Cribado no - Productos calientes Co., Ltd de Zhejiang

Nature Communications volumen 14, número de artículo: 5294 (2023) Citar este artículo

Detalles de métricas

Saccharomyces cerevisiae es un caballo de batalla de la biotecnología industrial debido a la prominencia del organismo en la fermentación del alcohol y al conjunto de sofisticadas herramientas genéticas disponibles para manipular su metabolismo. Sin embargo, S. cerevisiae no es adecuada para producir en exceso muchos bioproductos a granel, ya que la toxicidad limita la producción a títulos elevados. Aquí, empleamos un ensayo de alto rendimiento para detectar 108 cepas de levadura accesibles al público en busca de tolerancia a 20 g L-1 de ácido adípico (AA), un precursor del nailon. Identificamos 15 levaduras tolerantes y seleccionamos Pichia occidentalis para la producción de ácido cis,cis-mucónico (CCM), el precursor del AA. Al desarrollar un conjunto de herramientas de edición del genoma para P. occidentalis, demostramos la producción por lotes alimentados de CCM con un título máximo (38,8 g L-1), rendimiento (0,134 g g-1 glucosa) y productividad (0,511 g L-1 h-1). ) que supera todas las métricas logradas con S. cerevisiae. Este trabajo nos acerca a la bioproducción industrial de AA y subraya la importancia de la selección del huésped en el bioprocesamiento.

Históricamente, la levadura de cerveza (Saccharomyces cerevisiae) ha sido el huésped microbiano preferido para la sobreproducción de combustibles, productos químicos y farmacéuticos. Sin embargo, debido al bajo valor de muchos productos químicos y biocombustibles a granel, las concentraciones necesarias para la producción a escala comercial suelen ser tóxicas para S. cerevisiae y otros organismos modelo. Por ejemplo, S. cerevisiae no puede mantener el crecimiento en concentraciones bajas a moderadas de butanol (2%)1, vainillina (0,05%)2, benzaldehído (0,1-0,2%)3 y muchos ácidos orgánicos (0,25-2,5%). 4,5,6. Los ácidos orgánicos plantean un desafío distintivo en el bioprocesamiento, ya que un bioproceso de ácido orgánico ideal se realizaría a un pH ácido, lo que simplifica la recuperación posterior de la forma no disociada y evita el requisito de mantener el pH durante la fermentación. Sin embargo, la toxicidad ácida es inversamente proporcional al pH, ya que los ácidos no disociados (pH pKa8,9,10.

El ácido adípico es un ácido dicarboxílico C6 utilizado en la producción de nailon 6,6. Con una producción anual de tres millones de toneladas y un mercado global de seis mil millones de dólares11, el Departamento de Energía de Estados Unidos ha clasificado el ácido adípico como un "súper producto básico"12. La demanda mundial de ácido adípico se satisface actualmente mediante un proceso químico que involucra ciclohexano y ácido nítrico, pero este método utiliza recursos petroquímicos y libera óxido nitroso, un potente gas de efecto invernadero, lo que lleva a la investigación de rutas más sostenibles para su producción. No existen rutas naturales para la biosíntesis del ácido adípico, pero se han propuesto al menos ocho rutas bioquímicas diseñadas para su bioproducción11. De estas vías, se han logrado avances importantes utilizando la ruta del ácido cis, cis-mucónico (CCM). Esta estrategia emplea tres enzimas heterólogas, 3-deshidroshikimato deshidratasa, ácido protocatéquico descarboxilasa y catecol dioxigenasa, para la síntesis de CCM a partir de 3-deshidroshikimato, un intermediario de la vía del shikimato. La CCM se convierte en ácido adípico mediante hidrogenación mediante enzimas enoato reductasa; sin embargo, las variantes bacterianas caracterizadas hasta la fecha funcionan mal en levaduras huéspedes13, logrando una conversión molar <0,9% de CCM en ácido adípico14. En ausencia de una enoato reductasa activa en levadura adecuada, S. cerevisiae ha sido diseñada para sintetizar CCM con un título, rendimiento y productividad de hasta 22,5 g L-1, 0,1 g g-1 de glucosa y 0,21 g L-1. h−1, respectivamente9,10. A pesar de estos avances, los procesos de CCM de levadura se realizan a un pH de 5 a 6, que está muy por encima del pKa de CCM (3,87) y mantiene el ácido en su forma disociada para limitar la toxicidad del producto.

En respuesta a la escasa tolerancia de S. cerevisiae a muchos bioproductos a granel, la atención se ha desplazado a la detección de especies de levadura no convencionales en busca de fenotipos más adecuados para aplicaciones industriales15. La selección de cepas es un aspecto crítico y a menudo pasado por alto en el desarrollo de bioprocesos, ya que seleccionar un huésped microbiano que se adapte al producto final objetivo probablemente reduzca las intervenciones de ingeniería de cepas, simplifique la separación posterior, limite la toxicidad del producto y mejore las métricas generales del proceso16. Por ejemplo, Yarrowia lipolytica es un huésped oleaginoso y osmotolerante que es muy adecuado para la producción de ácidos grasos y alcanos17, Kluyveromyces marxianus es una levadura termotolerante de rápido crecimiento18 y Pichia kudriavzevii es un huésped robusto tolerante a los ácidos utilizado para la producción de diversos Ácidos orgánicos19. Se han clasificado aproximadamente 1500 especies de levadura en más de 100 géneros y los depósitos de cultivos públicos contienen miles de cepas de levadura distintas. La mayoría de estas especies de levadura se pueden cultivar en el laboratorio con medios estándar20 y los importantes avances en la secuenciación del genoma, la biología de sistemas y la ingeniería de cepas han reducido drásticamente el costo y la mano de obra involucrados en la domesticación genética de huéspedes no convencionales. Se han desarrollado sofisticados conjuntos de herramientas genéticas para diversas especies de levaduras, incluidas Y. lipolytica21, K. marxianus18 y P. pastoris22, lo que brinda nuevas oportunidades para la selección de huéspedes más allá de Saccharomyces.

En este estudio, analizamos 108 cepas distintas de levadura de colecciones de cultivos públicos para determinar su tolerancia natural a altas concentraciones de ácido adípico y otros ácidos dicarboxílicos. Nuestra pantalla identifica varias especies de Pichia como posibles huéspedes industriales para producir diversos ácidos orgánicos. Con base en la susceptibilidad a los antibióticos, la transformación de plásmidos y los ensayos de edición CRISPR-Cas9, seleccionamos P. occidentalis para un alto nivel de producción de CCM, el precursor directo del ácido adípico. En condiciones de lote alimentado, P. occidentalis diseñada sintetiza 38,8 g L-1 CCM con un rendimiento y una productividad máximos que superan todas las métricas actuales logradas con S. cerevisiae.

Para construir una biblioteca de levaduras no convencionales para detectar posibles huéspedes tolerantes al ácido, examinamos repositorios de cultivos públicos en busca de cepas que no sean Saccharomyces, seleccionando cepas con tolerancia al ácido reportada cuando estuvieran disponibles. En total, se obtuvieron 153 cepas de 83 especies distintas, de las cuales 124 se cultivaron con éxito en medio YM a 30 °C y 108 se seleccionaron con éxito en nuestro ensayo, y el resto no pudo crecer de manera confiable en YPD. Las 108 cepas finales abarcaron 66 especies de 28 géneros (Datos complementarios 1).

La selección posterior implicó cultivar cepas en YPD que contenía 20 g L-1 de ácido cítrico (0,1 M; YPDcit; Fig. 1a) o YPD que contenía 20 g L-1 de ácido adípico (0,137 M; YPDAA; Fig. 1b). La adición de ácido adípico redujo el pH de YPD a ~3,7 (pKa1 = 4,41, pKa2 = 5,41) y la adición de ácido cítrico redujo el pH de YPD a ~3,0 (pKa1 = 3,13, pKa2 = 4,76, pKa3 = 6,39). El medio YPDAA produjo una amplia diversidad de fenotipos de crecimiento. A pesar de un pH más alto, la correlación entre el crecimiento en YPD y YPDAA (R2 = 0,685) fue menor que la del crecimiento en YPD e YPDcit (R2 = 0,905), lo que indica que el ácido adípico afectó el crecimiento de más cepas.

a Crecimiento de cepas de levadura en YPD en comparación con YPD suplementado con ácido cítrico 0,1 M (YPDcit). b Crecimiento de cepas de levadura en YPD en comparación con YPD suplementado con ácido adípico 0,15 M (YPDAA). El crecimiento se evaluó midiendo el área bajo la curva (AUC) de las curvas de crecimiento. Cada punto de datos representa una única réplica de n = 3 réplicas biológicas independientes para cada cepa de levadura. Las líneas discontinuas muestran las AUC promedio para S. cerevisiae CEN.PK113-7D en cada condición de crecimiento. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Empleamos dos criterios para seleccionar cepas para rondas de detección posteriores. Primero, definimos la tolerancia al ácido adípico como una tasa de crecimiento en YPDAA (estimada como área bajo la curva en OD600) que no es más de un 20% más lenta en comparación con el crecimiento en YPD. En segundo lugar, para garantizar un crecimiento robusto de las cepas en condiciones estándar de laboratorio, seleccionamos cepas con tasas de crecimiento en YPD (medidas como área bajo las curvas de crecimiento de la cepa en OD600) que no eran más de un 20% más lentas en comparación con la cepa de control (S. cerevisiae CEN .PK 113-7D). A pesar del uso de medio rico YPD, algunas cepas no pudieron crecer hasta una DO600 >1,0 en el tiempo asignado en ausencia de inhibidores de ácido.

La aplicación de nuestros criterios de selección dio como resultado la identificación de 15 cepas de rápido crecimiento y tolerantes al ácido adípico del conjunto original de 108 candidatos (Tabla 1). En particular, las cepas del género Pichia se enriquecieron entre los candidatos tolerantes al ácido adípico; de las quince cepas, siete eran Pichia (47%), mientras que Pichia representaba sólo el 10% de la colección de cepas original.

La sobrerrepresentación de las cepas de Pichia provocó más investigaciones en el clado de Pichia en busca de huéspedes tolerantes al ácido. Se agregaron ocho cepas adicionales de Pichia, tres de las cuales pertenecían a especies no representadas en la selección inicial (Candida sorboxylosa, Pichia norvegensis y Pichia exigua). A pesar de su nombre, C. sorboxylosa ha sido colocada en el género Pichia mediante análisis filogenético del genoma completo23. También agregamos dos nuevas cepas de P. occidentalis (Y-6545 e YB-3389) según la tolerancia al ácido adípico de P. occidentalis Y-7552 en nuestra evaluación inicial.

La evaluación posterior de la tolerancia al ácido se realizó en medio definido de base nitrogenada de levadura (YNB) para identificar cepas con crecimiento robusto tanto en medios definidos como ricos. Curiosamente, ciertas cepas de P. occidentalis mostraron un defecto de crecimiento en YNB. Específicamente, P. occidentalis Y-6545 e YB-3389 no pudieron alcanzar una DO600 de 1,0 en el tiempo asignado (24 h) en 1 × YNB en comparación con una DO600 de ~1,75 en YPD (Figura 1 complementaria). Un aumento en la concentración de YNB de 1× (1,7 g L-1) a 3× (5,1 g L-1) alivió esta limitación. Dado que YNB está compuesto por una mezcla de 20 vitaminas y sales, se desconoce la naturaleza de esta aparente limitación de nutrientes. Para garantizar un crecimiento robusto de todas las cepas de levadura, se realizaron experimentos de detección posteriores en 3X YNB.

Para caracterizar mejor los fenotipos tolerantes a los ácidos, realizamos una ronda posterior de selección en un medio definido para evaluar la capacidad de 10 cepas candidatas de Pichia para crecer en tres ácidos dicarboxílicos diferentes de diferentes longitudes de cadena, a saber, succínico (C4), glutárico (C5) y ácido adípico (C6) (Fig. 2a). Se agregaron ácidos a cada medio definido a una concentración de 0,15 M y un pH de 2,8. Para los ácidos dicarboxílicos probados, la cepa de control S. cerevisiae CEN.PK 113-7D mostró una disminución constante en la tasa de crecimiento al aumentar la longitud de la cadena ácida, suponiendo un nivel comparable de disociación entre los ácidos dicarboxílicos. El ácido adípico, el ácido dicarboxílico analizado durante más tiempo, inhibió completamente el crecimiento de S. cerevisiae a una concentración de 0,15 M (21,9 g L-1) (Fig. 2b). Esta tendencia general también se observó con la mayoría de las cepas de Pichia, excepto las tres cepas de P. occidentalis, donde la tasa de crecimiento generalmente aumentó con la longitud de la cadena (P <0,001) (Fig. 2a). En general, una o varias cepas de P. kluyveri, P. kudriavzevii, P. manshurica y P. occidentalis mostraron una notable tolerancia a múltiples ácidos dicarboxílicos.

a Tasas de crecimiento máximas de las cepas candidatas en 3 × YNB suplementadas con ácidos succínico, glutárico o adípico (0,15 M cada uno). A todos los medios que contenían ácido dicarboxílico se les ajustó el pH a 2,8 después de la adición de 0,15 M del ácido dicarboxílico respectivo. El medio ácido es medio YNB 3X con el pH ajustado a 2,8 y el medio neutro es medio YNB 3X sin ajuste de pH. Las barras de error representan la media ± sd de n = 3 muestras biológicas independientes. b Curvas de crecimiento representativas de S. cerevisiae CEN.PK y P. occidentalis cepa Y-7552 en 3 × YNB suplementado con ácido adípico 0,15 M (22 g L-1). El crecimiento se evaluó midiendo la DO600 en unidades arbitrarias (unidades arb.). Se superponen tres réplicas biológicas independientes para cada condición de crecimiento. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

También analizamos 93 cepas de levadura en medio YPD e YPD que contenía tampón citrato 0,1 M, pH 3,0 (YPDcit). Sin embargo, esta condición no fue lo suficientemente inhibidora, ya que la mayoría de las cepas crecieron a niveles comparables en YPD e YPDcit (Fig. 1a). Se ha informado que el ácido cítrico es más tóxico para la levadura a un pH de 4,5 que a un pH de 3,0 debido a la propensión de la forma disociada a unirse a cationes divalentes, lo que proporciona una posible explicación para nuestras observaciones.

Además de los ácidos dicarboxílicos, analizamos 26 cepas de Pichia en varios ácidos monocarboxílicos utilizando las mismas condiciones (definimos medio YNB 3 × que contiene 0,15 M de ácido, pH 2,8). Sólo una cepa creció en ácido acético (P. manshurica Y-27978) y ninguna de las cepas analizadas creció en ácidos propiónico, butírico o valérico. Suponiendo niveles comparables de disociación entre ácidos monocarboxílicos, estos hallazgos indican un mayor grado de toxicidad causada por los ácidos propiónico, butírico y valérico en concentraciones equimolares.

Con base en nuestra evaluación de tolerancia al ácido adípico, seleccionamos ocho cepas candidatas de Pichia como posibles huéspedes de producción de CCM. Primero evaluamos la utilización de la fuente de carbono de las ocho cepas seleccionadas probando la capacidad de utilizar xilosa, un azúcar C5 abundante en la lignocelulosa vegetal. La detección de la utilización de xilosa colocando colonias en placas de agar que contienen xilosa como única fuente de carbono reveló que P. fermentans 562 NCYC era la única cepa de Pichia tolerante al ácido adípico capaz de utilizar xilosa (Fig. 3a), lo que es consistente con los datos de caracterización fenotípica de la levadura (Suplementario). Tabla 1). Además de la utilización de fuentes de carbono, la idoneidad de las cepas para la ingeniería genética y metabólica requiere la capacidad de utilizar marcadores seleccionables comunes e introducir material genético extraño. En consecuencia, se analizó la susceptibilidad de las ocho cepas de Pichia seleccionadas a altas concentraciones de G418 (1000 μg mL-1), higromicina (600 μg mL-1), nourseotricina (100 μg mL-1) y zeocina (300 μg mL-1). ) (Figura 3a). Excepto P. membranifaciens NCYC 55 y P. manshurica Y-27978, todas las cepas fueron resistentes a 300 μg mL-1 de zeocina. Por el contrario, casi todas las cepas fueron susceptibles a la nourseotricina y la higromicina en las concentraciones analizadas. G418 fue eficaz contra aproximadamente la mitad de las cepas analizadas. De las tres cepas de P. occidentalis, sólo la cepa Y-7552 fue susceptible a G418, mientras que la nourseotricina y la higromicina fueron efectivas contra las tres cepas.

a Utilización de xilosa, susceptibilidad a los antibióticos y eficiencia de transformación de Pichia spp. tolerantes al ácido adípico. Las cepas se clasifican según la tolerancia al ácido adípico (AUC en YPD que contiene 20 g L-1 de ácido adípico) y se muestra la utilización de xilosa y la susceptibilidad a cuatro antibióticos de levadura comunes. La eficiencia de transformación utilizando un plásmido que confiere HygR se proporciona redondeada al orden de magnitud más cercano. No se detectaron transformantes de P. kudriavzevii 2658 NCYC y P. membranifaciens NCYC55 (ND). La repetición de los ensayos de susceptibilidad a los antibióticos y de transformación de plásmidos de forma rutinaria arrojó resultados similares. b Estrategia de eliminación de ADE2 utilizada en Pichia tolerante al ácido adípico. Se diseñaron grandes regiones de homología (~800 pb) que flanquean la secuencia codificante de ADE2. c Estructura de los vectores ADE2 pCas CRISPR-Cas9 que contienen casetes de donante de ade2Δ preclonados. Los casetes donantes se preclonaron en el sitio BglII de los vectores pCas. d Estrategia de reparación de brechas del ensamblaje del vector pCas en Pichia tolerante al ácido adípico. Los vectores pCas que albergan casetes donantes de ade2Δ preclonados se linealizaron mediante digestión con BsaI o NotI y se usaron para transformar especies de Pichia junto con un producto de PCR de ARNg de ADE2 superpuesto. e La eliminación de ADE2 produce colonias rosadas en Pichia tolerante al ácido adípico. Los transformantes se sembraron en placas de agar YPD que contenían higromicina sin suplemento de adenina. Se muestra una placa de agar YPD representativa que contiene P. occidentalis Y-7552. f Detección de la deleción de ADE2 en Pichia tolerante al ácido adípico. Se transfirió un vector pCas-Hyg-CEN6ARS4 que posee un ARNg de ADE2 y un donante de reparación a P. kluyveri y tres cepas de P. occidentalis. Se examinó la eliminación del locus ADE2 en transformantes HygR seleccionados al azar antes del desarrollo del color. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Habiendo identificado concentraciones efectivas de antibióticos, seleccionamos las ocho cepas candidatas de Pichia para su transformación utilizando vectores que expresan un marcador de resistencia a higromicina del promotor TEF1 de Ashbya gossypii (PTEF1). Confirmamos la transformación exitosa de seis de las ocho cepas de Pichia (Fig. 3a). La mayor eficiencia de transformación se logró utilizando P. fermentans, la menos tolerante al ácido adípico de las ocho cepas candidatas de Pichia. Se obtuvieron transformantes para las tres cepas de P. occidentalis, las cepas más tolerantes al ácido adípico identificadas en este estudio. La eficiencia de transformación de P. occidentalis Y-7552 (102 UFC µg-1 de ADN) fue mayor que la de las cepas Y-6545 y YB-3389 (101 UFC µg-1 de ADN).

Con base en los ensayos de susceptibilidad a los antibióticos y de transformación de plásmidos, seleccionamos P. kluyveri y las tres cepas de P. occidentalis para los ensayos de edición del genoma, lo que fue ayudado por los borradores de secuencias del genoma reportados recientemente para estas cepas24. Seleccionamos el gen ADE2 para su eliminación ya que su inactivación conduce a la acumulación de un intermedio coloreado para la identificación visual de mutantes de eliminación (Fig. 3b). Anticipamos un bajo nivel de recombinación homóloga en las cepas de Pichia25,26, lo que nos llevó a buscar un sistema CRISPR en el que se preclonaron plantillas de reparación dirigidas por homología en vectores de administración de pCas (Fig. 3c), evitando así la necesidad de ensamblar múltiples fragmentos de ADN superpuestos. en Pichiá.

Primero evaluamos la capacidad de un vector CRISPR-Cas9 interno (pCas-Hyg-CEN6ARS4) que posee el origen CEN6/ARS4 de S. cerevisiae, así como casetes de expresión de gRNA y cas9 (Fig. 3c), para funcionar en Pichia. Diseñamos plantillas de reparación de homología ade2Δ para las cuatro cepas candidatas de Pichia fusionando brazos de homología de ~ 800 pb que flanquean la secuencia codificante de ADE2 y pequeñas porciones (~ 100–150 pb) de los elementos promotor y terminador (Fig. 3b). Con este diseño, la reparación dirigida por homología de una rotura de doble hebra de ADE2 da como resultado una gran eliminación (~2 kb) de toda la secuencia codificante de ADE2. Después del ensamblaje de los vectores ade2Δ pCas en S. cerevisiae, los vectores se linealizaron con BglII y se usaron para transformar la cepa de Pichia relevante junto con un ARNg de ADE2 superpuesto para el ensamblaje mediante reparación de espacios en Pichia (Fig. 3d). Usando este enfoque, obtuvimos colonias HygR para las cuatro cepas de Pichia (Fig. 3e), lo que significa un ensamblaje exitoso del vector mediante la reparación de espacios. Después de la detección del locus ADE2, identificamos colonias ade2Δ en las tres cepas de P. occidentalis, pero no pudimos identificar mutantes ade2Δ de colonias HygR de P. kluyveri (Fig. 3f). Las eficiencias de edición variaron del 50% al 69% según la selección de 10 a 13 transformantes HygR seleccionados al azar.

En conjunto, se seleccionó P. occidentalis Y-7552 como huésped final para la producción de CCM. La cepa Y-7552 es sensible a al menos tres antibióticos (G418, higromicina y nourseotricina), produce la mayor eficiencia de transformación de las tres cepas de P. occidentalis (Fig. 3a) y no exhibe el defecto de crecimiento observado en 1 × YNB. para las cepas Y-6545 y YB-3389 (Figura 1 complementaria). La cepa Y-7552 es diploide y la cepa tipo de P. occidentalis27. La cepa es capaz de utilizar glucosa, glicerol y etanol como únicas fuentes de carbono, pero no crece en sacarosa, galactosa, lactosa, xilosa, almidón o celobiosa20 (Tabla complementaria 1). Además de P. kudriavzevii, P. occidentalis crece en un medio desprovisto de vitaminas de levadura comunes, lo que aumenta el potencial de la cepa para la producción industrial de ácidos orgánicos de alto valor.

Habiendo eliminado con éxito el gen ADE2 en la cepa Y-7552 de P. occidentalis utilizando CRISPR-Cas9, deseábamos curar las células del vector de ARNg pCas-Hyg-ADE2, que es un paso necesario para realizar rondas iterativas de edición del genoma CRISPR-Cas9. Debido a que el módulo de replicación CEN6/ARS4 se deriva de Saccharomyces cerevisiae, anticipamos la integración cromosómica del vector pCas-Hyg-CEN6ARS4 en Pichia. En consecuencia, el vector no pudo curarse subcultivando hasta seis veces en medio YPD no selectivo, y otros métodos de curación de plásmidos no tuvieron éxito, incluido el cultivo a una temperatura elevada (37 °C), el choque térmico de las células a 42 °C en una transformación simulada de acetato de litio-PEG, o intentando desplazar el vector HygR-CEN6-ARS4 original introduciendo un vector G418R-CEN6-ARS4 o NatR-CEN6-ARS4 en el huésped ade2Δ (Figura complementaria 2). También construimos vectores pCas-G418-ADE2 que contienen el origen 2μ de S. cerevisiae (pCas-G418-2μ-ADE2) y el origen panARS del huésped amplio (pCas-G418-panARS-ADE2), y aunque ambos vectores facilitaron la eliminación de ADE2 basado en el fenotipo de color y la PCR de colonias, todos los transformantes mostraron una integración estable de los marcadores seleccionables (Figura complementaria 3).

Para confirmar la integración del vector, construimos un derivado de pCas que carece de un origen plasmídico funcional (pCas-G418-NoOri-ADE2). La introducción de pCas-G418-NoOri-ADE2 en P. occidentalis generó transformantes resistentes a G418, incluidas colonias rojas de ade2Δ (Figura complementaria 4), lo que indica integración cromosómica ya que el vector carece de un origen de replicación funcional. En conjunto, estos datos son consistentes con la integración cromosómica de los vectores pCas en P. occidentalis.

La integración cromosómica de vectores plantea un desafío para la ingeniería de cepas, ya que los marcadores cromosómicos son difíciles de eliminar de las células, lo que dificulta rondas posteriores de edición del genoma. Para permitir el reciclaje de marcadores de resistencia a los antibióticos en P. occidentalis, exploramos CRISPR-Cas9 como un medio para inactivar o intercambiar marcadores cromosómicos de resistencia a los antibióticos. Primero eliminamos el gen ADE2 usando pCas-G418-CEN6ARS4-ADE2, produciendo un mutante ade2Δ G418R. En un evento de edición posterior, presentamos a la cepa ade2Δ G418R un vector pCas-Hyg-CEN6ARS4 que alberga un ARNg dirigido al marcador de resistencia G418. Dirigirse al marcador cromosómico G418R produjo un aumento sustancial en el número de transformantes HygR en comparación con una transformación de control en la que el ARNg G418 se reemplazó con un ARNg no dirigido (Figura complementaria 5). Si bien no incluimos un donante exógeno para la reparación de roturas de doble cadena (DSB) entregadas al marcador cromosómico G418, sospechamos que el vector pCas-Hyg-CEN6ARS4 recientemente introducido proporcionó un donante de reparación de DSB eficiente. Específicamente, pCas-Hyg-CEN6ARS4 alberga un donante PTEF1-Hyg-TTEF1 codificado por vector para la reparación del DSB entregado al casete cromosómico PTEF1-G418-TTEF1 dentro de la cepa ade2Δ G418R. La pérdida de resistencia a G418 se confirmó mediante la ausencia de crecimiento en placas de agar YPD que contienen G418 y mediante PCR utilizando cebadores específicos para el marcador HygR (Figura complementaria 5).

Habiendo establecido una estrategia general para reciclar marcadores de antibióticos, probamos este enfoque para realizar rondas iterativas de edición CRISPR en P. occidentalis utilizando nuestro mutante ade2Δ G418R para eliminar un nuevo gen objetivo y al mismo tiempo inactivar el marcador G418R preexistente. Para la eliminación del gen, seleccionamos FCY1, que codifica la citosina desaminasa, ya que su inactivación confiere resistencia a la 5-fluorocitosina, un análogo tóxico de la citosina (Figura complementaria 6). Eliminar FCY1 y eliminar G418R requiere la introducción de dos ARNg de un único vector pCas-Hyg-CEN6ARS4. Para probar la entrega y eficiencia de dos especies de ARNg, transformamos el mutante ade2Δ G418R con el vector pCas-Hyg-CEN6ARS4 linealizado junto con los ARNg FCY1 y G418, cada uno de los cuales se superpone con pCas-Hyg-CEN6ARS4. Debido a que solo se requiere una especie de ARNg para la reparación de la brecha, las colonias HygR poseen tres genotipos posibles: (1) mutantes únicos FCY1 G418S; (2) mutantes únicos fcy1Δ G418R; o (3) mutantes dobles fcy1Δ G418S. Para analizar la proporción de estos genotipos, introdujimos cantidades iguales de ARNg de FCY1 y G418 y analizamos las colonias HygR resultantes para detectar la eliminación de FCY1 y la susceptibilidad a G418. La detección de 18 colonias HygR de esta manera produjo 11 colonias G418S, pero ningún mutante fcy1Δ, lo que indica que la reparación de la brecha se produjo exclusivamente utilizando el ARNg G418 a pesar de la presencia de cantidades iguales de ARNg G418 y FCY1 (Figura complementaria 7).

Debido a que apuntar a un marcador cromosómico G418R produce un aumento importante en el número de transformantes HygR (Figura 5 complementaria), supusimos que la ventaja de transformación brindada por el ARNg G418 oscureció las colonias mutantes fcy1Δ, produciendo exclusivamente mutantes individuales FCY1 G418S. Para superar este desequilibrio, valoramos la cantidad relativa de especies de ARNg G418 y FCY1. Transformamos el mutante ade2Δ G418R con un exceso de 20, 10, 5 y 3 veces de ARNg de FCY1 en relación con el ARNg de G418 para compensar la ventaja en la transformación que ofrece el ARNg de G418. La detección de las colonias HygR resultantes para la eliminación de FCY1 y la susceptibilidad a G418 produjo varias colonias que poseen ambos eventos de edición de fcy1Δ G418S (Figura complementaria 8). La mayor proporción de colonias fcy1Δ G418S (37,5%) se logró introduciendo un exceso de 10 veces de ARNg de FCY1, mientras que un exceso de cinco y tres veces produjo cada uno un 27% y un 25% de colonias con doble edición, respectivamente. Un exceso de 20 veces de ARNg de FCY1 favoreció la eliminación de FCY1, ya que solo el 12,5% de las colonias poseían ambos eventos de edición de fcy1Δ G418S.

Para desarrollar más herramientas para diseñar P. occidentalis para la producción de metabolitos heterólogos, caracterizamos un panel de elementos promotores y terminadores nativos. Seleccionamos un indicador fluorescente adecuado integrando cromosómicamente un conjunto de cuatro variantes del gen de la proteína fluorescente verde (GFP) utilizando el promotor TDH3 de P. occidentalis (PTDH3), el ortólogo del promotor nativo más fuerte en S. cerevisiae28,29. GFP mejorada (eGFP), supercarpeta GFP (sfGFP), Envy GFP y mNeonGreen GFP se integraron en el locus FCY1 de P. occidentalis utilizando pCas-Hyg-CENARS4-FCY1. Los cultivos que albergaban mNeonGreen generaron la mayor fluorescencia, seguidos de Envy, sfGFP y eGFP (Fig. 4a).

una intensidad de fluorescencia normalizada por OD de cepas de P. occidentalis Y-7552 que expresan variantes comunes del gen GFP. Las variantes que codifican GFP se expresaron utilizando PTDH3 y TRPL3 de P. occidentalis Y-7552. Las colonias que expresan GFP se muestran con exposición a los rayos UV. b Intensidad de fluorescencia normalizada por OD de mNeonGreen expresada a partir de 12 promotores del gen P. occidentalis con el terminador RPL3. c Intensidad de fluorescencia normalizada por OD de mNeonGreen expresada a partir del promotor GPM1 y 12 terminadores del gen P. occidentalis. Las barras de error representan la media ± sd de n = 3 muestras biológicas independientes. Todas las construcciones de GFP se integraron en el locus FCY1 de P. occidentalis. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Luego seleccionamos un panel de 12 promotores y terminadores de P. occidentalis basados en los caracterizados en S. cerevisiae28,29,30 (Datos complementarios 2). Las construcciones promotoras se clonaron aguas arriba de mNeonGreen con un terminador RPL3 fijo, mientras que los terminadores se clonaron aguas abajo de mNeonGreen con un promotor GPM1 fijo. Los casetes de expresión completos de mNeonGreen se clonaron en el vector pCas-Hyg-CEN6ARS4 flanqueado por homología con el gen FCY1 de P. occidentalis y se integraron en el locus FCY1. La producción de fluorescencia de los integrantes del promotor y del terminador mNeonGreen se cuantificó a partir de cultivos de fase exponencial de 12 h. La producción de fluorescencia varió en un factor de 7 y 6,5 en los 12 promotores y terminadores seleccionados, respectivamente (Fig. 4b, c), y en un factor de casi 20 en las 24 construcciones, lo que demuestra una modulación eficaz de la expresión génica en P. occidentalis. Al igual que S. cerevisiae y otros organismos, la expresión de mNeonGreen de PTDH3 produjo la mayor fluorescencia. TRPL3 y TVMA2 facilitaron la expresión de alto nivel en P. occidentalis y estuvieron entre los elementos de mayor rendimiento de todos los 5302 terminadores analizados en S. cerevisiae30.

Las técnicas de edición del genoma CRISPR-Cas9, reciclaje de marcadores antibióticos y expresión de genes heterólogos en P. occidentalis nos permitieron diseñar el huésped para la producción heteróloga de productos ácidos tóxicos. Aunque se seleccionó P. occidentalis por su tolerancia al ácido adípico, la síntesis de ácido adípico de la levadura es actualmente deficiente (2,59 mg L-1)14 debido a la incapacidad de expresar funcionalmente las enzimas enoato reductasa bacterianas en huéspedes eucariotas13,14. En ausencia de una enzima enoato reductasa activa en levaduras, optamos por diseñar P. occidentalis para la síntesis de CCM, el precursor directo del ácido adípico.

Primero diseñamos P. occidentalis Y-7552 para producir ácido protocatequiico (PCA), el metabolito heterólogo comprometido en la ruta de síntesis de CCM propuesta (Fig. 5a). Integramos AROZ que codifica DHS deshidratasa de Podospora anserina (PaAROZ) en el locus ARO4 de P. occidentalis. La cepa resultante (LP620) produjo 1,0 g L-1 de PCA en cultivos en placas de microtitulación por lotes a partir de 20 g L-1 de glucosa (Fig. 5b). A continuación, integramos un mutante resistente a la retroalimentación de la 3-desoxi-d-arabino-heptulosonato-7-fosfato (DAHP) sintasa de P. occidentalis (ARO4K225L) 31 en LP620 (produciendo LP622), lo que aumentó el título de PCA a 1,9 g L-1. . La integración posterior de aroB y aroD de E. coli, que codifican 3-deshidroquinato sintasa y 3-deshidroquinato deshidratasa, respectivamente, en el locus ARO3 de P. occidentalis de la cepa LP622 (que produce LP630) facilitó un aumento adicional en el título de PCA a 2,0 g L- 1 en cultivos en placas de microtitulación por lotes (Fig. 5b).

una vía heteróloga para la síntesis de CCM a partir de 3-deshidroshikimato (DHS) endógeno. La vía de shikimato de levadura nativa se muestra en azul, mientras que la vía de síntesis de CCM heteróloga está sombreada y se muestra en rojo. b Títulos de intermediarios de la vía CCM en sobrenadantes de cultivo de sucesivas cepas de producción de P. occidentalis modificadas genéticamente. Los títulos de metabolitos se representan en g L-1 para PCA, CAT y CCM. Los asteriscos (*) denotan un aumento o disminución significativo en el título de metabolitos en relación con la cepa original respectiva (P <0,05). Las diferencias estadísticas entre las cepas originales y derivadas se probaron mediante la prueba t de Student de dos colas. Las barras de error representan la media ± sd de n = 3 muestras biológicas independientes. c Cultivo de una cepa de P. occidentalis productora de CCM (LP635) en un fermentador discontinuo utilizando un medio mineral a pH 6,0. Durante el cultivo se midieron el crecimiento de la biomasa (DO600) y la acumulación de metabolitos de la vía CCM en el medio de cultivo. La OD600 se informa en unidades arbitrarias (unidades arb.). CAT catecol, CCM cis, ácido cis-mucónico, DAHP 3-desoxi-d-arabinoheptulosonato 7-fosfato, DHQ 3-deshidroquinato, DHS 3-deshidroshikimato, E4P eritrosa 4-fosfato, mononucleótido de flavina FMN, ácido protocatequiico PCA, fosfoenolpiruvato de PEP, Mononucleótido de flavina prenilado prFMN. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

En la vía heteróloga, la PCA descarboxilasa (AroY) convierte la PCA en catecol, que posteriormente se convierte en CCM mediante la 1,2-catecol dioxigenasa (HQD2). Seleccionamos dos variantes bacterianas de AroY (AroY de Klebsiella pneumoniae y EcdC de Enterobacter cloacae) para la conversión de PCA en catecol en la cepa LP630. Las PCA descarboxilasas requieren un cofactor FMN prenilado que es sintetizado por una flavin preniltransferasa en S. cerevisiae (ScPad1)32. No pudimos identificar un gen candidato que codifica PAD1 en el genoma de P. occidentalis, lo que nos llevó a investigar el emparejamiento de aroY y ecdC con ScPAD1. El análisis de las cepas de PCA descarboxilasa reveló una producción de catecol de 1,7 g L-1 (aroY + ScPAD1) y 1,3 g L-1 (ecdC + ScPAD1) y un consumo casi completo de PCA (Fig. 5b; Fig. complementaria 9). Por el contrario, la omisión de ScPAD1 no logró alterar los niveles de PCA en relación con la cepa de control (Figura 9 complementaria), y el emparejamiento de aroY o ecdC con HQD2 de Candida albicans (CaHQD2) en ausencia de ScPAD1 no produjo catecol ni CCM.

Para completar la vía de producción heteróloga de CCM, introdujimos CaHQD2 en nuestra cepa de producción de catecol que expresa aroY + ScPAD1 (LP632). Debido a que las cepas de producción de CCM de S. cerevisiae acumulan PCA en condiciones de lote alimentado9,10, incluimos una copia adicional de aroY con CaHQD2, lo que produjo la cepa LP635. La introducción de aroY + CaHQD2 dio como resultado la producción de 2,5 g L-1 de CCM con una cantidad menor de PCA (0,06 g L-1) y sin catecol detectable (Fig. 5b).

Después de establecer la síntesis de CCM en formato de placa de 96 pocillos, caracterizamos nuestra cepa de producción de CCM de P. occidentalis (LP635) en fermentación por lotes alimentados. Primero evaluamos la producción de CCM en cultivo a pH 6,0 para comparar nuestro huésped P. occidentalis con estudios previos que involucraban cepas genéticamente análogas de S. cerevisiae9,10. En estas condiciones, la cepa LP635 sintetizó 38,8 g L-1 CCM con un rendimiento y productividad de 0,134 g g-1 glucosa y 0,511 g L-1 h-1, respectivamente (Fig. 5c). Se detectó una pequeña cantidad de PCA y catecol (concentración combinada <0,4 g L-1).

Habiendo establecido una producción de alto nivel de CCM a pH intermedio, a continuación caracterizamos nuestra cepa de producción de CCM sin control de pH. En estas condiciones, el pH cayó rápidamente a 2,0 durante la fase del lote y el crecimiento se detuvo, como lo demuestra una disminución en la producción de CO2 (Figura 10 complementaria). El crecimiento podría restaurarse transitoriamente de manera dependiente del pH mediante un aumento gradual del pH de 2,0 a 4,5 en incrementos de 0,5 unidades. Por ejemplo, aumentar el pH del cultivo de 3,0 a 3,5 restauró el crecimiento, como lo demuestra una restauración casi instantánea de la producción de CO2. Sin embargo, el crecimiento fue transitorio, ya que la concentración de CO2 comenzó a disminuir aproximadamente 6 h después del aumento del pH. El crecimiento podría restablecerse nuevamente aumentando el pH de 3,5 a 4,0. En estas condiciones, la cepa LP635 sintetizó 7,2 g L-1 CCM. El glicerol se acumuló durante todo el cultivo, alcanzando una concentración de 12,4 g L-1 en muestras de etapa tardía.

Aunque se seleccionó P. occidentalis por su robusta tolerancia al ácido adípico a pH bajo, supusimos que el crecimiento deficiente de nuestra cepa de producción de CCM a pH bajo era una consecuencia de la toxicidad de la CCM. Para probar esta hipótesis, primero comparamos las curvas de crecimiento de P. occidentalis de tipo salvaje y cepas diseñadas para la producción de PCA y CCM en 3 × YNB (Figura complementaria 11). Nuestra cepa productora de PCA diseñada mostró una disminución en la tasa de crecimiento máxima en comparación con P. occidentalis de tipo salvaje (μmax 0,23 h-1 y 0,32 h-1, respectivamente), sin embargo, la concentración de biomasa final se mantuvo en gran medida inalterada entre las dos cepas (ODmax 1,8 y 1,9, respectivamente). La misma cepa modificada también mostró una fase de retraso prolongada en relación con la cepa de tipo salvaje. Por el contrario, la ingeniería de P. occidentalis para la producción de CCM provocó una reducción del 62 % y del 32 % en la tasa máxima de crecimiento y la concentración de biomasa, respectivamente (μmax 0,12 h-1 y ODmax 1,3) en relación con P. occidentalis de tipo salvaje. Si bien estos hallazgos son indicativos de toxicidad de CCM, nuestra cepa de producción de CCM está más modificada genéticamente que nuestra cepa productora de PCA, lo que plantea la posibilidad de que la inhibición del crecimiento pueda resultar de efectos de la edición del genoma, como la integración de vectores o la carga metabólica por una mayor expresión de cas9.

Para establecer mejor el efecto de CCM sobre la aptitud de P. occidentalis, comparamos las curvas de crecimiento de P. occidentalis de tipo salvaje en 3 × YNB saturado con CCM (<2 g L-1) o ácido adípico (22 g L-1). En ambos casos el pH del medio fue <3,5. Si bien el crecimiento de P. occidentalis no se vio afectado en gran medida en presencia de 22 g L-1 de ácido adípico (μmax 0,28 h-1 y ODmax 1,8) en relación con los medios sin suplementación ácida (μmax 0,32 h-1 y ODmax 1,9), la suplementación con < 2 g L-1 de CCM provocaron una reducción del 38% y del 42% en la tasa de crecimiento máxima y la DO600 (μmax 0,20 h-1 y ODmax 1,1) (Figura complementaria 11), lo que demuestra una toxicidad significativa de la CCM en relación con el ácido adípico. La toxicidad del CCM no fue específica de P. occidentalis Y-7552, ya que todas las especies y cepas de Pichia tolerantes al ácido adípico analizadas exhibieron una marcada toxicidad a <2 g L-1 CCM (Fig. 12 complementaria) a pesar de la notable tolerancia al ácido adípico (Fig. 3a). , Tabla 1). El crecimiento de P. fermentans 562 NCYC y el control de S. cerevisiae se inhibió completamente en presencia de <2 g L-1 CCM.

En este estudio analizamos 108 cepas de levadura en 28 géneros e identificamos a P. occidentalis como un huésped no convencional con una tolerancia excepcional a varios ácidos dicarboxílicos, en particular al ácido adípico. Desarrollamos un completo conjunto de herramientas de ingeniería de cepas para la domesticación de P. occidentalis, que incluye técnicas para la edición del genoma CRISPR-Cas9, el reciclaje de marcadores de antibióticos y la expresión de alto nivel de genes heterólogos. Aprovechamos nuestro conjunto de herramientas para diseñar el host para la producción de alto nivel de CCM, el precursor directo del ácido adípico, utilizando un medio mineral simple en un cultivo controlado por lotes alimentados. En estas condiciones, la producción de CCM por nuestra cepa (38,8 g L-1 a 0,511 g L-1 h-1) superó a todas las cepas de CCM de S. cerevisiae anteriores que abarcaron más de 10 estudios y lograron hasta 22,5 g L-1 CCM a 0,21 g L-1 h-1 (ref. 10). Nuestra cepa también superó a un huésped de Pseudomonas putida recientemente evolucionado y diseñado con una producción de CCM de 33,7 g L-1 CCM a 0,18 g L-1 h-1 (ref. 8). La producción a escala comercial de ácidos de base biológica normalmente exige títulos de al menos 50 a 100 g L-1 a una tasa de más de 1 g L-1 h-1 (refs. 33, 34) y, en consecuencia, nuestros esfuerzos brindan una solución prometedora. base para la producción industrial de CCM y ácido adípico utilizando levaduras no convencionales, como P. occidentalis.

La CCM se convierte en ácido adípico mediante hidrogenación mediante enzimas enoato reductasa bacterianas35, que actualmente funcionan mal en levaduras13. En consecuencia, se seleccionó P. occidentalis por su fuerte tolerancia al ácido adípico, aunque diseñamos la cepa para producir CCM debido a la falta de una enoato reductasa adecuada. Inesperadamente, el CCM fue sustancialmente más tóxico para P. occidentalis que el ácido adípico, incluso cuando el ácido adípico se suministró en una concentración 10 veces mayor (22 g L-1 en comparación con <2 g L-1). La toxicidad de CCM dependía del pH, ya que el crecimiento de la cepa LP635 no podía mantenerse entre pH 2,0 y 3,5, muy por debajo del pKa de CCM (3,87), pero no se vio afectado en gran medida a pH 6,0 (OD600 de 327 en fermentación alimentada por lotes). permitiendo una síntesis altamente productiva de CCM (38,8 g L-1). Un estudio previo por lotes alimentados que empleaba S. cerevisiae modificada también informó detención del crecimiento y utilización incompleta del azúcar en concentraciones de CCM superiores a 2,5 g L-1 (ref. 6). A la luz de estos hallazgos, analizamos nuestras levaduras más tolerantes al ácido adípico para determinar la tolerancia a la CCM, lo que reveló que los tres aislados de P. occidentalis eran las cepas más tolerantes a ambos ácidos, lo que sugiere mecanismos similares de toxicidad entre la CCM y el ácido adípico. Debido a la toxicidad inesperada de la CCM contra todas las levaduras analizadas, es probable que ampliar la vía heteróloga al ácido adípico mejore la aptitud de la cepa y la producción de metabolitos a pH bajo. Por lo tanto, los esfuerzos futuros deberían centrarse en la identificación o ingeniería de variantes alternativas de enoato reductasa con funcionalidad mejorada en levaduras huéspedes. Mientras tanto, la extracción in situ es una vía prometedora para mitigar la toxicidad de la CCM, ya que se ha evaluado una amplia gama de extractantes biocompatibles para la eliminación eficiente de la CCM y sus metabolitos relacionados6,36.

Otros grupos han demostrado que ciertas cepas de Pichia son tolerantes a altas concentraciones de ácidos orgánicos37,38, sin embargo, el número de cepas analizadas fue comparativamente pequeño y estaba compuesto en gran medida por aislados ambientales en lugar de cepas de tipo común. Aparte de un estudio que investigó la producción de ácido láctico utilizando un nuevo aislado37, P. occidentalis no se ha utilizado ampliamente como huésped de ingeniería metabólica y las investigaciones sobre su tolerancia al ácido se han centrado en gran medida en problemas relacionados con la contaminación de los alimentos39,40. Por lo tanto, es poco probable que P. occidentalis hubiera sido seleccionado para el cribado si hubiéramos reducido la amplitud de nuestro ensayo o si hubiésemos seleccionado cepas basándose en una simple búsqueda bibliográfica. Además, nuestro análisis identificó tres cepas de P. occidentalis como las más tolerantes al ácido adípico de las 108 cepas analizadas. Utilizando P. occidentalis Y-7552, desarrollamos métodos para la transformación y edición del genoma mediada por CRISPR. Debido a la baja eficiencia de transformación y la recombinación homóloga de Pichia spp., diseñamos un sistema de administración CRISPR-Cas9 en el que los donantes de reparación dirigidos por homología se clonan previamente en vectores pCas. De manera relacionada, la eficiencia de la edición del genoma mediada por CRISPR en Pichia pastoris mejoró hasta 25 veces al incluir un ARS en los donantes de reparación de ADN41. Al utilizar este sistema, las células hijas heredan de manera estable los donantes de reparación y son resistentes a las exonucleasas de ADN, lo que aumenta la probabilidad de eventos de edición específicos42. Si bien logramos inactivar los loci ADE2 y FCY1, produciendo mutantes con fenotipos seleccionables (pigmentación roja y resistencia a 5-FC, respectivamente), no pudimos identificar un origen de plásmido replicativo para su uso en P. occidentalis a pesar de la detección de varios plásmidos. incluido el amplio origen panARS43. Para abordar este desafío, desarrollamos una estrategia de intercambio de marcadores mediada por CRISPR, que aprovechamos para realizar cinco rondas sucesivas de edición del genoma en la construcción de nuestra cepa de producción CCM final. Para ampliar nuestro conjunto de herramientas genéticas para P. occidentalis, caracterizamos un panel de 12 promotores y 12 terminadores, lo que nos permitió modular la actividad enzimática en un factor de 20. Un ensayo de todo el genoma de los 5.302 terminadores de S. cerevisiae reveló un 81 diferencia de dos veces en la actividad del terminador30, mientras que la fuerza relativa de los promotores de P. occidentalis (PTPI1

En resumen, las colecciones de cultivos de detección de posibles levaduras tolerantes al ácido adípico identificaron a P. occidentalis como un huésped no convencional y sin explotar para la producción industrial de CCM y ácido adípico. Las herramientas y técnicas de ingeniería de cepas desarrolladas en este documento proporcionan una base sólida para la ingeniería de Pichia tolerante a los ácidos y permitirán la construcción de cepas de producción de ácidos orgánicos altamente robustas.

Las 153 cepas de levadura no Saccharomyces solicitadas en este estudio se enumeran en los Datos complementarios 1. Se utilizó Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-7D (MATα) para ensamblar plásmidos in vivo mediante reparación de huecos. A menos que se indique lo contrario, todos los cultivos de levadura se cultivaron en YPD (10 g L-1 de extracto de levadura Bacto, 20 g L-1 de bacto peptona, 20 g L-1 de glucosa). Las cepas recombinantes de S. cerevisiae se seleccionaron en agar YPD que contenía 400 μg mL-1 G418 o 200 μg mL-1 de higromicina B. Las cepas recombinantes de Pichia se seleccionaron en agar YPD que contenía 1200 μg mL-1 G418, 600 μg mL-1 de higromicina B, o 100 μg mL-1 de nourseotricina. Los plásmidos y las cepas diseñadas empleadas en este trabajo se proporcionan en las Tablas 2 y 3, respectivamente. Los oligonucleótidos utilizados en este trabajo se proporcionan en los Datos complementarios 2.

Las cepas se recibieron de los repositorios y se utilizaron para inocular medio líquido de malta de levadura (YM), que contenía 5 g L-1 de peptona, 3 g L-1 de extracto de levadura, 3 g L-1 de extracto de malta y 10 g L-1 de dextrosa. Las cepas se cultivaron a 30 °C hasta que se saturaron por completo (hasta siete días) y posteriormente se almacenaron en glicerol al 15 % a -80 °C.

Para ensayos de tolerancia ácida de alto rendimiento, las cepas congeladas se revivieron en lotes de 30 en medio YPD a 30 °C. Una vez que todos los cultivos estuvieron visiblemente turbios, las cepas se diluyeron nuevamente (1:20) en 180 μL de YPD en una placa poco profunda de 96 pocillos y se dejaron crecer durante 8 horas o hasta que los cultivos alcanzaron una DO600 de 1,8. Después de la segunda incubación, se midió la DO600 en un lector de placas y se utilizó un script personalizado para crear un archivo CSV con los volúmenes absolutos de diluyente y cultivo celular necesarios para diluir cada cultivo a una DO600 de 1,8. Luego se llevaron a cabo diluciones utilizando el Span-8 de un sistema de manipulación de líquidos Biomek FXP para crear una placa intermedia con 30 cepas por triplicado, incluida S. cerevisiae CEN.PK 113-7D como control. De las placas intermedias, se extrajo un inóculo de 10 µL y se dispensó en una placa experimental que contenía 170 µL del medio de crecimiento relevante. El volumen final de cada pocillo fue de 180 µL y la DO600 inicial de todas las cepas fue de 0,1. Las pruebas iniciales de tolerancia a los ácidos orgánicos se realizaron en medio YPD, YPDcit (YPD que contiene ácido cítrico 0,1 M añadido para disminuir el pH a 3,0) o YPDAA (YPD que contiene 20 g L-1 de ácido adípico, lo que da como resultado un pH de 3,7). . Las pruebas de ácidos orgánicos realizadas en medios mínimos utilizaron una base común de 20 g L-1 de glucosa, 5,1 g L-1 de YNB sin aminoácidos y sin sulfato de amonio, 5,0 g L-1 de sulfato de amonio y 0,15 M de compuestos orgánicos relevantes. ácido. Se añadió HCl gota a gota hasta un pH final de 2,8. Después de la inoculación, las placas se sellaron con parafilm y se incubaron a 30 °C en lectores de placas Tecan Sunrise durante 48 h. Las placas se agitaron orbitalmente durante 15 minutos, se dejaron reposar durante 5 minutos antes de las lecturas de DO600 y se reinició la agitación.

Para los ensayos de tolerancia a CCM, las curvas de crecimiento se generaron por triplicado en placas de microtitulación de 96 pocillos que contenían 180 µl de medio. Las cepas diseñadas para la producción de PCA o CCM se analizaron en medio YNB 3X que contenía 2% de glucosa. Para la tolerancia a la CCM exógena, se añadió CCM a 3X YNB a 2 g L-1, se calentó suavemente a 50 °C durante 4-6 horas y se filtró la suspensión parcialmente disuelta resultante. Para la tolerancia al ácido adípico exógeno, el ácido adípico se disolvió a 22 g L-1 (0,15 M) con calentamiento suave. Los cultivos se inocularon utilizando cultivos saturados durante la noche hasta una DO600 inicial de aproximadamente 0,1 y se envolvieron en Parafilm para minimizar la evaporación. La absorbancia se midió a 600 nm cada 20 min con un lector de microplacas de absorbancia Sunrise (Tecan) durante el transcurso de 30 h. Las tasas de crecimiento específicas máximas (μmax h-1) se determinaron a partir de cultivos por triplicado y se basaron en lecturas de DO600.

Las modificaciones genéticas de la levadura se realizaron mediante integración genómica mediada por CRISPR-Cas946,47 y ensamblaje de ADN in vivo48. Secuencias de loci de integración, ARNg, ADE2, promotores y terminadores de Pichia spp. tolerantes al ácido adípico. se obtuvieron a partir de borradores de secuencias del genoma informados24. Cas9 y gRNA se entregaron a cepas de Pichia utilizando pCas-G418-CEN6ARS4 (ref. 46) o pCas-Hyg-CEN6ARS4 (ref. 49). Para la integración cromosómica en Pichia, los donantes de reparación por homología se clonaron primero en vectores pCas mediante reparación de huecos en S. cerevisiae. Los donantes de reparación de homología fueron diseñados para poseer aproximadamente 800 pb de homología flanqueante con el genoma de Pichia, además de 40 a 50 pb de superposición interna y 40 a 50 pb de superposición externa con pCas-G418-CEN6ARS4 digerido con BglII para su ensamblaje en S. cerevisiae. Se recuperaron vectores pCas que albergaban plantillas de donantes de reparación de S. cerevisiae, se linealizaron con BsaI o NotI y se usaron 200 ng para transformar cepas de Pichia con un exceso de cinco a diez veces mayor de una especie de ARNg dirigida al locus de integración genómica de Pichia (600 ng) en relación con un ARNg dirigido a marcadores cromosómicos de resistencia G418 o Hyg (120 ng) en una transformación estándar de acetato de litio de 50 μl. Los ARNg se redirigieron mediante una PCR SOE de dos pasos. Las células se sometieron a un choque térmico a 42 °C durante 40 minutos, se recuperaron durante 16 h sin agitación y se sembraron en placas de agar YPD que contenían los antibióticos apropiados. La selección de ARNg dirigidos a los loci de Pichia se realizó utilizando CCTop50. Los sitios objetivo de ARNg utilizados en este estudio se proporcionan en la Tabla 4. Se seleccionaron grandes regiones intergénicas (>1,5 kb) como loci para la integración del ADN en P. occidentalis. Los promotores de P. occidentalis (0,6–1,5 kb) se identificaron seleccionando la secuencia completa flanqueada por las secuencias codificantes diana y aguas arriba. Los terminadores de P. occidentalis (0,3–1,2 kb) se identificaron seleccionando la secuencia completa flanqueada por las secuencias codificantes diana y posteriores. Los casetes de expresión de Pichia se proporcionan en la Tabla 5. Las secuencias de promotores y terminadores de P. occidentalis y los loci de integración se proporcionan en los Datos complementarios 3 y 4, respectivamente. Los genes y ADN sintéticos se proporcionan en los Datos complementarios 5.

Las colonias de Pichia que expresaban variantes de GFP se recogieron por triplicado en placas de microtitulación de 96 pocillos con fondo en V estándar que contenían 0,15 ml de medio YNB y 20 g L-1 de glucosa. Los cultivos se cultivaron durante la noche y se diluyeron en 0,8 ml de medio YNB fresco en placas profundas de 96 pocillos hasta una DO600 inicial de aproximadamente 0,1. Los cultivos se incubaron con agitación durante 12 h antes de la DO600 y las mediciones de fluorescencia. La fluorescencia se midió usando el lector de placas M200 (Tecan) usando una longitud de onda de excitación de 485 nm y una longitud de onda de emisión de 525 nm. La ganancia se ajustó manualmente para cada muestra. Se incluyó una cepa que carecía de GFP como control de la autofluorescencia.

Las colonias de Pichia que sintetizaban metabolitos heterólogos se recogieron por triplicado en placas profundas de 96 pocillos que contenían 0,5 ml de medio YPD. Los cultivos se cultivaron durante la noche, se diluyeron 50\(\times\) en medio YPD nuevo y se incubaron durante 48-72 h. La DO600 de los cultivos se midió utilizando el lector de placas M200 (Tecan) y las muestras se congelaron a -20 °C antes del análisis por HPLC o LC-MS.

Las fermentaciones alimentadas por lotes controladas se llevaron a cabo en fermentadores BioBundle de 3 L (Applikon). La temperatura de cultivo se mantuvo a 30 °C. Las fermentaciones se realizaron a pH 6,0 mediante titulación automática con NH3 al 12,5% o sin control de pH y ajuste gradual del pH durante el cultivo con NaOH 4 N para rescatar el crecimiento de cepas productoras de CCM a pH bajo (pH 2,0-3,5). El oxígeno disuelto se mantuvo al 30% de la saturación del aire (tasa de aireación 1,5 L min-1). La composición de los gases residuales (concentración de O2 y CO2) se analizó utilizando un analizador de gases Tandem Multiplex (Magellan BioTech). El inóculo del biorreactor se generó en un matraz agitado de 500 ml que contenía 50 ml de medio discontinuo (40 g de glucosa, 2,5 g de KH2PO4, 6,0 g (NH4)2SO4, 1,0 g de MgSO4·7H2O, 5 ml de stock de vitaminas y 5 ml de stock de oligoelementos por litro) y se cultivaron durante 36-48 h a 30 °C. La composición de las soluciones madre de vitaminas y oligoelementos se describe en Pyne et al. 51. Las células se lavaron y suspendieron en NaCl al 0,9 % y se usaron para inocular (DO600 = ~0,3) 1 litro de medio discontinuo. El cultivo se operó en modo discontinuo hasta que se agotó la glucosa, seguido de la fase de alimentación discontinua con adición automática de alimento. El medio de alimentación para cultivo a pH 6,0 contenía 600 g de glucosa, 20,8 g de KH2PO4, 5 g (NH4)2SO4, 8,3 g de MgSO4·7H2O, 5 g de K2SO4, 20 ml de reserva de vitaminas y 20 ml de reserva de oligoelementos por litro. El medio de alimentación para cultivo sin control de pH contenía 360 g de glucosa, 7,5 g de KH2PO4, 30 g (NH4)2SO4, 3 g de MgSO4 · 7H2O, 7,5 ml de reserva de vitaminas y 7,5 ml de reserva de oligoelementos por litro. Se recogieron muestras cada 12 h durante un total de tres días. El peso seco celular (g L-1) se calculó utilizando un factor de conversión de 0,36 g L-1 por OD600 (determinado gravimétricamente). Los datos del biorreactor se recopilaron y analizaron utilizando BioXpert 1.3 (Applikon).

Se utilizó LC-MS para cuantificar PCA y CCM de cultivos cultivados en placas profundas de 96 pocillos. Para extraer los metabolitos, se combinaron 7 μl de caldo celular con 27 μl de acetonitrilo al 100 % y las muestras se agitaron vigorosamente durante 5 minutos, seguido de la adición de 146 μl de ácido fórmico al 0,123 % (concentración final del 0,1 %). Los extractos se centrifugaron a 4000 RCF durante 10 minutos y los sobrenadantes se diluyeron 10 veces más en acetonitrilo al 15 % que contenía ácido fórmico al 0,1 % antes del análisis por LC-MS. Se separaron diez µl de extracto diluido en un sistema LC 1290 Infinity II (Agilent Technologies) con una columna Zorbax Rapid Resolution HT C18 (50 × 2,1 mm, 1,8 µm; Agilent Technologies). Los metabolitos se separaron usando el siguiente gradiente: 2% B a 10% B de 0 a 4 min (0,3 ml min-1), 10% B a 85% B de 4 a 6 min (0,3 ml min-1), mantenido a 85 % B de 6 a 7 min (0,3 ml min-1), 85 % B a 2 % B de 7 a 7,1 min (0,3 ml min-1) y se mantuvo al 2 % B de 7,1 a 9 min (0,45 ml mín-1). El disolvente A era ácido fórmico al 0,1 % en agua y el disolvente B era ácido fórmico al 0,1 % en ACN al 100 %. Después de la separación, el eluyente se inyectó en un MS de tiempo de vuelo cuadrupolo Agilent 6545 (QTOF-MS; Agilent Technologies) en modo negativo. La bandeja de muestras y el compartimento de la columna se configuraron a 4 °C y 30 °C, respectivamente. El caudal y la temperatura del gas envolvente se ajustaron a 10 L min-1 y 350 °C, respectivamente, mientras que los gases de secado y nebulización se ajustaron a 12 L min-1 y 55 psig, respectivamente. La temperatura del gas de secado se ajustó a 325ºC. Los datos QTOF se procesaron y manipularon utilizando el software MassHunter Workstation versión B.06.00 (Agilent Technologies).

Se analizaron y cuantificaron glucosa, glicerol, PCA, catecol y CCM de muestras de caldo de fermentación discontinuo mediante HPLC-UV y RID. Para el análisis de CCM, el caldo de cultivo se combinó con un volumen igual de NaOH 10 N y se incubó durante 10 minutos con agitación. Los restos celulares se centrifugaron a velocidad máxima durante 10 minutos y el sobrenadante se diluyó en PBS 40 mM, pH 7,4. Alternativamente, la CCM se analizó diluyendo el sobrenadante del cultivo 50 veces directamente en agua o PBS 40 mM, pH 7,4. Para el análisis de glucosa, glicerol, PCA y catecol, el caldo de cultivo se diluyó en PBS 40 mM, pH 7,4 y se centrifugó a velocidad máxima durante 10 minutos. Se separaron cinco µl de caldo extraído en un sistema HPLC Agilent 1200 equipado con una columna Aminex Fast Acid Analysis. Los metabolitos se separaron isocráticamente utilizando H2SO4 10 mM a un caudal de 0,8 ml min-1. Se detectaron PCA y catecol a 210 nm. CCM se detectó a 260 nm. Las trazas se recogieron y analizaron utilizando ChemStation versión B.02.00 (Agilent Technologies).

Todos los valores numéricos se representan como medias ± sd. Las diferencias estadísticas entre las cepas de control y las diseñadas se evaluaron mediante pruebas t de Student de dos colas asumiendo varianzas iguales. En todos los casos, los valores de P <0,05 se consideraron significativos. La importancia estadística de la longitud de la cadena del ácido dicarboxílico se evaluó mediante regresión lineal OLS con tasas de crecimiento horarias como variable de respuesta. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando Excel 2306 Build 16.0.16529.20164 (Microsoft) o Prism versión 9.5.1 (GraphPad).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Se accedió a los borradores de secuencias del genoma de cepas de Pichia tolerantes a los ácidos relevantes bajo el acceso de BioProject PRJNA870168. Los datos originales se proporcionan con este documento.

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Agradecemos a Nicholas Gold y Concordia Genome Foundry por su ayuda con la detección de alto rendimiento. También agradecemos a Marcos DiFalco por su ayuda con los análisis LC-MS. Este estudio fue apoyado financieramente por una subvención de NSERC-Industrial Biocatalysis Network (IBN), una subvención de NSERC Discovery y por bp Biosciences Center. MEP recibió el apoyo de una beca posdoctoral del NSERC, KK recibió el respaldo de una beca posdoctoral Horizon de la Universidad de Concordia y LN recibió el respaldo de una beca de investigación doctoral FQRNT DE para estudiantes extranjeros. VJJM cuenta con el apoyo de una Cátedra de Investigación de la Universidad Concordia. MW cuenta con el apoyo de una Cátedra de Investigación de Canadá.

Michael E. Pyne

Dirección actual: Departamento de Biología, Universidad de Western Ontario, Ontario, Canadá

James Bagley

Dirección actual: Centro de Biología Sintética Aplicada, Universidad Concordia, Montreal, QC, H4B 1R6, Canadá

lauren narcross

Dirección actual: Amyris, Inc., Emeryville, CA, EE. UU.

Kaspar Kevvai

Dirección actual: Pivot Bio, Berkeley, CA, EE. UU.

Kealan Exley

Dirección actual: Centro de Biosostenibilidad de la Fundación Novo Nordisk, Lyngby, Dinamarca

Estos autores contribuyeron igualmente: Michael E. Pyne, James A. Bagley.

Departamento de Biología, Universidad Concordia, Montreal, QC, H4B 1R6, Canadá

Michael E. Pyne, James A. Bagley, Lauren Narcross, Kaspar Kevvai, Kealan Exley, Meghan Davies, Malcolm Whiteway y Vincent JJ Martin

Centro de Biología Sintética Aplicada, Universidad Concordia, Montreal, QC, H4B 1R6, Canadá

Michael E. Pyne, Lauren Narcross, Kaspar Kevvai, Kealan Exley, Meghan Davies, Malcolm Whiteway y Vincent JJ Martin

BenchSci, Toronto, ON, Canadá

meghan davies

Centro de Biociencias bp, San Diego, California, EE.UU.

Qingzhao Wang

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MEP, JAB, LN, KK, QW y VJJM diseñaron la investigación. MEP, JAB y LN realizaron los experimentos. KE y MD ayudaron en los estudios preliminares y en el cultivo por lotes alimentados. VJJM y QW supervisaron la investigación. MEP, JAB, MW y VJJM escribieron el manuscrito.

Correspondencia a Vincent JJ Martin.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Nuno Mira, Tsutomu Tanaka y los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Un archivo de revisión por pares está disponible.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado a los autores originales y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Pyne, ME, Bagley, JA, Narcross, L. et al. Detección de levaduras no convencionales para determinar tolerancia a los ácidos e ingeniería de Pichia occidentalis para la producción de ácido mucónico. Nat Comuna 14, 5294 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-41064-5

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Recibido: 24 de abril de 2023

Aceptado: 22 de agosto de 2023

Publicado: 31 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-41064-5

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