Un hongo recombinante Aspergillus oryzae transmitido de larvas a adultos de mosquitos Anopheles stephensi inhibe el desarrollo de ooquistes del parásito de la malaria

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 12177 (2023) Citar este artículo

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El control de la transmisión del parásito de la malaria de los mosquitos a los humanos se ve obstaculizado por la eficacia cada vez menor de los insecticidas, el desarrollo de resistencia a los medicamentos contra la malaria de último recurso y la ausencia de vacunas eficaces. En este documento, se investigó la actividad de bloqueo de la transmisión antiplasmodial de una cepa del hongo Aspergillus oryzae (A. oryzae-R) recombinante, que se utiliza en la industria alimentaria humana, en mosquitos Anopheles stephensi criados en laboratorio. La cepa de hongo recombinante se modificó genéticamente para secretar dos péptidos efectores antiplasmodiales, los péptidos MP2 (péptido 2 del intestino medio) y EPIP (péptido de interacción enolasa-plasminógeno). La transmisión transestadial del hongo de larvas a mosquitos adultos se confirmó tras la inoculación de A. oryzae-R en las bandejas de agua utilizadas para la cría de larvas. La secreción de péptidos efectores antiplasmodiales dentro del intestino medio del mosquito inhibió la formación de oocistos de los parásitos P. berghei. Estos resultados indican que A. oryzae puede usarse como modelo de paratransgénesis que transporta proteínas efectoras para inhibir el desarrollo del parásito de la malaria en An. stephensi. Se necesitan más estudios para determinar si este hongo recombinante puede adaptarse en condiciones naturales, con un impacto mínimo o nulo en el medio ambiente, para atacar agentes de enfermedades infecciosas transmitidas por mosquitos dentro de sus vectores.

Plasmodium, que causa la malaria, es la enfermedad transmitida por vectores más importante y se transmite a través de la picadura de mosquitos anofelinos infectados1. Casi la mitad de la población mundial vive en zonas propensas a la malaria y más de 400.000 personas mueren a causa de la malaria cada año, la mayoría de ellas niños pequeños1. A pesar de los continuos esfuerzos de gestión, el control de la malaria ha tenido un éxito limitado, los niveles de infección se han estancado y la erradicación sigue siendo difícil de alcanzar. Sin duda, la actual pandemia de COVID-19 tiene implicaciones indirectas para el control de la malaria. La rápida respuesta a la COVID-19 debe inspirar esfuerzos para mejorar el control de la malaria; de lo contrario, existe el riesgo de un aumento de la mortalidad causada por esta pandemia, particularmente entre los niños, y de deshacer una de las campañas de salud pública más efectivas2. En consecuencia, existe una necesidad urgente de alternativas prácticas para controlar la malaria1.

Los mosquitos son los huéspedes definitivos de la malaria y de muchas otras enfermedades transmitidas por vectores. Anopheles stephensi es un importante vector de malaria en Asia y recientemente se ha extendido al Cuerno de África3. En el mosquito, el parásito pasa por etapas de desarrollo, multiplicación y maduración dentro del intestino medio4. Por lo tanto, el intestino medio puede considerarse un objetivo principal para la intervención, de modo que la competencia entre microbiomas en el intestino puede resultar en que una especie en particular gane ventaja en el intestino5,6. La microbiota del mosquito puede derivarse del medio ambiente en cualquiera de las distintas etapas del ciclo de vida del mosquito y tiene efectos importantes a través de interacciones con procesos biológicos del mosquito, como el crecimiento, las respuestas inmunes, la digestión, la reproducción y la resistencia a los patógenos7,8. Por tanto, la composición de especies del microbioma del mosquito es muy dinámica y diversa9,10,11.

En los últimos años, gran parte de la agenda de investigación sobre la malaria se ha centrado en el desarrollo de fármacos o vacunas. A medida que disminuye la eficacia de los insecticidas y los tratamientos contra la malaria y debido a la insuficiencia de vacunas eficaces contra las enfermedades transmitidas por mosquitos, los resultados de la vacuna contra la malaria más avanzada (RTS, S) sugieren que solo reduce la morbilidad y, por lo tanto, es inadecuada como herramienta. para lograr el objetivo de erradicar la malaria1. La demanda de enfoques de control más dinámicos dirigidos a vectores está creciendo cada vez más12. Entre los métodos propuestos recientemente, la paratransgénesis es un enfoque de vía novedoso y multifacético que se ha sugerido como un medio potencial para controlar las enfermedades transmitidas por vectores. Este enfoque intenta eliminar un patógeno de una comunidad de vectores manipulando genéticamente organismos simbióticos del vector, como bacterias, virus u hongos, induciendo al endosimbionte a producir moléculas efectoras antipatogénicas13,14. Se han probado microorganismos, incluidos virus15, hongos13,16 y bacterias17, como candidatos paratransgénesis en vectores de malaria. Para facilitar el enfoque, los microorganismos que se utilizan para la paratransgénesis deben estar asociados con la población de vectores objetivo, deben crecer de manera eficiente en medios comúnmente disponibles y económicos, y deben ser genéticamente modificables en el laboratorio. Después de la manipulación genética, deben seguir siendo similares al tipo salvaje y deben colonizar y dominar dentro del vector de manera eficiente y, finalmente, deben ser seguros con respecto a los humanos, el medio ambiente y los animales no objetivo18.

La mayoría de los estudios relacionados con el enfoque paratransgensis se han concentrado en la microbiota del intestino medio de los mosquitos8,19,20. En este estudio, nos centramos en Aspergillus oryzae (A. oryzae), que se utiliza para producir alimentos y bebidas fermentados como el sake y el shoyu. Además, se puede aislar de suelos y plantas y no es dañino para humanos ni animales. A. oryzae es un microorganismo que generalmente se considera seguro. Puede cultivarse y producirse fácilmente en grandes cantidades con la tecnología actualmente disponible21. De hecho, recientemente se ha empleado un sistema de modificación genética basado en hongos que es relativamente simple y más fácil que los agentes paratransgénicos como las bacterias del intestino medio de los mosquitos y que ya se ha utilizado para controlar otros vectores13. Debido a que a menudo viven en libertad, son respetuosos con el medio ambiente, son muy eficaces y pueden sobrevivir en el medio ambiente durante meses en forma de esporas22, los hongos son excelentes candidatos para la paratransgénesis. Una vez que ingresan al insecto, se propagan en el cuerpo del insecto y, finalmente, las esporas del hongo se liberan del insecto, completando su ciclo de vida13,23.

Sería muy valioso obtener cepas de hongos transgénicos que reduzcan significativamente la infectividad de los mosquitos, ya que esto podría mejorar el control de enfermedades sin matar a los mosquitos24. La diseminación eficiente de tales microorganismos también es un desafío importante. En el estudio actual de A. oryzae, hemos demostrado que estos hongos son casi perfectos para esta tarea. A. oryzae se transfiere fácilmente de larvas a adultos. Los hongos también colonizan de forma estable el intestino del mosquito, donde se desarrollan los parásitos de la malaria. Modificamos A. oryzae con un plásmido que expresa una proteína verde fluorescente y moléculas que bloquean selectivamente el desarrollo del parásito en el vector. MP2 y EPIP son dos péptidos identificados que inhiben el desarrollo de Plasmodium en el intestino medio de Anopheles18,25,26,27. La proteína glucoamilasa (GLA) se emplea como proteína de fusión para facilitar la secreción de GFP y péptidos en el medio con mayor eficiencia. Se introdujeron dos genes efectores en la cepa auxótrofa pyrG de A. oryzae en dos construcciones diferentes, A. oryzae-RE; GLA-GFP-EPIP (fusión de péptido de interacción glucoamilasa-proteína fluorescente verde-enolasa-plasminógeno) y A. oryzae-RM: GLA-GFP-MP2 (fusión de glucoamilasa-proteína fluorescente verde-péptido 2 del intestino medio).

EPIP es un péptido que evita que el plasminógeno se una a la superficie del ookinete durante la invasión del parásito del epitelio del intestino medio28,29,30, y MP2 se une a la superficie del intestino medio del mosquito e inhibe la invasión de Plasmodium28,31. Estas proteínas efectoras inhiben fuertemente Plasmodium al reducir la formación de ooquistes25,26,30,31. Por lo tanto, la combinación de A. oryzae altamente eficaz como portador y EPIP y MP2 como efectores parece prometedora para reducir la infectividad de la malaria en los mosquitos.

Aquí presentamos datos de nuestro estudio donde se introdujeron A. oryzae transgénicos en An. stephensi larvas de primer estadio (L1) a través de agua durante 24 h. La dinámica de la población de hongos etiquetados con GFP se determinó mediante microscopía confocal y, además, se confirmó mediante qPCR, transferencia Western y cultivo. La capacidad de un microorganismo para transferirse transestacionalmente en una población de vectores dependería de la capacidad del microorganismo para colonizar el intestino larvario y transmitirse a los adultos durante un período prolongado. Nuestros hallazgos sugieren que A. oryzae-R se transmite transestadialmente de larva a adulto, lo que convierte a este hongo en un candidato adecuado para la paratransgénesis. Se probaron cepas de hongos recombinantes para determinar su capacidad para bloquear el desarrollo de Plasmodium berghei en An. mosquito stephensi. Los resultados muestran que A. oryzae recombinante se puede utilizar como sistema de paratransgénesis para inhibir la formación de ooquistes en An. stephensi en el intestino medio por dos moléculas efectoras anti-Plasmodium, MP2 y EPIP, que pueden ser prometedoras para la erradicación del parásito. Este estudio destaca la posibilidad de que A. oryzae pueda liberar diferentes moléculas efectoras contra enfermedades transmitidas por vectores y con el propósito de controlar enfermedades en condiciones naturales. La optimización de este método nos ayudará a desarrollar nuevas estrategias para tratar enfermedades transmitidas por vectores en el futuro.

Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con los términos de las leyes, pautas y políticas locales de bienestar animal de la Universidad Bezmialem Vakıf, el Instituto Beykoz de Ciencias de la Vida y Biotecnología y el protocolo animal fue aprobado por el Comité de Uso y Cuidado Animal de la Universidad Bezmialem Vakıf (protocolo número 2021/155) y los experimentos de modificación genética han sido aprobados por la Universidad Bezmialem Vakif y TUBITAK (El Consejo de Investigación Científica y Tecnológica de Turquía).

Un. stephensi (cepa WT) se criaron en condiciones estándar de insectario en habitaciones con clima controlado, mantenidas a 27 °C (± 1), 80% de humedad relativa y un fotoperíodo de luz: oscuridad de 12 h: 12 h. Las larvas se alimentaron con alimento molido para peces Tetramin® (Tetra, Melle, Alemania), utilizando 0,1 mg/larva para los primeros estadios larvarios y 0,3 mg/larva para los otros tres estadios larvales en bandejas de cría de 10 × 25 × 8 cm llenas de 1 L de agua a una densidad aproximada de 0,3 larvas/cm2. Las pupas se recolectaron y colocaron en jaulas y se les proporcionó un suministro ad libitum de solución de sacarosa al 10% para mosquitos adultos32.

La cepa RIB40 de A. oryzae (n.º de catálogo: 42149) se adquirió de ATCC (American Type Culture Collection). Para la transformación fúngica se utilizó una cepa pyrG (-) A. oryzae RIB40 que se generó en nuestro laboratorio para un estudio anterior33. Se empleó Escherichia coli Mach TM para la clonación de ADN y la amplificación de plásmidos. La A. oryzae recombinante se modificó para expresar y secretar GFP y las proteínas efectoras antipalúdicas MP2 y EPIP, utilizando dos construcciones diferentes por separado, A. oryzae-RE: GLA-GFP-EPIP (glucoamilasa-proteína fluorescente verde-plasmodio enolasa-péptido de interacción plasminógeno). fusión) y A. oryzae-RM: GLA-GFP-MP2 (fusión de glucoamilasa-proteína fluorescente verde-péptido 2 del intestino medio). Todos los genes se clonaron en un vector de expresión personalizado que impulsa la expresión utilizando el promotor de amilasa TAKA (Fig. 1). Los hongos modificados genéticamente se cultivaron en placas de medio Czapek-Dox (CD) a 30 °C durante 4 a 6 días después de la incubación a 30 °C. Se aislaron colonias de hongos distintas individuales de la placa, la capa de esporas se recogió cuidadosamente y se inoculó en medio líquido dextrina-peptona-levadura (DPY) y se incubó a 30 °C, 180 rpm durante 5 a 7 días. La presencia de A. oryzae-R se verificó mediante microscopía confocal.

Vector de expresión. (i) Vector de expresión de A. oryzae-RE y (ii) A. oryzae-RM, (a) Plásmido lineal de A. oryzae-RE que contiene el promotor de amilasa Taka, glucoamilasa-proteína fluorescente verde-plasmodio enolasa-péptido de interacción plasminógeno fusión y terminador. ( b ) Plásmido lineal de A. oryzae-RM que contiene la fusión y el terminador del promotor de amilasa Taka, proteína fluorescente verde-proteína fluorescente verde-péptido 2 del intestino medio.

Investigar la colonización y adaptación de A. oryzae-R en el intestino de An. stephensi y la transferencia al intestino medio de mosquitos adultos, se inocularon aproximadamente 4 × 106 conidios/ml en 100 ml de medio DPY y luego se incubaron a 30 °C durante 5 a 7 días para la expresión de GFP; después de la incubación, los hongos se verificaron mediante microscopía confocal para confirmar la presencia de hongos recombinantes mediante detección de GFP. Se añadió A. oryzae-R (A. oryzae-RE y A. oryzae-RM mezclados en proporciones iguales) al agua que contenía larvas del primer estadio (L1) de An. stephensi a una concentración final de 1:200 y se incubaron durante 24 h34.

Las larvas sumergidas se recolectaron después de 24 h, se lavaron dos veces en baños separados con agua destilada para eliminar los hongos en la superficie corporal de las larvas y luego se transfirieron a agua dulce para evitar la contaminación con hongos externos. La presencia de los hongos modificados se controló en cuatro momentos (días 1, 4, 7 y 10) después de la inoculación con los hongos y nuevamente en cuatro momentos (días 1, 4, 7 y 10) después de la eclosión de los adultos. . Las larvas individuales y los mosquitos adultos se esterilizaron en superficie lavándolos con etanol al 75% y luego enjuagándolos en PBS estéril antes de la disección.

Se recolectaron, diseccionaron y examinaron al menos 5 larvas de cada punto temporal utilizando un microscopio confocal (microscopio confocal de escaneo láser Leica DMi8, 20 × objetivos) para detectar la presencia de GFP para evaluar la viabilidad y actividad de los hongos en el intestino larvario. Para investigar la colonización de A. oryzae-R en el intestino larvario, la resistencia en el entorno intestinal y la transmisión al intestino medio del mosquito adulto (transmisión transestadial), se recolectaron al menos 5 mosquitos hembra, se esterilizaron en superficie y se diseccionaron para obtener sus intestinos medios. en momentos específicos, y luego se examinó la presencia de hongos que expresan GFP mediante microscopía confocal. Además, An. stephensi se criaron en bandejas sin A. oryzae-R como control negativo.

Se tomaron muestras de las larvas en cuatro momentos: 1, 4, 7 y 10 días después de la inoculación en la larva y en los mismos momentos (días 1, 4, 7 y 10) después de la emergencia como adultos. Las muestras se esterilizaron superficialmente con etanol al 75% y se enjuagaron en PBS35 estéril. El ADN genómico se extrajo de los grupos experimental y de control utilizando un kit de sangre y tejidos DNeasy® (QIAGEN) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se recolectaron por separado grupos de 5 a 10 larvas y de 5 a 10 mosquitos adultos en cada momento. El ensayo permitió la detección específica de una secuencia de 128 pb del gen pyrG en A. oryzae. Las secuencias de los cebadores directo e inverso fueron 5'ATATCCTCTCCGATTTCAGCGAAGA y 5'ATGGTACTGCTTTTGGACTGTGTTT, respectivamente. La qPCR se realizó utilizando SYBR Green Master Mix (Bio-Rad, EE. UU.). El gen del ARN ribosómico 18S se utilizó como gen de referencia para la normalización. Las reacciones se realizaron en un volumen de reacción final de 20 μl con cebadores directos e inversos 200 nM y 50 ng/μl de plantilla de ADN36,37,38. El ensayo se realizó en un instrumento qPCR Rotor-Gene Q System (QIAGEN) y los datos se adquirieron en tiempo real. Se utilizaron tres réplicas experimentales para qPCR. Las condiciones de ciclismo optimizadas consistieron en 94 °C durante 4 min, seguido de 40 ciclos de 95 °C durante 10 s, 60 °C durante 15 s, 72 °C durante 10 s38. Se realizaron análisis de curvas de fusión para comprobar la formación de cebadores-dímeros. Se determinaron los valores de CT para todas las reacciones de PCR y se utilizó un método de CT comparativo para calcular el número de copias del gen pyrG expresado. La cantidad relativa de gen expresado se calculó como RQ = 2−(∆∆CT)39,40.

Para determinar la expresión y secreción de los niveles de proteína de fusión GFP por A. oryzae recombinante en las larvas y en el intestino medio del mosquito adulto, se examinaron grupos de 20 a 50 larvas y mosquitos adultos en dos momentos (días 1 y 10) después de la inoculación en el etapa larvaria y postemergencia en la etapa adulta los días 1 y 10. Antes de la disección, se esterilizaron la superficie de larvas individuales y mosquitos adultos lavándolos con etanol al 75% y luego enjuagándolos en PBS estéril. La cohorte de larvas y adultos que habían sido inoculadas con A. oryzae de tipo salvaje sirvieron como controles negativos. El aislamiento de proteínas de los intestinos disecados en estadios larvarios y adultos se realizó según el método de41. La transferencia Western se realizó como se describió anteriormente42,43,44. Las muestras de proteínas se separaron utilizando SDS-PAGE al 8% y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Amersham Protran Premium 0,45 μm NC, GE Healthcare). La membrana se incubó en tampón de bloqueo (Tween-20 al 0,1% con leche en polvo desnatada al 5% p/v) y se sondeó con anticuerpo monoclonal GFP (GF28R), HRP (Invitrogen). Se utilizó como control positivo el sobrenadante de cultivos de A. oryzae que producen la proteína de fusión GFP. Los cultivos de hongos se centrifugaron a 4000 x g durante 15 minutos a 4 ° C y se concentró un volumen igual del sobrenadante del cultivo utilizando unidades de filtro centrífugo Amicon Ultra-15.

Los especímenes se seleccionaron en cuatro momentos (días 1, 4, 7 y 10) después de la inoculación en etapa larvaria y los días 1, 4, 7 y 10 después de la eclosión del adulto. Se utilizaron larvas y adultos no tratados como controles negativos. Las superficies de las larvas y los mosquitos adultos se esterilizaron antes de la disección con etanol al 75%, y los intestinos disecados se homogeneizaron individualmente en 100 µl de PBS estéril al 1% (10 muestras en cada momento de cada etapa). Los homogeneizados se sembraron en placas de medio Czapek-Dox (CD) que contenían 50 μg/ml de kanamicina y 100 μg/ml de ampicilina y se incubaron a 30 °C durante 3 días. Se aislaron colonias de hongos distintas de cada placa y se inocularon en medio líquido dextrina-peptona-levadura (DPY) y luego se incubaron durante 5 a 7 días a 30 °C para la expresión de GFP45. Posteriormente, se observó la presencia de GFP bajo el microscopio confocal.

A. oryzae-R se introdujo en las larvas a través de agua. Las larvas de 2 días de edad se incubaron durante 24 h. Se crió un grupo control de larvas en una bandeja sin hongos. Se controló diariamente la supervivencia de las larvas y de los adultos emergidos. Se estudiaron por separado un total de 150 larvas y mosquitos adultos por grupo (50 por grupo × 3 réplicas = 150). Cinco días después de la emergencia, las hembras adultas de los mosquitos fueron privadas de hambre durante 8 h y luego se les permitió alimentarse de sangre durante 1 h. Para calcular el éxito de la ingesta de sangre, se contó el número de hembras alimentadas y no alimentadas con sangre en los dos grupos y se compararon estadísticamente las proporciones de alimentación con sangre de los dos grupos mediante una prueba t de dos proporciones. Se estudió un total de 150 mosquitos adultos por grupo (50 mosquitos por grupo × 3 réplicas = 150 mosquitos)25.

Se introdujeron A. oryzae de tipo salvaje y recombinante en larvas de 2 días a través de agua durante 24 h. Los grupos negativos de hongos sirven como grupos de control. Para los ensayos de fecundidad y fertilidad, se aplicó un método para estimular a las hembras a poner huevos como se describió anteriormente46. Las hembras alimentadas con sangre fueron alimentadas con una solución de sacarosa al 10% y se mantuvieron a 27 °C (± 1) y 80% de humedad relativa durante 3 días para alcanzar completamente la etapa de grávida. Luego, las hembras de los mosquitos se colocaron cuidadosamente individualmente en tubos cónicos de 50 ml con un papel de filtro humedecido en el fondo del tubo. Los tubos se cubrieron con algodón. Las hembras que habían puesto huevos fueron retiradas cuidadosamente de los tubos. Se contó el número de huevos puestos y los huevos eclosionados. La fecundidad de los mosquitos hembra alimentados se calculó como el número de huevos puestos por hembra. Se estudiaron un total de 90 mosquitos adultos por tratamiento (30 mosquitos por cada grupo × 3 réplicas = 90 mosquitos). La fertilidad (proporción de larvas que eclosionaron de los huevos) se calculó como el porcentaje de larvas que emergieron después de la eclosión46.

La cepa ANKA de P. berghei (MRA-868, MR4, ATCC, Manassas, Virginia) se mantuvo mediante paso cíclico a través de ratones BALB/c y An. mosquitos stephensi siguiendo un protocolo estándar. Los ratones fueron anestesiados con Rompun-Vetalar (3:1,5 mg/kg; Bayer y Parke-Davis Veterinary), luego An. de tipo salvaje. stephensi fueron alimentados con ratones anestesiados. La infectividad de cada ratón se determinó midiendo la parasitemia en frotis de sangre de la cola teñidos con Giemsa. Los ratones con 1 o 2 exflagelaciones/campo bajo un objetivo de 20 × se utilizaron para las infecciones por mosquitos. Los mosquitos alimentados con sangre se mantuvieron a 21 °C (± 1) y 70% de humedad relativa.

Se inocularon aproximadamente 4 × 106 conidios / ml como punto de partida en 100 ml de medio DPY y luego se incubaron durante 5 a 7 días a 30 ° C para la expresión de GFP. Después de la incubación, los hongos se verificaron mediante microscopía confocal para confirmar la presencia de GFP. Los hongos recombinantes y de tipo salvaje se diluyeron por separado a 1:200 en agua y las larvas de primer estadio (L1) de An. stephensi se incubaron durante 24 h. Las L1 se recogieron después de 24 h, se enjuagaron tres veces en PBS estéril para eliminar los hongos de la superficie del cuerpo de las larvas y luego se transfirieron a agua destilada. Se prepararon diferentes condiciones para exponer las larvas: 1—sin hongos (control negativo), 2—A. oryzae de tipo silvestre, 3—A. oryzae-RE, 4—A. oryzae-RM, y. 5—A. oryzae-R (A. oryzae-RE + A. oryzae-RM). Después de la eclosión hasta convertirse en adultos, los mosquitos fueron alimentados con sangre que contenía gametocitos ANKA de P. berghei durante 30 minutos en ratones BALB/c hembra de 8 semanas de edad. Las hembras completamente alimentadas se clasificaron y mantuvieron en jaulas a 21 ± 1 °C, 70% de humedad relativa, con una solución de sacarosa al 10% disponible. El efecto del desarrollo del parásito se determinó entre 10 y 12 días después de la infección contando el número de oocistos en el intestino medio mediante microscopía confocal. Se examinaron un total de 90 mosquitos adultos por tratamiento (30 por tratamiento × 3 réplicas = 90).

El estudio se realizó de acuerdo con los términos de las leyes, pautas y políticas locales de bienestar animal de la Universidad Bezmialem Vakıf, el Instituto Beykoz de Ciencias de la Vida y Biotecnología, y el protocolo animal fue aprobado por el Comité de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad Bezmialem Vakıf ( número de protocolo 2021/155).

A. oryzae fue modificada genéticamente para secretar las proteínas efectoras anti-Plasmodium EPIP y MP2. El objetivo del presente estudio fue investigar la posible capacidad de los hongos transgénicos para colonizar y adaptarse en el intestino larvario de An. stephensi y su transferencia al adulto como modelo de paratransgénesis, así como la posibilidad de inhibir el desarrollo de P. berghei en el intestino del mosquito. Si persisten consistentemente dentro del intestino de las larvas, queríamos saber si los hongos pueden transferirse al intestino medio del mosquito adulto (transmisión transestadial). La persistencia de A. oryzae-R en el intestino medio de An. stephensi fue monitoreado para investigar la dinámica y el mantenimiento de estos hongos durante la transición de larva a adulto. Para medir la colonización y persistencia de A. oryzae en el intestino larvario, se incorporó al genoma de A. oryzae un gen de proteína fluorescente que codifica una proteína fluorescente verde mejorada (GFP). Para evaluar estos parámetros, se inocularon hongos marcados con GFP a través de agua en An. stephensi larvas de primer estadio (L1) durante 24 h. En el entorno donde viven naturalmente los mosquitos Anopheles, las larvas y los mosquitos no son estériles. Así, A. oryzae también tendría que competir con otras especies de la microbiota que podrían afectar a estos parámetros. Sin embargo, el uso de colonias de mosquitos de laboratorio limitó cualquier posible interferencia de la amplia gama de microbiota encontrada en los sitios de reproducción silvestre que pueda afectar nuestros datos. La colonización de A. oryzae-R en el intestino larvario se analizó en cuatro momentos. En ambas etapas, se diseccionó el intestino medio y se analizó la presencia de hongos marcados con GFP en el intestino medio mediante microscopía confocal. Durante la metamorfosis del mosquito, la microbiota intestinal se elimina en la etapa larvaria47, pero A. oryzae-R permaneció en el intestino medio de los adultos que emergieron de estas larvas (Figs. 2, 3). Se observó una alta concentración de hongos que expresan GFP el primer día de la etapa larvaria, numerosos hongos estaban activos y ocupaban la mayor parte de la luz intestinal, incluido el intestino medio anterior (AMG) y el intestino medio posterior (PMG), y se observa cierta autofluorescencia en la región del intestino posterior (HG). Esto indica que la entrada de hongos se produce durante la ingestión. El día 4, la intensidad de GFP fue relativamente alta y se observaron muchos hongos transgénicos. Sin embargo, el día 7, disminuyeron relativamente, aunque muchas células fúngicas todavía estaban activas y expresaban GFP en el intestino. La presencia de GFP se confirmó el día 10, pero fue menor que los días anteriores (Fig. 2). Suponemos que los hongos no fluorescentes pueden estar inactivos, muertos o excretados a través de las heces. La expresión de GFP fue relativamente baja en la etapa adulta en comparación con la etapa larvaria. A pesar de una baja cantidad de hongos transgénicos en el intestino medio de los mosquitos adultos, el nivel de proteína verde fluorescente fue notable y consistente en el intestino medio de los mosquitos adultos durante todo el período de estudio (Fig. 3).

Colonización de A. oryzae-R en diferentes momentos del intestino de An. stephensi, detectadas por expresión del gen GFP en hongos colonizados. La dinámica poblacional de A. oryzae-R se visualizó mediante microscopía confocal. (i, j) control negativo, (a, b) el intestino de L1 An. stephensi larva día 1 (c – h) 4,7 y 10 Los experimentos se repitieron tres veces con resultados similares.

Colonización de A. oryzae-R en el intestino medio de un mosquito adulto en diferentes momentos mostrada por la GFP expresada en los hongos transgénicos. (a, b) adulto An. stephensi intestino medio día 1 (c – h) 4, 7 y 10, respectivamente, (i, j) control negativo. Los experimentos se repitieron tres veces con resultados similares.

Los hongos colonizaron An. stephensi muy bien en diferentes etapas de desarrollo, incluidos los estadios larvarios 1 a 4 (L1 a L4) y mosquitos adultos. Los A. oryzae transgénicos se transmitieron transestacionalmente en An. stephensi a pesar de varios eventos de muda durante las etapas larvarias, así como procesos hidrolíticos durante la metamorfosis. Un corto tiempo de contacto (24 h) entre los hongos y las larvas L1 fue suficiente para que las larvas adquirieran los hongos del agua del hábitat larvario. El examen de las larvas no tratadas y de los mosquitos adultos mediante microscopía confocal confirmó la ausencia de hongos transgénicos en los controles negativos.

Para cuantificar el número de copias de los hongos recombinantes, se utilizó PCR cuantitativa. Se examinaron larvas y mosquitos adultos en los intervalos mencionados anteriormente. El tamaño y la calidad de los productos de qPCR amplificados mostraron bandas específicas claras en el gel de agarosa tanto para las muestras de larvas como de mosquitos adultos (datos no mostrados). La amplificación qPCR de las muestras mostró la presencia del hongo en el intestino de las larvas y de los mosquitos adultos. La cuantificación se realizó dirigiéndose a una secuencia de 128 pb del gen pyrG (Fig. 4). Las medias de eficiencias de amplificación por amplicón en las muestras de larvas fueron 69 % (día 1), 64 % (día 4), 52 % (día 7) y 43 % (día 10). Disminuyó en el día 10 en comparación con el día 1. El análisis de qPCR en el estadio larvario entre el control negativo y los días 1, 4 y 7 mostró diferencias altamente significativas, p <0,05 (Fig. 4i). Para los mosquitos adultos, las eficiencias de amplificación fueron del 41,6%, 34,0%, 28,0% y 19,6% en los días 1, 4, 7 y 10, respectivamente (Fig. 4ii). La comparación entre el control negativo y los días 1, 4 y 7 fue significativa en las muestras adultas. La diferencia entre el control negativo y el día 10 no fue significativa (p = 0,082). Por lo tanto, los resultados de qPCR confirmaron la transmisión transestadial del A. oryzae transgénico. Los datos demostraron una masa de hongos en el intestino de las larvas el día 1 (69%), que disminuyó al 20% en el intestino medio del mosquito adulto el día 10.

Cuantificación relativa de la amplificación del gen pyrG mediante PCR cuantitativa en tiempo real. (i) larvas; (ii) intestino medio de mosquitos adultos en cuatro momentos (días 1, 4, 7 y 10), control negativo (control N), control positivo (control P) (p <0,05). Los datos se agruparon a partir de tres réplicas. La relación ∆∆CT esperada = 1 cuando se expresa el gen pyrG.

Utilizamos Western Blot para validar la expresión y secreción de la proteína de fusión (GFP) por hongos recombinantes. Los niveles de GFP en dos momentos analizados en larvas y adultos se muestran en la Fig. 5. Todas las muestras mostraron presencia de GFP secretada.

Análisis de transferencia Western de la secreción de proteínas. Se analizaron alícuotas de igual concentración de proteína mediante transferencia Western utilizando el anticuerpo monoclonal GFP. Se inoculó A. oryzae-R en An. stephensi L1 vía agua durante 24 h, excepto el control negativo, que fue inoculado con A. oryzae (NC) de tipo salvaje. El sobrenadante concentrado de A. oryzae-R sirvió como control positivo (PC), el primer y décimo día en estado larvario y el día uno y diez en estado adulto. Se muestran las bandas de las formas escindidas de GFP (28 kDa).

Para determinar la presencia de colonización viable de larvas y adultos emergidos por A. oryzae-R, se sembraron homogeneizados de intestino medio en placas de agar CD/kanamicina y ampicilina (Fig. 6i), seguido de una verificación de colonias fluorescentes. Se esperaba que algunas colonias en las placas de agar CD representaran la población de hongos transgénicos asociados tanto con las larvas como con el intestino medio de los mosquitos adultos. Los aislados se visualizaron mediante microscopía confocal después de la incubación (Fig. 6ii). Los resultados de la microscopía confocal mostraron expresión de GFP en todas las muestras en ambas etapas, evidencia de la capacidad del hongo para transmitirse transestacionalmente en An. mosquitos stephensi. Estos ensayos proporcionan información básica sobre la adaptación de estos hongos al entorno intestinal de las larvas y los mosquitos adultos.

Los aislados con expresión de GFP se visualizaron mediante microscopía confocal. A. oryzae-R se introdujo en An. stephensi primer estadio. La larva y el intestino medio del mosquito adulto se inocularon en placas de agar CD que contenían ampicilina y kanamicina por separado. (i) día 1 (a) y 10 (b) en etapa larvaria, cyd días 1 y 10 de etapa adulta. A. oryzae-R aislado de las larvas y del intestino medio del mosquito adulto (ii), (a, b) día primero y décimo del estadio larvario, (c, d) día primero y décimo del estadio adulto. Barra de escala, 100 mm. (Los experimentos se repitieron tres veces con resultados similares).

A continuación, queríamos descartar cualquier efecto de los propios hongos recombinantes sobre la viabilidad o el desarrollo de los mosquitos, y el éxito de la estrategia de paratransgénesis con costos mínimos de aptitud para sobrevivir en el intestino de las larvas y los mosquitos adultos en un entorno competitivo. Larvas de dos días de edad de An. stephensi (L1) se inocularon por separado con A. oryzae de tipo salvaje y A. oryzae-R. Se analizó un subconjunto de mosquitos libres de Aspergillus para detectar una posible contaminación como grupo de control negativo. Se comparó la supervivencia de larvas y mosquitos adultos portadores o no de A. oryzae (Fig. 7i, ii). No hubo diferencias significativas en la tasa de supervivencia entre los grupos en la etapa larvaria y adulta, lo que es una indicación de que la infección por hongos no afectó a las larvas ni a la tasa de desarrollo del mosquito.

Efecto de A. oryzae-R sobre la supervivencia de larvas y mosquitos adultos. (i) Tasas de supervivencia de An. stephensi después de alimentarse de A. oryzae (ii) Tasas de supervivencia de machos y hembras mixtos de An. stephensi mosquitos adultos después de su aparición. Las diferencias en las tasas de supervivencia de larvas y mosquitos adultos entre los grupos alimentados con A. oryzae y los de control negativo se analizaron mediante la regresión de Cox (Cox, 1972) (p <0,05) en el software R versión 4.0.3. La regresión de Cox comparó la supervivencia de los diferentes grupos y reveló diferencias no significativas en las tasas de supervivencia general tanto en la etapa larval como en la adulta. La supervivencia de larvas y adultos no difirió significativamente entre los grupos alimentados con A. oryzae y control negativo (larvas: prueba de rango logarítmico, res-cox, gl = 1, p = 0,8) y (adultos: prueba de rango logarítmico, res-cox, gl = 1, p = 0,3). Los datos provienen de tres réplicas biológicas con 50 mosquitos por grupo.

Para descartar cualquier efecto del A. oryzae transgénico sobre la fecundidad o fertilidad de los mosquitos, se comparó la alimentación con sangre de mosquitos incubados con o sin A. oryzae (recombinante y de tipo salvaje). No hubo efecto sobre el comportamiento de alimentación de sangre en ninguno de los grupos (Fig. 8). En promedio, el éxito de la alimentación sanguínea fue del 89,3, 90 y 90% para los grupos de mosquitos infectados (recombinantes y silvestres) y no infectados con A. oryzae, respectivamente. Todas las hembras fueron alimentadas exitosamente sin interrupciones ni alimentaciones parciales. No hubo evidencia de una reducción en la ingesta de sangre en mosquitos infectados o no infectados con Aspergillus. Los mosquitos incubados con o sin A. oryzae fueron alimentados con sangre y se evaluó el número de huevos puestos por hembra (fecundidad) y el porcentaje de huevos eclosionados (fertilidad). El número de huevos puestos por el grupo de control negativo, que no fue incubado con los hongos, fue en promedio similar a los puestos por los mosquitos alimentados con hongos (hongos recombinantes y de tipo salvaje). El valor medio de huevos puestos por los mosquitos de control fue de 86,4 por hembra, mientras que este valor fue de 85,6 (tipo salvaje) y 84,7 (A. oryzae-R) huevos por hembra para los mosquitos incubados con A. oryzae. No hubo diferencias significativas en la fecundidad de las hembras de mosquitos entre los tres grupos (p = 0,98) (Fig. 9i). La fertilidad de los mosquitos que albergan A. oryzae y el grupo de control no fue significativamente diferente (p = 0,72) (Fig. 9ii). El porcentaje medio de huevos viables incubados por A. oryzae fue del 75,3% (tipo salvaje) y del 73,5% (A. oryzae-R), mientras que el porcentaje de huevos viables puestos por las hembras control fue del 75% en su primer ciclo gonotrófico. Estos resultados indican que la alimentación de A. oryzae transgénica a An. Los mosquitos stephensi no alteran su biología en general y hacen de su uso como portador de moléculas dirigidas a patógenos una solución viable.

Efecto de A. oryzae recombinante sobre el comportamiento de alimentación de sangre de mosquitos adultos. El A. oryzae recombinante no afecta el comportamiento de alimentación de sangre de los mosquitos. Los porcentajes son medias de tres réplicas biológicas de 50 mosquitos cada una (media ± SEM). No hay diferencias significativas entre los grupos tratados con A. oryzae infectado (recombinante y natural) y el control negativo (se utilizó la prueba de comparaciones múltiples de Tukey para probar la significancia).

Impacto de los efectores antipalúdicos expresados a partir de A. oryzae recombinante sobre la fecundidad y fertilidad de los mosquitos. (i) Número de huevos producidos por hembra (media ± SEM). No hubo diferencias significativas entre los grupos. (ii) Porcentaje de huevos eclosionados (media ± SEM). Los datos se compararon dentro de los tratamientos mediante la prueba de Kruskal-Wallis y se agruparon en función de la ausencia de diferencias significativas en tres experimentos independientes. Luego se analizaron las comparaciones entre muestras mediante la prueba de Kruskal-Wallis, y las comparaciones estadísticas del número de huevos producidos por hembra y el número de huevos eclosionados con los de los controles negativos se analizaron por separado mediante la prueba de Mann-Whitney.

Para determinar si el A. oryzae recombinante afecta efectivamente el desarrollo de ooquistes en el intestino medio, se alimentaron mosquitos portadores de hongos recombinantes en ratones infectados con P. berghei, después de lo cual se determinó el número de ooquistes en los días 10 a 12 después de la infección (Fig. 10). En comparación con los grupos de control, la introducción de A. oryzae-R bloqueó drásticamente el desarrollo de oocistos (79,6–88,5%), lo que concuerda con las observaciones de Pumpuni et al. y Yoshida et al.48,49. El A. oryzae recombinante que expresa MP2 tuvo la tasa de infección más baja (83%) y una intensidad media de ooquistes significativamente menor (19,2 ooquistes/intestino medio). Una mezcla igual de hongos que expresaban EPIP redujo la intensidad media de oocistos en un 79,6% (23 oocistos/intestino medio), mientras que una mezcla de hongos que expresaban MP2 + EPIP redujo la intensidad media de oocistos en un 88,5% (13,5 oocistos/intestino medio) (Fig. 10), a pesar de tasas de infección relativamente altas.

Inhibición de la infección por P. berghei de An. stephensi por A. oryzae recombinante modificado para secretar moléculas efectoras anti-Plasmodium (EPIP y MP2). (i) Los círculos representan el número de ooquistes por intestino medio individual y las líneas horizontales muestran la mediana de ooquistes por intestino medio (también se muestra en la tabla). Los datos dentro de los tratamientos de tres réplicas biológicas no fueron significativamente diferentes (prueba de Kruskal-Wallis) y posteriormente se combinaron. Las comparaciones entre tratamientos para los datos agrupados también se analizaron mediante la prueba de Kruskal-Wallis, las medianas se compararon mediante la prueba de Dunn y las comparaciones estadísticas de los números de ooquistes con los de los controles negativos se analizaron mediante la prueba de Mann-Whitney. Se consideró estadísticamente significativo un valor de p < 0,05. (ii) Datos resumidos de (i) N, número de mosquitos analizados; Mediana, número medio de ooquistes por intestino medio; Media, número medio de ooquistes por intestino medio; % de inhibición, porcentaje de inhibición de la formación de ooquistes en comparación con el control sin hongos. (iii) Ooquistes de P. berghei que expresan GFP 10 días después de la infección de los mosquitos. El número de ooquistes en el intestino medio se contó mediante microscopía (objetivo de 40 ×). (a) Control negativo (sin hongos), (b) A. oryzae de tipo salvaje, (c) A. oryzae-RE, (d) A. oryzae-RM, (e, f) A. oryzae-RE + A oryzae-RM (las flechas apuntan a los ooquistes).

El primer paso para la paratransgénesis en el control de la malaria u otras enfermedades transmitidas por vectores es la identificación de un simbionte adaptable. Es un proceso complejo y se deben realizar estudios adecuados para comprender la relación entre los vectores y su microbiota22,26. Nuestros resultados demuestran que las larvas de An. stephensi puede obtener A. oryzae-R del agua en la que se crían. Se aislaron hongos recombinantes en grandes cantidades del intestino de las larvas el día después de la inoculación del agua con esporas de hongos. Los datos son consistentes con los de Lindh et al.50 quienes sugirieron la posibilidad de introducir microorganismos transgénicos en una población de mosquitos en el campo a través de criaderos y cebos de azúcar. Podría ser más fácil y práctico introducir microorganismos genéticamente modificados en estadios larvales que en poblaciones de mosquitos adultos. Las larvas de los mosquitos se desarrollan en el agua y se alimentan de material orgánico, como microorganismos y partículas de su entorno, por lo que las larvas pueden ingerir cualquier microorganismo en el agua51,52,53,54. Este comportamiento hace que sea relativamente más fácil exponer las larvas a los microorganismos objetivo. En consecuencia, las larvas albergan una comunidad microbiana variada y mutable53,55,56, cualquiera de las cuales podría considerarse objetivos válidos para la paratransgénesis.

Los resultados experimentales presentados aquí muestran el patrón de colonización y la transmisión transestadial de A. oryzae-R desde las larvas a los mosquitos adultos de An. stephensi. En diferentes grupos de mosquitos, la transmisión transestadial de microorganismos desde la etapa larval a la adulta incluye bacterias en los mosquitos Anopheles26,53,57,58,59,60,61,62,63,64 y el virus del dengue en Aedes aegypti65. El virus de La Crosse en Ochlerotatus triseriatus66, el virus de la fiebre del Valle del Rift en Culex pipiens y Ae. circumluteolus67, la bacteria Francisella tularensis en Ae. sticticus, Ae. vexans y Ae. punctor68 y CuLCrVvirus en Bemisia tabaci69. En la presente investigación, el A. oryzae transgénico localizado en el intestino larvario disminuyó desde el estadio larvario al adulto. Sin embargo, permanecieron en niveles relativamente constantes en el intestino medio de los mosquitos adultos durante al menos 10 días después de su aparición. Contrariamente a la opinión de que la esterilización intestinal ocurre durante la metamorfosis de pupa a adulto, algunos estudios que mencionan la transmisión transestadial sí ocurre de pupa a adulto48,58,70. Nuestras observaciones indican que la eliminación de la microbiota no es completa, y algunos de los microbios intestinales de las larvas se retienen en el intestino medio del mosquito adulto61,71,72. Algunas bacterias como Pantoea stewartii, Stenotrophomonas maltophilia, Sphingobacterium multivorum y Chryseobacterium meningosepticum permanecieron en el intestino medio antes y después de la metamorfosis y, por lo tanto, no fueron egeridas por completo17,73. La persistencia de 10 días de A. oryzae –R en el intestino medio de adultos en el presente estudio contrasta con Rhiele et al.74 quienes encontraron que E. coli fue completamente eliminada del intestino medio de An. stephensi después de sólo 96 h. A. oryzae-R y E. coli son75 organismos muy diferentes, pero quizás otros factores simbiontes, incluidas las diferentes respuestas inmunes de los mosquitos contra bacterias y hongos75,76, podrían contribuir a las diferencias entre los dos estudios. En La mayor parte de las bacterias del intestino medio en las larvas del mosquito no se transfiere al adulto47, pero se eliminan durante la metamorfosis, aunque hay algunas excepciones: Serratia odorifera se mantiene potencialmente en larvas y se transmite transestacionalmente a los mosquitos adultos a pesar de las altas temperaturas ambientales y Fuertes propiedades proteolíticas y hemolíticas en Ae. aegypti intestino medio65.

Por lo tanto, según nuestros resultados, A. oryzae puede tener alguna ventaja de crecimiento en las larvas de Anopheles y en el intestino medio adulto. Este hongo tiene un amplio rango de tolerancia al pH, desde pH 3 hasta pH 11 (datos no mostrados). Asimismo, el pH del intestino de las larvas oscila entre 7,4 y 9 o más77,78, y en el intestino adulto, el pH es de 7,4 a 7,877,79,80. Dado que A. oryzae-R puede colonizar y sobrevivir en el intestino medio larvario y se transfiere mediante metamorfosis al intestino medio adulto, esta tolerancia al pH de A. oryzae es un factor potencial que explica su sostenibilidad durante todo el ciclo de vida del mosquito. Otra posibilidad es que A. oryzae pueda ser más resistente a cualquier respuesta inmune de mosquitos que pueda desencadenarse durante ambas etapas. Ambas posibilidades son interesantes para una mayor exploración de la elección de organismos para perfeccionar los estudios y aplicaciones de paratransgénesis.

Se utilizó A. oryzae para evaluar dos potentes moléculas efectoras anti-Plasmodium, MP2 y EPIP. La expresión y secreción de cada proteína de fusión por las cepas recombinantes se verificaron mediante microscopía confocal y la expresión funcional se demostró midiendo la inhibición de la formación de ooquistes en el intestino medio del mosquito. Ambas moléculas inhibieron significativamente las infecciones por malaria en An. stephensi en la etapa de ooquiste. A. oryzae que expresa MP2 fue más eficaz que la cepa que expresa EPIP, reduciendo la intensidad de los ooquistes de P. berghei en un 83 % en comparación con el 79,6 %. Nuestros experimentos iniciales indicaron que mezclar las dos cepas que expresaban MP2 y EPIP reducía la densidad de ooquistes al 11,5%, que era mayor que la reducción lograda por MP2 o EPIP solos. En algunos experimentos, los mosquitos alimentados con sangre que contenía un alto número de gametocitos de P. berghei produjeron altas intensidades de ooquistes (media > 200 ooquistes), pero incluso en estas condiciones, la inhibición del desarrollo del parásito fue muy significativa y consistente.

En un estudio anterior, las moléculas efectoras anti-Plasmodium secretadas por Pantoea agglomerans recombinante, un simbionte bacteriano del mosquito, inhibieron la formación de ooquistes durante el desarrollo del parásito de la malaria, en varias especies de Anopheles30. Los hongos transgénicos investigados aquí tienen algunas ventajas sobre estos estudios anteriores. Están designados como seguros en la industria alimentaria, por lo que no se consideran perjudiciales para los seres humanos ni para los animales. A. oryzae es un modelo de laboratorio eficaz para estudios de paratransgénesis para evaluar varios péptidos/proteínas efectoras como agentes antiparasitarios. Varios aspectos de nuestros resultados respaldan esta afirmación; En primer lugar, el patrón de localización sugiere que A. oryzae se localiza en el intestino medio, un sitio importante para el desarrollo del parásito. En segundo lugar, A. oryzae se transmite de larvas a mosquitos adultos, conservando su viabilidad y capacidad para secretar moléculas efectoras antiparasitarias17,37. Según nuestros resultados, A. oryzae puede adaptarse mejor al entorno del intestino medio que otros agentes como las bacterias de los mosquitos. Estos resultados son consistentes con las propuestas para seleccionar organismos paratransgénicos que sean compatibles con el ambiente del intestino medio81. En tercer lugar, A. oryzae muestra una asociación estable con larvas y mosquitos adultos, como se observa por su presencia en todas las etapas de An. stephensi a través del análisis utilizando cuatro métodos diferentes. En cuarto lugar, los experimentos de colonización revelan que A. oryzae modificada, adquirida por las larvas mediante consumo, es capaz de colonizar el intestino de todas las larvas inoculadas. En quinto lugar, la modificación genética de hongos criados en laboratorio es más fácil que la de agentes paratransgénicos como las bacterias del intestino medio de los mosquitos y ya se ha utilizado para controlar otros vectores13.

Los hongos son un modelo viable y poderoso para evaluar y administrar proteínas que bloquean la transmisión y podrían usarse para expresar múltiples transgenes con diferentes mecanismos de acción para reducir la probabilidad de desarrollar resistencia. En consecuencia, se pueden diseñar numerosos péptidos o proteínas efectores en A. oryzae, y se puede modificar la colección de genes efectores para maximizar la eficacia en la lucha contra la malaria u otras enfermedades transmitidas por vectores. Concluimos que la transmisión transestadial de A. oryzae transgénica ocurre desde la etapa larvaria hasta la etapa adulta de An. stephensi. Por lo tanto, en un enfoque paratransgénico, puede ser posible propagar los hongos transgénicos en criaderos donde las larvas de mosquitos pueden quedar expuestas a las esporas del hongo. A. oryzae recombinante, modificado con dos péptidos diferentes (MP2 y EPIP) inhibe la formación de ooquistes de P. berghei en el intestino medio de An. adulto. stephensi y podrían usarse como portadores de moléculas efectoras adicionales que pueden funcionar como agentes antiparasitarios. Es importante destacar que la paratransgénesis es compatible con las herramientas actuales de control de mosquitos e incluso con mosquitos genéticamente modificados.

A. oryzae, que se encuentra naturalmente en el suelo y el medio ambiente, podría utilizarse en enfoques integrados de control de vectores, y este método está demostrando ser un enfoque respetuoso con el medio ambiente para controlar las larvas en los propios hábitats naturales. Los biopesticidas fúngicos ya están aprobados para uso agrícola en varios países africanos junto con los insecticidas químicos82. La estrecha gama de huéspedes de los hongos transgénicos limita los peligros potenciales para los insectos no objetivo. Para las larvas de Anopheles en un hábitat acuático, el impacto sobre insectos beneficiosos como las abejas sería poco probable. Hay datos limitados sobre los efectos de los biopesticidas en especies no objetivo en los criaderos de mosquitos. Los extractos de Aspergillus terreus afectaron el comportamiento de natación de Artemia, pero estos extractos fueron neurotóxicos para los mosquitos y Artemia no simpatría con las larvas de mosquito83. De manera similar, los extractos de Asperillus flavus afectaron al mosquito depredador, Toxorhynchites splendens, pero en concentraciones más altas que las que afectaron al objetivo, Ae. aegypti84. Los estudios sobre los efectos de los hongos entomopatógenos vivos en condiciones acuáticas son limitados, lo que representa un vacío importante en este campo de investigación, pero la combinación de hongos y mosquitos depredadores puede dar un resultado de control más óptimo85. Dada la diversidad y la naturaleza efímera de los sitios de reproducción de Anopheles, caracterizar la mayoría de los sitios de reproducción sería innecesario y tampoco práctico en un programa de control86, por lo que cualquier enfoque con bioplaguicidas deberá considerar la efectividad en diferentes condiciones ambientales. Si bien los resultados de un estudio de caso único deben tratarse con la debida cautela para evitar una interpretación excesiva, creemos que hemos demostrado que los estudios experimentales sobre el papel de los hongos en las comunidades naturales de insectos son factibles y tienen el potencial de generar conocimientos prometedores.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado y sus archivos de información complementarios.

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Esta investigación fue financiada por el Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación Científica y Tecnológica 1001-TÜBİTAK, subvención número 218S724 y el APC fue financiado por el Consejo Turco de Investigación Científica y Tecnológica y el proyecto de investigación científica (BAP) de la Universidad Bezmialem Vakıf (Proyecto No.: 20211004).

Instituto Beykoz de Ciencias de la Vida y Biotecnología, Universidad Bezmialem Vakif, 34820, Estambul, Turquía

Leila Kianifard, Ab. Matteen Rafiqi, Osman Akcakir, Ahmed SI Aly y Serdar Uysal

Escuela de Ciencias e Ingeniería, Universidad Al Akhawayn, Ifrane, 53000, Marruecos

Ahmed SI Aly

Sanaria Inc., 9800 Medical Center Dr., Suite A209, Rockville, MD, 20850, EE. UU.

Peter F. Billingsley

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OA y SU concibieron la idea original y AA desarrolló la teoría. LK y AMR llevaron a cabo el experimento. LK realizó los cálculos y AMR y PFB verificaron los métodos analíticos. LK, AMR, SU, AA y PFB contribuyeron a la interpretación de los resultados. LK, AMR y PFB realizaron los cálculos analíticos. LK escribió el manuscrito con el apoyo de OA y PFBAA y AMR ayudó a supervisar el proyecto. Todos los autores brindaron comentarios críticos y ayudaron a dar forma a la investigación, el análisis y el manuscrito.

Correspondencia a Serdar Uysal.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Kianifard, L., Rafiqi, AM, Akcakir, O. et al. Un hongo recombinante Aspergillus oryzae transmitido de larvas a adultos de mosquitos Anopheles stephensi inhibe el desarrollo de ooquistes del parásito de la malaria. Representante científico 13, 12177 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-38654-0

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Recibido: 13 de febrero de 2023

Aceptado: 12 de julio de 2023

Publicado: 27 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-38654-0

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