolos experimentales realizados y el uso de trucha arco iris en el estudio fueron aprobados por el Comité de Uso y Cuidado de Animales del Instituto (IACUC) de la Dirección de Investigación Pesquera de Aguas Frías del ICAR, Bhimtal India (expediente n.º ICAR-DCFR/IACUC/12/06 /2020/07-B) y estaban de acuerdo con el Comité Institucional de Bioseguridad (IBSC), el Departamento de Biotecnología (DBT) y el Ministerio de Ciencia y Tecnología, Gobierno de la India, según las Reglas para “Fabricación, Uso/Importación/Exportación y Almacenamiento de Microorganismos Peligrosos/Organismos o Células Modificados Genéticamente, 1989 (Reglas de 1989) de la Ley (Protección) del Medio Ambiente de 1986”. El estudio se realizó siguiendo las directrices y normativas pertinentes. Además, también afirmamos que los métodos y resultados presentados en el estudio estaban de acuerdo con las directrices y regulaciones de ARRIVE32.

Se obtuvieron veinte (n = 20) truchas arco iris juveniles moribundas (longitud media 16,5 ± 0,125 cm; peso medio 34,5 ± 0,512 g) de tres granjas de trucha arco iris, ubicadas en la región del Himalaya indio. Se tomaron muestras de seis truchas arco iris enfermas de la granja 1, mientras que las granjas 2 y 3 proporcionaron 7 individuos enfermos cada una. Se recolectó una muestra representativa de peces de la población afectada en cada granja con fines de diagnóstico e investigación. La aparición de enfermedades no se observó en toda la finca. En cambio, las infecciones se limitaron a sólo 2 o 3 conductos dentro de cada granja. Las truchas arco iris enfermas recolectadas exhibieron manifestaciones patológicas, incluidas hemorragias en la superficie dorsal del cuerpo, pigmentación negra, pudrición de las aletas y lesiones profundas en las regiones del pedúnculo caudal. Con el fin de identificar posibles infecciones parasitarias o virales, se seleccionó cuidadosamente un subconjunto de 10 especímenes moribundos de trucha arco iris para su procesamiento y examen, que comprende 3 especímenes de la granja 1, 3 de la granja 2 y 4 de la granja 3. y se recogieron raspados de la superficie corporal de la trucha arco iris en portaobjetos previamente limpiados y se sometieron a análisis microscópico para identificar cualquier infección parasitaria. Además, se emplearon cebadores de PCR degenerados dirigidos a las ADN polimerasas de herpesvirus acuáticos, poxvirus, iridovirus y adenovirus en hígado y riñón para detectar firmas virales33,34.

Se obtuvieron muestras de agua de las tres granjas de trucha arco iris para evaluar parámetros cruciales de calidad del agua, incluida la temperatura del agua, el oxígeno disuelto, el pH, el total de sólidos disueltos y el nitrógeno amoniacal total. Las mediciones se realizaron utilizando una sonda digital (HANNA HI 9829, HI Media TDS/TEMP-3) y un kit comercial de parámetros de calidad del agua según las instrucciones del fabricante (HIMEDIA WT028, WT042A).

Los 10 especímenes vivos restantes fueron procesados para la investigación bacteriológica. Se recogieron muestras de hisopo de las regiones del pedúnculo caudal de los especímenes de trucha infectada. Para la recolección de muestras de tejido (hígado y riñón), los juveniles de trucha fueron sacrificados a 150 mg L-1 de metanosulfonato de etil-3-aminobenzoato (MS 222) para llevarlos a puntos finales humanitarios35,36. Luego, las muestras se desinfectaron con etanol al 70% antes de recolectar las muestras de tejido para aislar bacterias patógenas como agentes etiológicos de las condiciones patológicas e infecciones registradas en el estudio. Las muestras de tejido e hisopo se procesaron asépticamente en diferentes medios; Agar Shieh (complementado con 0,5 µg mL-1 de tobramicina; pH 7,2) y agar Hsu-Shotts (complementado con 4,0 µg mL-1 de sulfato de neomicina; pH 7,2). Las placas se incubaron a 15 °C durante 1 semana y a 25 °C durante 24 a 48 h. Las placas incubadas a 25 °C mostraron crecimiento de colonias pigmentadas viscosas de color amarillo, mientras que las placas incubadas a 15 °C no mostraron el desarrollo de colonias pigmentadas viscosas de color amarillo. Las colonias amarillentas y con predominancia de limo (n = 6) se seleccionaron al azar y se examinaron para la prueba de KOH al 30%. Los aislados se subcultivaron adicionalmente en agar Tryptic Soya (TSA) a 25 °C durante 24 a 48 h y se conservaron en glicerol al 20% a -20 °C para almacenamiento a largo plazo.

La identificación bioquímica de los aislados se realizó según los métodos estándar publicados anteriormente37,38,39. Siguiendo el protocolo del fabricante, la reacción de Gramme de los aislados bacterianos se determinó utilizando un kit de tinción de Gram (HI MEDIA K001-1KT). Los aislados fueron analizados para detectar reacciones bioquímicas básicas como citocromo oxidasa, catalasa, citrato de Simon, rojo de metilo (MR), reacción de Voges-Proskauer (VP), sulfuro de hidrógeno, hidrólisis de almidón y esculina, DNasa y gelatinasa, ureasa, nitrato, indol, tirosina, arginina dihidrolasa, lisina descarboxilasa y ornitina descarboxilasa. También se les realizó pruebas para determinar la producción de ácido a partir de azúcares; manitol, rafinosa, manosa, sacarosa xilosa, salicina, trehalosa, inositol, glucosa, arabinosa y lactosa para análisis bioquímicos. En resumen, se colocó en una placa de Petri un trozo de papel de filtro estéril impregnado con reactivo de oxidasa recién preparado. Se extendió una franja del cultivo bacteriano de prueba sobre el papel de filtro con la ayuda de una prueba de citocromo oxidasa con asa de platino estéril. Para la prueba de catalasa, la colonia de la bacteria de prueba se untó sobre un portaobjetos de vidrio limpio. Luego se colocó sobre el frotis una gota de H2O2 al 30%. La capacidad de las bacterias de prueba para utilizar citrato como única fuente de carbono se probó haciendo crecer el cultivo en agar citrato Simmons inclinado durante 24 a 48 h a 28 °C. Para la prueba de RM, se agregaron unas gotas de reactivo rojo de metilo al cultivo cultivado durante 48 a 72 h en caldo MR-VP. En el caso de la prueba de VP, se agregaron reactivos de VP (solución A - 0,6 ml y solución B - 0,2 ml) al cultivo bacteriano cultivado durante 48 a 72 h en el caldo MR-VP. Asépticamente, se transfirió un asa del cultivo bacteriano al caldo de soja Tryptic y se incubó durante 24 a 48 h a 28 °C. Una vez que se observó el crecimiento bacteriano en el caldo, se añadió una solución de sulfato ferroso como indicador de sulfuro de hidrógeno al caldo cultivado con cultivo bacteriano en la prueba de sulfuro de hidrógeno. La prueba de hidrólisis del almidón se llevó a cabo mediante la inoculación puntual de un cultivo bacteriano de prueba joven en una placa de agar de almidón. Después de 18 a 24 h de incubación a 28 °C, las placas se inundaron con solución de yodo de Lugol. En el caso de la prueba de esculina, las células bacterianas se inocularon en caldo de esculina y se incubaron a 28 °C durante 24 a 48 h. Se sembró un asa de cultivo bacteriano como una sola línea en placas de agar DNasa. Las placas se incubaron a 28 °C durante 2 a 4 días. Después del período de incubación, las placas se inundaron con HCl al 1%. Para la prueba de gelatinasa, la placa de gelatina se inoculó con cultivo bacteriano y se incubó a 28 °C durante 24 a 48 h. Para la prueba de ureasa, se permitió que las bacterias de prueba crecieran en agar con urea inclinado a 28 °C durante 6 a 24 h y se observaron durante 6 días. La prueba de nitrato se realizó mediante inoculación por punción o raya del cultivo de prueba en tubos de agar nitrato, seguido de la incubación de los tubos a 28 °C durante 24 a 48 h. Luego se añadió solución de nitrato al tubo. La prueba de indol se realizó añadiendo un inóculo pesado del cultivo de prueba en caldo de triptona en tubos. Los tubos se incubaron durante un período de 48 h a 28 °C. Luego se agregaron a los tubos de 6 a 7 gotas de reactivo de Kovacs. En la prueba de tirosina, se inoculó un cultivo de prueba con asa en caldo de tirosina y el cultivo se incubó a 28 °C durante 24 a 48 h. Después de observar el crecimiento bacteriano, se insertó un tubo Durham en el caldo de tirosina y se dejó incubar a 28 °C durante 24 a 48 h más. La capacidad del cultivo bacteriano de prueba para producir arginina dihidrolasa, lisina descarboxilasa y ornitina descarboxilasa se probó inoculando el cultivo de prueba en el medio que contenía estos 3 aminoácidos en tubos separados. Los tubos se cubrieron con parafina líquida estéril y se incubaron a 28 °C. También se incubaron tubos control con el medio basal para cada prueba. Los tubos fueron observados durante una semana. La capacidad de las bacterias para producir ácido a partir de azúcares; Se probaron manitol, rafinosa, manosa, sacarosa xilosa, salicina, trehalosa, inositol, glucosa, arabinosa y lactosa suplementando el medio basal con azúcar individual en tubos separados. Luego los tubos se inocularon con cultivo bacteriano y se incubaron a 28 °C.

Se utilizó el kit de aislamiento de ADN Promega para procesar las colonias que habían crecido en la placa de agar para aislar el ADN y analizar el gen 16S rRNA mediante PCR. Para la amplificación por PCR, se utilizaron el cebador universal UFF2 (5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3') y URF2 (5′-ACG GGC GGT GTG TTC-3') dirigidos al gen 16S rRNA. En la reacción de PCR se logró la amplificación de amplicones con un tamaño de 1400 pares de bases. El producto de PCR se envió para secuenciación de nucleótidos mediante el método de secuenciación de Sanger con la ayuda de un kit ABI Big Dye Terminator Cycle Sequencing v3.1 y ABI 3730 XL (Applied Biosystems). Se ensamblaron las secuencias parciales directa e inversa del gen 16S rRNA (software CLC Genomics Workbench, versión 11.0.1) y se realizó la búsqueda de similitud con otras Chryseobacterium spp., utilizando BLASTn (NCBI, Bethesda, MD, EE. UU.). Se encontró que los genes 16S rRNA de todos los aislados (n = 6) eran 100% idénticos. El aislado de prueba se designó como cepa de laboratorio número RTFCP 298 y se envió al NCBI como C. balustinum, RTFCP 298 (OP 604186) como representante. Las secuencias estrechamente relacionadas de C. balustinum RTFCP 298 y otras especies del género se recuperaron del NCBI junto con cepas tipo y algunos aislados indios. Las múltiples alineaciones fueron realizadas por CLUSTAL W40.

Las secuencias alineadas se utilizaron para inferir la historia evolutiva de acuerdo con el algoritmo de unión de vecinos41 mediante Análisis Genético Evolutivo Molecular (MEGA X)42. Se utilizaron el método de máxima verosimilitud y el modelo de 2 parámetros de Kimura para inferir la historia evolutiva, y se presenta el árbol con la probabilidad logarítmica más alta (- 6459,57), junto con el porcentaje de taxones asociados agrupados. Para obtener el árbol inicial para la búsqueda heurística, se aplicó el método de Unión de Vecinos a una matriz de distancias por pares estimada utilizando el enfoque de Máxima Verosimilitud Compuesta (MCL). El árbol se dibujó a escala, midiendo las longitudes de las ramas en sustituciones por sitio. El análisis involucró 22 secuencias de nucleótidos, incluidos los sitios primero, segundo, tercero y no codificantes, con un total de 1548 posiciones en el conjunto de datos final. La cepa NCCB 22016 (NR042387) de Acinetobacter calcoaceticus se incluyó en el análisis filogenético como un grupo externo.

Se realizaron ensayos de biopelículas43 y actividades hemolíticas para la determinación fenotípica de las características de virulencia in vitro de C. balustinum RTFCP 298.

En placas de microtitulación de poliestireno de fondo plano de 96 pocillos, se sembraron 30 µL de 108 UFC mL-1 C. balustinum RTFCP 298 con 200 µL de diferentes medios de crecimiento (HSU-SHOT, Cytophaga y SHIEH) con glucosa y sin glucosa (0,45%) e incubado a 25 ° C durante 24 a 48 h. Las células planctónicas se eliminaron lavando dos veces con solución salina tampón fosfato (PBS) a pH 7,4. La tinción se realizó añadiendo 150 µL de cristal violeta al 0,1% y se mantuvo en incubación durante 1 h a 25 °C seguido de lavado con PBS (pH 7,4). Finalmente, la mancha adquirida por bacterias adherentes se resolvió agregando 200 µL de etanol al 95% y se mantuvo a 4 °C durante 1 h. La formación de biopelículas se cuantificó midiendo la densidad óptica a 590 nm.

El ensayo hemolítico se realizó en una placa de microtitulación de poliestireno con fondo en U de 96 pocillos, utilizando sangre de oveja desfibrinada44. La sangre de oveja desfibrinada fresca recogida asépticamente se lavó tres veces con PBS, se centrifugó durante 10 minutos a 1000 xg y se resuspendió al 10% (v/v) en PBS, que contenía ditiotreitol (DTT) 10 mM. Los eritrocitos de oveja se incubaron con el cultivo puro recién cultivado de C. balustinum RTFCP 298 en orden decreciente de concentraciones; 1,5 × 108, 1,5 × 106, 1,5 × 104 y 1,5 × 102 UFC mL-1 a 25 °C durante 1 h. Se utilizaron PBS (100 μL) y Triton X-100 al 0,2% (100 μL) como control negativo y positivo, respectivamente. La incubación de la placa fue seguida por centrifugación a 1000 xg durante 10 minutos y transferencia del sobrenadante a una placa de microtitulación de poliestireno de 96 pocillos de fondo plano. La absorbancia de la placa se midió a 540 nm para estimar la lisis del eritrocito.

El porcentaje de hemólisis se calculó como:

Hemólisis (%) = 100 × [(ASample − APBS)/(ATriton X−100 − APBS)], donde Triton X-100 al 0,2 % y PBS son control positivo y control negativo, respectivamente.

Las concentraciones inhibidoras mínimas (CIM) se midieron en placas de microtitulación de 96 pocillos mediante el método de dilución en caldo45. El medio caldo Muller Hinton (50 µL), que contiene concentraciones decrecientes (256–0,125 µg mL-1) de antibióticos (n = 5); eritromicina, florfenicol, neomicina, ampicilina y oxitetraciclina y 15 AMP, se inoculó con 105 UFC mL-1 de C. balustinum RTFCP 298 en placas de microtitulación de 96 pocillos, conteniendo cada placa un control positivo (solo células bacterianas) y un control negativo ( caldo sin bacterias). Las CIM se determinaron después de 18 a 20 h de incubación a 25 °C mediante la concentración más baja de antibióticos y AMP en la que no se produjo crecimiento visible. Se agregaron 10 μL de resazurina recién preparada (0,015%) diluida en PBS a todos los pocillos de la placa MIC y se incubaron a 25 °C durante 2 h. Se registró el color de todo el pocillo. Un color azul en el pocillo se interpretó como ausencia de crecimiento, mientras que el desarrollo de un color rosa se consideró como crecimiento de la bacteria de prueba. La CIM se definió como la concentración más baja de antibiótico/péptido, que evita un cambio de color de azul a rosa.

Para evaluar la patogenicidad de C. balustinum RTFCP 298, realizamos una infección experimental en alevines de trucha arco iris con un peso promedio de 25,0 ± 0,028 gy una longitud de 12,5 ± 0,50 cm. Los alevines sanos se recolectaron de la granja estatal de truchas arco iris en Bairangna en el distrito de Chamoli, Uttarakhand, para el ensayo de desafío. Antes de la infección experimental en un sistema de flujo continuo, los peces de prueba (n = 30) se aclimataron al ambiente húmedo del laboratorio durante 15 días en tanques de FRP, cada uno con una capacidad de 500 L. Muestras de branquias, hígado y riñón y muestras de hisopos. recolectados de alevines de trucha arco iris seleccionados al azar (n = 6) se procesaron en medios de agar SHIEH y Hsu-Shotts como se describió anteriormente para la detección de C. balustinum antes del comienzo de la infección experimental. El cultivo fresco de las bacterias de prueba se incubó en caldo SHIEH a 25 °C durante 24 h. Las células se sedimentaron y se lavaron dos veces con PBS al 0,85% estéril. Para la infección experimental, mantuvimos una densidad celular constante de 3,0 × 106, 3,0 × 107 y 3,0 × 108 UFC ml-1 (densitómetro DEN-1 McFarland, Grant-bio, Inglaterra). Para probar las hipótesis de Koch, se administraron 100 µL de 3,0 × 106, 107 y 108 UFC de C. balustinum RTFCP 298 a alevines de trucha arco iris sanos por vía intraperitoneal en grupos de tratamiento por triplicado y se monitoreó la progresión de la enfermedad, el comportamiento anormal, la alimentación y la mortalidad. Al grupo de control se le inyectaron 100 µl de solución salina tampón fosfato (PBS) al 0,85%. La temperatura del agua de los tanques experimentales se mantuvo a 18 °C. Después de la fase posterior al desafío, los alevines infectados (n = 6) seleccionados al azar de cada grupo experimental se procesaron nuevamente asépticamente en medio de agar SHIEH suplementado con 0,5 g mL-1 de tobramicina, agar Hsu-Shotts suplementado con 4,0 µg mL-1 de neomicina. sulfato y TSA, como se describió anteriormente. Esto se hizo para volver a aislar y confirmar la presencia de C. balustinum en los órganos de la trucha arco iris desafiada. El ensayo experimental se llevó a cabo durante 90 días.

Los tejidos de branquias, hígado, riñón, ojos, bazo, intestino y músculo de la trucha arco iris infectada experimentalmente se recolectaron por separado y se fijaron con fijador de Davidson durante 12 a 16 h46,47. Las muestras de tejido fijadas se deshidrataron gradualmente y se prepararon bloques en una junta tórica de inclusión (HI Media, India). En resumen, las muestras de tejido se deshidrataron en grados ascendentes de alcohol etílico (50-100%) y luego se empaparon en el agente clarificante xileno dos veces para eliminar completamente el agente deshidratante. Los tejidos se incluyeron en cera de parafina derretida a 60–61 °C durante 4–6 h, seguido de la preparación de los bloques en una junta tórica de inclusión. Se cortaron secciones delgadas (4,0 µm) (Micron HM 325, Thermo Scientific, EE. UU.) y se adhirieron a los portaobjetos de vidrio esmerilado doble utilizando albúmina de huevo y glicerol mezclados en una proporción de 1:1. Después de hornear los portaobjetos a 37 °C durante 1 h, las secciones de tejido se tiñeron con tinción H&E al 2 %48 y se examinaron más a fondo bajo el microscopio (Leica DM 3000) para detectar cambios histopatológicos.

Los datos sobre la formación de biopelículas se presentaron como media ± error estándar (software Prism versión 5.01 GraphPad). Las diferencias significativas (p <0,01) en la formación de biopelículas por C. balustinum RTFCPB 279 en diferentes medios ricos en glucosa y limitantes de glucosa se evaluaron mediante análisis de varianza unidireccional (ANOVA). Para examinar la variación significativa (p < 0,01) en la actividad hemolítica entre la concentración de RTFCPB 279 de C. balustinum a 108 y 106 UFC ml-1, se realizó la prueba 't' pareada. Se utilizó el software SPSS versión 19.0 (SPSS Inc, Chicago IL) para el análisis estadístico en el presente estudio.

Durante la recolección de muestras de trucha arco iris enferma, los valores promedio de los parámetros de calidad del agua en los criaderos de truchas fueron los siguientes: temperatura del agua de 18.5 °C, concentración de oxígeno disuelto de 8.5 mg L-1, pH de 7.5, sólidos disueltos totales de 45 mg L-1 y un nivel de nitrógeno amoniacal total (TAN) de 0,01 mg L-1, lo que indica que los parámetros estaban dentro del rango óptimo.

Los signos clínicos registrados en el estudio fueron pigmentación negra, hemorragia en la superficie dorsal del cuerpo, pudrición de las aletas y lesiones profundas en las regiones del pedúnculo caudal. El examen microscópico de muestras, preparadas a partir de truchas arco iris enfermas, no reveló la presencia de infecciones parasitarias. La detección basada en PCR de herpesvirus acuáticos, poxvirus, iridovirus y adenovirus utilizando cebadores degenerados arrojó resultados negativos. Las colonias circulares amarillas (n = 6) aparecieron en medio de agar HSU-SHOT después de 24 a 48 h de incubación a 25 °C. La prueba de pigmentación (reacción de KOH al 30%) detectó la presencia del agente flexirrubina en los 6 aislados al tornar las colonias bacterianas de limo amarillas a color rojo ladrillo.

Los aislados resultaron positivos a las pruebas de reacción de Gram, catalasa y citocromo oxidasa. Las otras reacciones bioquímicas básicas mostraron que los aislados fueron negativos para DNasa, gelatinasa, rojo de metilo, reacción VP, citrato de Simon e hidrólisis de almidón. Produjeron ácido a partir de manitol, rafinosa, manosa, sacarosa y xilosa. Los detalles de los resultados bioquímicos se dan en la Tabla 1.

La caracterización molecular (gen 16S rRNA) y el análisis filogenético de las secuencias de C. balustinum, RTFCP 298 compartió la similitud máxima de 99,85% con la cepa WLT de C. balustinum (MN317337) seguida de 99,77% con C. balustinum P-27 (KF318411). ), 99,33% con C. balustinum (NR 042925) y 99,15% con C. balustinum NBRC 15053 (NR 113721). Las cepas de C. balustinum RTFCP 301, 302, 303 y 304 exhibieron un 100% de similitud de secuencia con C. balustinum RTFCP 298, lo que sugiere una estrecha relación genética entre estos aislados. Estas cepas se recuperaron junto con C. balustinum RTFCP 298 de las muestras de trucha arco iris enfermas como se describe en la sección "Materiales y métodos". El árbol filogenético implicó el análisis de 24 secuencias de nucleótidos y también estableció la identificación de la cepa actual RTFCP 298 como C. balustinum en el estudio (Fig. 1).

El análisis filogenético se realizó utilizando el método de máxima verosimilitud con el modelo de parámetros kimura-2, empleando 500 replicaciones de arranque que incluían los sitios primero, segundo, tercero y no codificante. Se presenta el árbol resultante con la probabilidad logarítmica más alta (- 6449,11), lo que indica el porcentaje de árboles donde los taxones asociados se agruparon junto a las ramas. Los árboles iniciales para la búsqueda heurística se generaron aplicando el método de unión de vecinos a una matriz de distancias por pares estimada utilizando el enfoque de máxima verosimilitud compuesta (MCL). El árbol está escalado y las longitudes de las ramas se miden en sustituciones por sitio. Este análisis involucró 24 secuencias de nucleótidos y el conjunto de datos final constaba de 1541 posiciones. Todos los análisis evolutivos se realizaron utilizando MEGA X.

Las CIM se determinaron frente a cinco antibióticos diferentes y quince péptidos antimicrobianos novedosos sintéticos. Todos los antimicrobianos probados mostraron un patrón variable de actividad antimicrobiana contra C. balustinum RTFCP 298, donde las CIM variaron de 1 a > 256 Μg mL-1 contra los antibióticos; oxitetraciclina, eritromicina, florfenicol, neomicina y ampicilina (Tabla 2). De manera similar, las CMI de los péptidos antimicrobianos sintéticos variaron de 8 a > 256 Μg ml-1 (Tabla 3).

La prueba de formación de biopelículas reveló que, en presencia de glucosa, C. balustinum RTFCP 298 formó una biopelícula significativa (p <0,01) en comparación con la limitación de glucosa y el control del medio dentro del medio durante el período experimental (24 a 48 h). Cuando se compara entre medios ricos en glucosa; HSB, CB y SHIEH, la formación de biopelículas fue significativa en el medio SHIEH rico en glucosa a las 24 h y 48 h (p <0,01) (Fig. 2A-B).

(A – B) Formación de biopelículas por C. balustinum RTFCP 298 en medio rico en glucosa y limitante de glucosa a las (A) 24 h y (B) 48 h; HSB: caldo HSU-Shot, SHIEH: caldo Shieh y CB: caldo Cytophaga. Se registró una variación significativa en la formación de biopelículas entre las condiciones ricas en glucosa y limitantes de glucosa con el medio (p <0,01). La formación de biopelículas también fue significativa en el medio SHIEH rico en glucosa a las 24 h y 48 h (p <0,01) en comparación con otros medios ricos en glucosa.

C. balustinum RTFCP 298 exhibió actividad hemolítica en eritrocitos de oveja. A 1 × 108 UFC mL-1 del cultivo de prueba, se observó un 100% de hemólisis, mientras que a una dilución seriada al doble (108 UFC mL-1), la actividad hemolítica fue del 16,6%, lo que confirma la virulencia característica de C. balustinum. RTFCP 298 in vitro. Diluciones adicionales en la concentración de C. balustinum RTFCP 298 no produjeron ninguna actividad hemolítica (Fig. 3).

Expresión fenotípica de la actividad hemolítica de C. balustinum RTFCP 298. Hemólisis (%) calculada frente al control +ve Triton X-100 (0,2%) y Neat 108 UFC mL-1.

Se encontró que C. balustinum era moderadamente patógeno para los alevines de trucha arco iris en la infección experimental para confirmar el postulado de Koch. El período posterior al desafío avanzó con el desarrollo de condiciones patológicas iniciales y signos de enfermedad como hemorragia en los ojos, pigmentación negra, manchas rojas y letargo en el segundo día en todos los grupos experimentales. Durante todo el transcurso del experimento (90 días), se registró el desarrollo de erupciones cutáneas y erosión cutánea en la base de las aletas pectorales y la marcada reducción en la capacidad de consumo de alimento entre los peces desafiados. La hemorragia en los ojos de los peces infectados experimentalmente se convirtió gradualmente en estados de exoftalmia unilateral y bilateral. La necropsia de peces experimentales fallecidos o recientemente muertos reveló licuefacción en órganos internos, hemorragia en el hígado y vesícula biliar anormal (Fig. 4).

Signos clínicos y patológicos generales en la trucha arco iris, O. mykiss desafiado experimentalmente con C. balustinum. (a) Necrosis dérmica o escama lateral difusa. (b) Región subperitoneal: esplenomegalia y petequias difusas. (c) Hemorragia ocular en la cámara anterior. (d) En la región craneal son visibles exoftalmia, hemorragias en el ojo y decoloración dorsal. (e) Hemorragia ocular en la cámara anterior (f) hemorragia y licuefacción en órganos internos y (g) secreción de ascitis por el ano.

Se registraron primeros episodios de mortalidad del 12 % y 15 % en el grupo de peces expuestos a 3,0 × 107 y 3,0 × 108 UFC ml-1 de C. balustinum RTFCP 298, respectivamente, después del cuarto día de la infección experimental. El grupo experimental expuesto a 3 × 106 UFC ml-1 de la bacteria de prueba no causó ninguna mortalidad, pero mostró pocos signos de progresión de la enfermedad. El día 15 del período posterior al desafío, se registró una mortalidad del 4% en el grupo de peces infectados con 3 × 106 UFC mL-1 de C. balustinum RTFCP 298. El valor LD50 de C. balustinum RTFCP 298 se registró en 108 UFC mL. -1, lo que llevó a una mortalidad del 50% de los peces de prueba el día 29. Los peces del grupo de control del experimento no mostraron signos de progresión de la enfermedad y no se observó mortalidad entre los peces de este grupo. Se volvió a aislar C. balustinum RTFCP 298 de la trucha arco iris infectada en medio de agar SHIEH suplementado con 0,5 g mL-1 de tobramicina y medio Hsu-Shotts suplementado con 4,0 g mL-1 de sulfato de neomicina, y se confirmó la homología fenotípica y parcial del gen 16S rRNA. la caracterización. También se identificaron algunos aislados del grupo Aeromonas en la placa TSA del estudio.

Las alteraciones histopatológicas en el tejido branquial incluyeron fusión de laminillas branquiales primarias y secundarias, hipertrofia, hiperplasia, vacuolación, elevación epitelial, telangiectasia en laminillas secundarias, congestión sanguínea y vasodilatación. El hígado mostró vacuolación, aumento del espacio sinusoidal, núcleo de hepatocitos y sinusoides sanguíneos, mientras que en el riñón se registró hemorragia y dilatación del espacio de Bowman. Bazo presentó acumulación de hemosiderina, pulpa blanca y roja. El ojo tenía un mayor espacio entre el epitelio pigmentado y la capa de fotorreceptores y distrofia de conos y bastones. En el intestino se observaron necrosis, rotura del borde en cepillo y degeneración de la lámina propia, mientras que el músculo mostró necrosis y pérdida de miocitos (Fig. 5).

Fotomicrografía de secciones histológicas (4 μm) de trucha arco iris desafiada con C. balustinum RTFCP 298. (A) Ojo: aumento del espacio (IS) entre el epitelio pigmentado y la capa de fotorreceptores y distrofia de conos y bastones (CRD); (B) Branquias: Levantamiento epitelial (EL), Telangiectasia (T), Congestión sanguínea (BC), Hiperplasia (HP) y Vasodilatación (V); (C) Intestino: Necrosis (N), alteración del borde en cepillo (DB), Degeneración de la lámina propia (DLP); (D) Riñón: Hemorragia (H), Dilatación del espacio de Bowman (DB); (E) Hígado: vacuolación (V), aumento del espacio sinusoidal (IS), hepatocitos (HE), núcleo de hepatocitos (HN), sinusoides sanguíneos (BS); (F) Músculo: Necrosis (N), Pérdidas de miocitos (ML), (G) Bazo: Acumulación de hemosiderina (AH), Pulpa blanca (WP), Pulpa roja (RP).

En el presente estudio, se recuperaron y caracterizaron aislamientos de C. balustinum RTFCP 298 a partir de la infección natural de la trucha arco iris en las regiones del Himalaya indio (IHR). Los signos de la enfermedad fueron similares a los casos de infección por Flavobacterium spp. en pescado49. Desde el primer aislamiento en el fletán, se la ha reconocido como una bacteria patógena y no como una bacteria que altera los alimentos, porque se aisló de la aleta4,26,50.

C. balustinum RTFCP 298 se identificó con base en la morfología, las características fisiológicas y bioquímicas de la colonia20. Se confirmó además mediante la amplificación por PCR del gen 16S rRNA y el análisis filogenético. El gen 16S rRNA es el marcador genético más utilizado para identificar bacterias hasta el nivel de especie. La alineación de la secuencia del gen 16S rRNA de C. balustinum, RTFCP 298 y el análisis filogenético revelaron que compartía la máxima similitud de secuencia con la cepa WLT de C. balustinum (MN317337)20. Se propone que la identificación del gen 16S rRNA puede ser útil para diagnosticar la infección por C. balustinum en peces. Chryseobacterium WLT (MN 317337) de la trucha arco iris en la República de Corea reveló un 99,24 % de similitud con otros grupos de Chryseobacterium20. De manera similar, el gen 16S rRNA de C. scophthalmum aislado del mahseer dorado TPBLGL 18 (KM822770) tiene un 99 % de similitud con el gen 16S rRNA de C. scophthalmum cepa LMG 13028T (NR 025386)24.

La prueba de microdilución con resazurina reveló la concentración inhibidora mínima más baja contra la cepa C. balustinum para oxitetraciclina, florfenicol y eritromicina. Debido a su amplia eficacia y su reducido daño a los peces, los piscicultores de la India emplean con frecuencia oxitetraciclina, tetraciclina y ampicilina para combatir enfermedades bacterianas51. En consecuencia, la utilización de cualquiera de estos tres antibióticos podría servir como una posible medida de control durante la infección por C. balustinum en truchas. Estudios anteriores han documentado la resistencia natural de Chryseobacterium spp. a un subconjunto de antibióticos, que incluyen tetraciclinas, eritromicina, linezolid, polimixinas y cloranfenicol52. Además, en nuestra investigación, evaluamos la eficacia antimicrobiana de 15 nuevos péptidos antimicrobianos sintéticos (AMP) contra C. balustinum. Sorprendentemente, 5 de los 15 AMP exhibieron una actividad antimicrobiana notable (8–32 Μg ml-1) contra la bacteria objetivo. La susceptibilidad de los péptidos a la interferencia bacteriana puede atribuirse a su corta longitud, lo que aumenta la probabilidad de poseer secuencias únicas. Como sólo un número limitado de medicamentos y productos químicos están aprobados para su uso en el tratamiento de enfermedades en la acuicultura, una epizootia podría causar pérdidas significativas en las operaciones de piscicultura durante el brote53.

El mecanismo de virulencia molecular de organismos no modelo como C. balustinum se puede comprender mejor utilizando la información adquirida de los mecanismos de virulencia de las especies modelo. En el estudio actual, pocos de los determinantes patógenos de C. balustinum se han investigado in vitro mediante investigaciones comparativas sobre tipos de colonias virulentas, como la prueba hemolítica y la formación de biopelículas. Se ha observado que la actividad hemolítica de C. balustinum, al igual que la de F. columnare, tiene mayor expresión y detección frente al potente agente hemolítico Triton X-100 (0,2%)36. La hemolisina de otros organismos se identificó por su capacidad para lisar los glóbulos rojos o afectar el funcionamiento biológico de otras células54. Las proteasas pueden desempeñar un papel importante en la formación de biopelículas, lo que determina la patogenicidad en las bacterias55,56. La prueba de formación de biopelículas reveló que C. balustinum era capaz de formar biopelículas con o sin glucosa en el medio. Se cree que las bacterias generadoras de biopelículas son el factor principal de muchas infecciones oportunistas en los peces y son extremadamente difíciles de eliminar debido a su resistencia muy mejorada (1000 veces) a varios antimicrobianos. Como resultado, se deben utilizar mayores concentraciones de fármacos antimicrobianos para matar o restringir la formación de consorcios microbianos patógenos establecidos en las biopelículas57.

Varios estudios realizados en la India informaron infecciones por F. branquiophilum y F. columnare en carpas mayores (CMI), peces ornamentales y truchas arco iris de la India cultivadas36,58,59,60. También se han registrado síntomas clínicos visibles como lesiones branquiales y hemorragia cutánea y ascitis dentro del peritoneo, entre otros síntomas, en mahseer dorado infectado con especies de Flavobacterium4,39,59,61,62. En nuestro estudio, se encontró que C. balustinum RTFCP 298 era moderadamente patógeno para los juveniles de trucha arco iris en el ensayo de infección experimental para confirmar la prueba del postulado de Koch al revelar síntomas como necrosis dérmica, licuefacción, región subperitoneal: esplenomegalia y petequias difusas, ojo. hemorragia en la cámara anterior, hemorragia de órganos internos y secreción de ascitis por el ano. Aunque la prueba de provocación se realizó durante 90 días, la patogenicidad de Chryseobacterium RTFCP 298 en dosis experimentales de 106, 107 y 108 UFC mL-1 causó una mortalidad moderada en la trucha arco iris. En general, la patogenicidad de Chryseobacterium en peces de piscifactoría es menor que la de los principales patógenos bacterianos (p. ej., Flavobacterium spp y Lactococcus garvieae). Aunque la patogenicidad de Chryseobacterium no es mucho mayor que la de otros patógenos comunes en la acuicultura, un ensayo de infección experimental de 15 días en truchas arco iris con un peso promedio de 20 g por la cepa WLT de Chryseobacterium a 3 × 107 UFC de bacteria demostró una mortalidad del 60% y la La LD50 de la misma cepa registró entre 106 y 107 UFC de la bacteria (Jung et al.20). Este aislado indio, Chryseobacterium RTFCP 298, ha mostrado su LD50 en 108 UFC ml-1. En el presente estudio, la reproducción de los signos clínicos de progresión de la enfermedad y el aislamiento de C. balustinum en los órganos de la trucha arco iris desafiada establecieron la prueba de las hipótesis de Koch. Sin embargo, la detección de algunos aislados de Aeromonas en placas TSA puede correlacionarse con la posible inducción de estrés en una prueba de provocación tan larga.

El presente estudio investigó los cambios histopatológicos asociados con infecciones experimentales de C. balustinum en trucha arco iris. El tejido branquial exhibió diversas alteraciones que incluyen deformidades necróticas, fusión de laminillas branquiales primarias y secundarias, hipertrofia, hiperplasia y vacuolación. La enfermedad bacteriana de las branquias en los peces se caracteriza por fusión laminar e hiperplasia de células epiteliales laminares, como se informó anteriormente63. Se han observado cambios histológicos similares en el tejido branquial en salmónidos4, mahseer dorado24 y rodaballos jóvenes64 infectados con C. scophthalmum y otras Chryseobacterium sp. Además, otros órganos como el hígado, los ojos, los riñones y el bazo exhibieron cambios patológicos como vacuolización, aumento del espacio sinusoidal, alteración de los hepatocitos y del núcleo de los hepatocitos, cambios sinusoides sanguíneos, aumento del espacio entre el epitelio pigmentado y la capa de fotorreceptores, distrofia de conos y bastones. , hemorragia, dilatación del espacio de Bowman, acumulación de hemosiderina, pulpa blanca y pulpa roja. Por lo tanto, los signos clínicos y las alteraciones histopatológicas sugirieron que la presencia de la enfermedad en la trucha arco iris se debía a la infección por C. balustinum.

El presente estudio informa la susceptibilidad del aislado de prueba, C. balustinum, a una variedad de antibióticos aprobados por la FDA que se usan comúnmente en la acuicultura. En particular, este es el primer informe sobre el aislamiento de C. balustinum en el contexto indio. Los hallazgos actuales subrayan el potencial de un tratamiento antibiótico apropiado para controlar eficazmente la infección por C. balustinum en truchas de piscifactoría. Es importante destacar que esta investigación contribuye a la identificación y control de la enfermedad en el cultivo de trucha arco iris y destaca la necesidad de implementar un régimen regular de seguimiento e inspección. Por lo tanto, el análisis de muestras infectadas de granjas de truchas podría ayudar a prevenir la propagación de C. balustinum y otras enfermedades en las unidades de producción acuícola.

La secuencia de nucleótidos (ARNr 16S) de Chryseobacterium balustinum RTFCP 298 se envía al Genebank NCBI y está disponible para el público con el número de acceso OP604185. Todos los datos generados en el estudio, están presentes en este artículo.

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Los autores agradecen al Consejo Indio de Investigación Agrícola, Nueva Delhi, India, por proporcionar instalaciones de laboratorio para llevar a cabo este trabajo de investigación.

Esta investigación cuenta con el apoyo de financiación externa del Consejo Indio de Investigación Agrícola en el marco del Proyecto de la Red de toda la India sobre la salud de los peces (AINP-FH).

ICAR-Dirección de Investigación de Pesquerías en Aguas Frías (ICAR-DCFR), Bhimtal, Nainital, Uttarakhand, 263136, India

Sumanta Kumar Mallik, Richa Pathak, Neetu Shahi, Krishna Kala, Suresh Chandra, Partha Das, Bhupendra Singh, Mohan Singh, Ritesh Shantilal Tandel, Debajit Sarma y Pramod Kumar Pandey

ICAR-Instituto Indio de Investigación Agrícola, Gauriakarma, Hazaribagh, Jharkhand, 825405, India

Abhay Kumar Giri

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SKM: conceptualizó, realizó la investigación y redactó el manuscrito final. RP: realizó la investigación y escribió el manuscrito original. NS: analizó y validó los datos. KK, SC, PD, BS, MS: recolectaron muestras y realizaron investigaciones. AKG, RST: analizó los datos. PKP: supervisó y editó el manuscrito. Todos los coautores han leído y aceptado la versión editada del manuscrito.

Correspondencia a Sumanta Kumar Mallik o Pramod Kumar Pandey.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Mallik, SK, Pathak, R., Shahi, N. et al. Análisis patológico y susceptibilidad antimicrobiana de Chryseobacterium balustinum RTFCP 298 aislado de trucha arco iris enferma, Oncorhynchus mykiss. Representante científico 13, 13268 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-40028-5

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Recibido: 06 de abril de 2023

Aceptado: 03 de agosto de 2023

Publicado: 15 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-40028-5

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