Efectos comparativos de los moduladores de CFTR sobre los perfiles fagocíticos, metabólicos e inflamatorios de macrófagos con y sin FQ

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 11995 (2023) Citar este artículo

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La disfunción de los macrófagos se ha descrito bien en la fibrosis quística (FQ) y puede contribuir a la persistencia bacteriana en el pulmón. Si la disfunción de los macrófagos de la FQ está relacionada directamente con el regulador de conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR) en los macrófagos o una consecuencia indirecta de la inflamación crónica y la mucostasis es un tema de debate actual. Los moduladores de CFTR que restauran la función de CFTR en las células epiteliales mejoran las respuestas inflamatorias globales de los monocitos de la FQ, pero sus efectos directos sobre los macrófagos no se conocen tan bien. Para abordar esta brecha de conocimiento, medimos la fagocitosis, el metabolismo y la expresión de citoquinas en respuesta a un patógeno clásico de la FQ, Pseudomonas aeruginosa en macrófagos derivados de monocitos (MDM) aislados de sujetos homocigotos F508del de FQ y controles sin FQ. Inesperadamente, encontramos que los moduladores de CFTR mejoraron la fagocitosis tanto en cohortes con FQ como en cohortes sin FQ. Los moduladores triples de CFTR también inhibieron la función mitocondrial de MDM, lo que coincide con la activación de MDM. A diferencia de los estudios en humanos en los que los moduladores de CFTR disminuyeron los niveles séricos de citocinas inflamatorias, los moduladores no alteraron la secreción de citocinas en nuestro sistema. Por lo tanto, nuestros estudios sugieren que los efectos metabólicos inducidos por el modulador pueden promover la eliminación bacteriana en macrófagos derivados de monocitos tanto con FQ como sin FQ.

La fibrosis quística (FQ) es un trastorno genético multisistémico en el que la enfermedad respiratoria desempeña un papel destacado en la morbilidad y la mortalidad1. Las personas con FQ (pwCF) están plagadas de infecciones pulmonares crónicas, que a menudo comienzan con patógenos estereotipados Staphylococcus aureus y Haemophilus influenzae, seguidas frecuentemente por una transición a la colonización con Pseudomonas aeruginosa (Pa), otras bacterias y hongos a medida que las pwCF envejecen y la enfermedad pulmonar progresa2. Clásicamente se entiende que este proceso surge de una cascada que comienza con una falta de secreción de cloruro mediada por CFTR que conduce a una hiperviscosidad del moco resultante, falla de la escalera mecánica mucociliar y formación de biopelículas, todo lo cual culmina en una falta de inmunidad esterilizante dentro del pulmón1.

Este modelo ha sido cuestionado en cierta medida por la experiencia del mundo real de personas con FQ que reciben una terapia moduladora de CFTR altamente eficaz. Para aquellos con al menos una copia de la mutación CFTR más común, una deleción en la fenilalanina en la posición 508 (F508del), los moduladores pueden restaurar la función CFTR a niveles cercanos a los de personas sin mutaciones CFTR3,4. Si bien los moduladores pueden causar una mejora importante en la función pulmonar, el aclaramiento pulmonar y una disminución en la producción de esputo y la cantidad bacteriana, desafortunadamente la colonización bacteriana se ha mantenido en la mayoría de los sujetos y tiene el potencial de impulsar una mayor progresión de la enfermedad pulmonar5,6,7. Esto ha puesto de relieve la necesidad de comprender si puede haber defectos inmunitarios intrínsecos en la FQ8,9,10,11,12. Los macrófagos actúan como guardianes del sistema inmunológico en el pulmón y, por lo tanto, investigar su respuesta a los moduladores de CFTR es fundamental para comprender la inmunidad pulmonar de la FQ de manera más amplia13.

Investigaciones anteriores sobre monocitos séricos de personas con FQ han analizado sus perfiles antes y después del inicio de una terapia moduladora altamente efectiva, tanto en aquellos con mutaciones de activación que comenzaron con ivacaftor como en aquellos con mutaciones F508del que comenzaron con elexacaftor/tezacaftor/ivacaftor (ETI). terapia triple combinada6,14,15,16,17. Estos estudios han demostrado disminuciones en la producción de citoquinas inflamatorias por parte de los monocitos de la FQ; sin embargo, no pueden diferenciar entre los efectos directos de los moduladores sobre los monocitos versus los efectos indirectos secundarios a la mejora de la función mucociliar y la disminución de la carga bacteriana. Se demostró que lumacaftor, el corrector de CFTR de generación anterior, mejoraba la fagocitosis y la destrucción de los macrófagos de la FQ, mientras que el potenciador de CFTR, ivacaftor, disminuía la secreción de citocinas inflamatorias18. Una publicación más reciente ha demostrado los efectos de la última generación de moduladores triples de CFTR in vitro en macrófagos aislados derivados de monocitos (MDM)19. Descubrieron que, si bien la ETI aumentaba la eliminación bacteriana mediante CF MDM, no afectaba la secreción de citoquinas en respuesta a la infección por el complejo Burkholderia cepacia. Investigamos los efectos de ETI versus la combinación de generación anterior tezacaftor/ivacaftor (TI) sobre la absorción directa de Pa por MDM con y sin FQ, así como los efectos de los moduladores sobre el metabolismo de MDM y la producción de citocinas. Nuestros resultados respaldan un modelo mediante el cual ETI activa los macrófagos y mejora la eliminación de bacterias, en lugar de desplazarlos hacia un fenotipo menos inflamatorio como se observa con combinaciones de moduladores anteriores.

Algunos de estos resultados se han presentado previamente en forma de resúmenes20,21,22.

La Junta de Revisión Institucional de Dartmouth Health aprobó este estudio (protocolo IRB n.° 22781) y todos los métodos se realizaron de conformidad con las pautas y regulaciones pertinentes. Los sujetos fueron reclutados de nuestra población clínica de FQ si tenían entre 18 y 65 años, eran homocigotos F508del, al inicio clínico sin síntomas de exacerbación y tenían niveles de hemoglobina normales. Los sujetos de control sin FQ fueron reclutados mediante folletos aprobados por el IRB; Se excluyeron los fumadores o aquellos con enfermedades respiratorias o uso de medicamentos pulmonares. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los sujetos y se registró en una base de datos segura. Luego, nuestra enfermera de investigación realizó una flebotomía (se aislaron 100 ml de sangre completa) para el aislamiento de monocitos y la llevaron directamente al laboratorio para su procesamiento posterior. La información clínica sobre los sujetos está disponible en la Tabla 1.

Los MDM se generaron según protocolos publicados previamente23,24. Brevemente, se aislaron monocitos de sangre periférica mediante separación en gradiente de Ficoll seguido de procesamiento con un kit de aislamiento de pan-monocitos (Miltenyi Biotech) de acuerdo con los protocolos del fabricante que produce una mezcla de monocitos clásicos, no clásicos e intermedios. Se cuantificaron y se sembraron directamente en placas de cultivos de tejidos según el ensayo previsto. Los MDM se generaron mediante tratamiento con 100 ng/ml de M-CSF durante 7 días en RPMI/10 % FCS con gentamicina. El medio se cambió cada 2 a 3 días hasta que las células estuvieron listas para su uso.

Los MDM se generaron a 2,5 x 105/ml en placas de 24 pocillos. Los MDM se colocaron en RPMI/FBS al 10% con gentamicina sin M-CSF y se agregaron moduladores de CFTR durante 48 h. Si bien no existen concentraciones estándar de moduladores de CFTR para uso in vitro, estimamos concentraciones efectivas en base a datos publicados previamente y niveles séricos de personas con FQ. Se utilizó elexacaftor a 6 µM, tezacaftor a 3 µM e ivacaftor a 30 nM. La concentración de elexacaftor se determinó basándose en datos publicados sobre concentraciones séricas en sujetos con FQ25, datos de modelos farmacocinéticos26 y prospectos de ETI tras la aprobación de la FDA27. La concentración máxima de elexacaftor en estos sujetos fue de 9,2 µg/ml, que corresponde a 15,4 µM. Las concentraciones in vitro utilizadas en células epiteliales para el artículo que provocó por primera vez la aprobación clínica de ETI fueron de 2 a 3 µM28. Por lo tanto, estamos dentro del rango de concentración que previamente demostró ser eficaz y seguro in vivo.

De manera similar, la concentración máxima de tezacaftor in vivo fue de 7,7 µg/ml o 14,8 µM27. Un análisis independiente encontró una concentración sérica media de 5,1 µg/ml o 9,8 µM. Otros estudios in vitro han utilizado entre 5 y 18 µM17,19.

Elegimos una concentración más baja de ivacaftor (30 nM) ya que trabajos anteriores han demostrado que puede tener efectos nocivos sobre el rescate de la fagocitosis en concentraciones más altas18. La concentración máxima que figura en el prospecto clínico fue de 1,2 µg/ml (2,3 µM) y se une > 97 % a las proteínas plasmáticas in vivo29. Se ha demostrado que ivacaftor es activo sobre CFTR in vitro en concentraciones tan bajas como 10 nM30 y se ha demostrado que concentraciones más altas tienen un efecto desestabilizador sobre F508del CFTR31. Finalmente, los experimentos preliminares que realizamos antes de la disponibilidad de elexacaftor demostraron que ivacaftor 30 nM era suficiente para tener un efecto aditivo en la mejora de la fagocitosis cuando se usaba en combinación con tezacaftor.

Luego se lavaron los MDM con PBS y el medio se reemplazó con un medio idéntico sin antibióticos. Se agregaron nuevos moduladores CFTR con todos los intercambios de medios.

Las cepas de Pa PA14 o DH1137 (un aislado clínico de FQ no mucoide) se cultivaron durante la noche en LB a 37 °C en una incubadora con agitación con un tubo con tapa suelta en un ángulo de 45 ° para permitir el intercambio de gases. Elegimos tanto una cepa de laboratorio estándar que se usa ampliamente en la literatura como un aislado clínico para garantizar que los efectos también se observaran en una cepa de FQ. Luego, los cultivos se subcultivaron 1:10 en LB durante 60 minutos, se centrifugaron a 8000 xg durante 2 minutos, se lavaron dos veces y luego se resuspendieron en medio de ensayo sin antibióticos y la densidad bacteriana se determinó mediante espectrofotometría a 600 nm. Se determinó empíricamente que la DO600 de 1,0 representa 109 bacterias/ml de medio. Se agregaron Pa a MDM con una multiplicidad de infección (MOI) de 10 bacterias por macrófago. Las placas celulares se incubaron a 37 ° C durante 20 minutos, luego las células se lavaron con PBS y se añadió medio MDM con 10 x gentamicina durante 15 minutos. Luego, las células se lavaron dos veces con PBS a 4 °C seguido de lisis con 250 µl de Triton X-100 al 0,1 %. Luego se sembraron 30 µl de lisado durante la noche en placas de agar LB para la determinación de UFC. Se contaron las colonias al día siguiente y se calcularon las bacterias por 106 macrófagos. Luego se transformaron logarítmicamente las UFC medias para cada sujeto y condición. La MOI se confirmó empíricamente a partir de las soluciones bacterianas madre para cada ensayo mediante siembra en placas de agar LB.

Los monocitos se sembraron inicialmente en una placa de 96 pocillos Seahorse a 50.000 células por pocillo y se diferenciaron en MDM directamente en los pocillos durante 7 días como se indicó anteriormente. En ese momento, se eliminó el medio de diferenciación y se agregaron moduladores de CFTR durante 48 h. El medio acondicionado con Pa se preparó de antemano cultivando bacterias durante la noche en medio de ensayo Seahorse mitostress, normalizando los cultivos a una DO600 de 0,500, centrifugando para sedimentar las bacterias y luego pasando el sobrenadante a través de un filtro de 0,22 µm. Este se definió como medio 100% condicionado. Luego se congelaron alícuotas a -20 °C hasta su uso.

El día del ensayo, el medio de cultivo celular se cambió por medio de ensayo de estrés mitológico según las instrucciones del fabricante. Se realizó un ensayo de mitoestrés con inyección aguda en una plataforma Agilent Seahorse XFe96, con 20 µl de medio acondicionado de Pa en el puerto de inyección A (concentración final del 10 % después de la inyección); se incluyó medio de mitoestrés simple para los pocillos de control. Se colocaron oligomicina, FCCP y rotenona/antimicina A en los puertos BD respectivamente según el protocolo de mitoestrés. Se realizaron de 4 a 8 réplicas técnicas por condición. Los parámetros que incluyen la respuesta a la inyección, la respiración máxima y otros se calcularon según las instrucciones del fabricante.

Dos ml de cultivos de LB durante la noche cultivados a 37 °C con agitación de las cepas de Pa indicadas se normalizaron a una DO600 de 0,01 en los medios indicados, luego se agregaron moduladores de CFTR o un volumen equivalente de DMSO. Se colocaron 100 µl de cada cultivo en una placa de 96 pocillos y se midió la DO600 cada hora mediante un lector de placas de incubación a 37 °C.

PA14 de tipo salvaje y su derivado mutante flgK32 se cultivaron durante la noche y luego se normalizaron a una DO600 de 0,100. Se trataron alícuotas de cada cepa con DMSO o elexacaftor, tezacaftor e ivacaftor (ETI) y luego se colocaron inmediatamente en portaobjetos de vidrio y se añadió Tween-20 al 0,01 % para reducir la unión a la superficie. Las imágenes se adquirieron durante 1 minuto desde un objetivo de inmersión en aceite de 63 × en un microscopio Zeiss usando un iPhone X. Las imágenes en cámara lenta se transfirieron a ImageJ y se crearon series de 10 imágenes con 20 fotogramas en cámara lenta entre cada imagen de la serie. El seguimiento manual de partículas se realizó en 18 a 20 bacterias individuales en cada serie. Cada punto de datos representa la distancia total (unidades arbitrarias) recorrida por cada bacteria a lo largo de la serie con líneas en la media.

Se generaron MDM a 5 x 105/pocillo en placas de 24 pocillos y luego se trataron con moduladores CFTR durante 48 h como se indicó anteriormente. Se prepararon cultivos nocturnos de DH1137 como en los ensayos de fagocitosis en la mañana del experimento. Los medios se retiraron de MDM y se reemplazaron con medios sin antibióticos con moduladores CFTR nuevos, luego se agregó DH1137 a una MOI de 10 durante 2 h. Los sobrenadantes se retiraron de los pocillos, se centrifugaron durante 10 minutos a velocidad máxima en una microcentrífuga de mesa a 4 °C y luego se congelaron a -20 °C hasta su uso. El ensayo de citoquinas 48-plex humanas Millipore fue realizado por el Centro central de monitoreo inmunológico de Dartmouth.

Los análisis se realizaron en R. Se utilizaron ANOVA o modelos lineales de efectos mixtos (donde el donante se especificó como un efecto aleatorio) para el análisis como se indica en las leyendas de las figuras. P <0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Primero examinamos los efectos de los moduladores de CFTR en una de las funciones prototípicas de los macrófagos, la fagocitosis. Utilizamos dos cepas de Pa diferentes para estos ensayos, una cepa de laboratorio clásica (PA14) y una cepa clínica aislada de pulmones con FQ (DH1137). Analizamos todos los resultados mediante modelos lineales de efectos mixtos que nos permitieron tener en cuenta la variabilidad del sujeto y de la cepa Pa mientras determinamos los efectos de los moduladores globalmente dentro de los ensayos. Cuando se trató con una combinación TI de doble modulador de CFTR, CF MDM demostró un aumento constante en la eficiencia de la fagocitosis (p <0,001 en comparación con DMSO) (Fig. 1A). Se observaron aumentos adicionales en la fagocitosis con ETI triple modulador (p <0,0001).

La fagocitosis de MDM con y sin CF se ve aumentada por moduladores de CFTR. (A) MDM de sujetos con FQ (n = 7) fueron tratados durante 48 h con moduladores DMSO o CFTR como se indica. La fagocitosis se midió mediante un ensayo de protección con gentamicina. Cada línea que conecta puntos representa un solo sujeto, las barras representan medios de experimentos separados. p < 0,001 para DMSO versus TI y p < 0,0001 para DMSO versus ETI. No hubo diferencias significativas entre las cepas bacterianas ni interacciones entre la cepa y los moduladores. (B) Se llevaron a cabo experimentos idénticos con donantes sin FQ (n = 9). p < 0,01 para DMSO versus TI, p < 0,0001 para DMSO versus ETI. Todas las estadísticas mediante modelo lineal de efectos mixtos.

Para investigar la especificidad de los efectos moduladores, repetimos estos estudios utilizando MDM sin CF (Fig. 1B). Si bien parecía haber más variabilidad entre los sujetos, la respuesta a TI siguió siendo estadísticamente significativa (p <0,01) y, de manera similar a CF MDM, ETI aumentó aún más la fagocitosis en comparación con las células tratadas con DMSO (p <0,0001).

Preguntamos dentro de nuestro modelo si había diferencias iniciales entre la MDM con FQ y la MDM sin FQ con eficiencia de fagocitosis y no determinamos ningún efecto obvio; sin embargo, dada la naturaleza de los ensayos que se llevan a cabo en días diferentes, las comparaciones dentro de los ensayos probablemente sean más válidas que entre ensayos. Tampoco vimos interacciones significativas entre la cohorte de sujetos (FQ versus no FQ) y la respuesta a los moduladores de CFTR, lo que sugiere que los efectos del modulador pueden haber sido independientes de la mutación de CFTR.

No hubo interacciones significativas entre las cepas de Pa en sus respuestas a los moduladores.

A continuación, exploramos posibles factores mecanicistas que contribuyen a la eficiencia de la fagocitosis. El estado metabólico de los macrófagos afecta su función y viceversa: los macrófagos activados proinflamatorios experimentan un cambio hacia un aumento de la glucólisis y una disminución de la fosforilación oxidativa a pesar de la presencia de oxígeno adecuado33,34,35,36; Este fenómeno también se conoce como glucólisis aeróbica o metabolismo de Warburg. Por lo tanto, investigamos el estado metabólico de la MDM con FQ y sin FQ en respuesta al tratamiento con modulador de CFTR y los factores secretados de PA14 utilizando un ensayo de flujo extracelular Seahorse. Elegimos utilizar un medio acondicionado libre de bacterias para eliminar los efectos metabólicos de las bacterias vivas que confunden el ensayo.

Encontramos que ETI, pero no TI, inhibió el consumo inicial de oxígeno (un indicador de la actividad mitocondrial) tanto en MDM con FQ como sin FQ (p = 0,001 según el modelo lineal de efectos mixtos, Fig. 2A, B). No detectamos ningún aumento compensatorio de la glucólisis basal (fig. 2C). En consecuencia, la relación entre actividad mitocondrial y glucólisis disminuyó constantemente en ambas cohortes en presencia de ETI pero no de TI (Fig. 2D).

Los moduladores triples de CFTR inhiben la función mitocondrial de MDM. La MDM con FQ y sin FQ se trató durante 48 h in vitro con moduladores de CFTR como en experimentos anteriores. Luego se realizó un ensayo de mitoestrés en Seahorse. (A) Ensayo de mitoestrés representativo con MDM sin CF pretratado con DMSO, TI o ETI. (B) Respiración basal de todos los sujetos individuales MDM probados con y sin moduladores. Cada punto con líneas de conexión representa la media de réplicas técnicas de un sujeto individual (CF n = 10, no CF n = 11). Las barras representan medias de todos los sujetos dentro del grupo. (C, D) Glucólisis basal y OCR/ECAR de los mismos ensayos que (B).

También preguntamos la respuesta al medio condicionado con Pa (CM), en presencia o ausencia de moduladores CFTR. Pa CM causó inhibición de la actividad mitocondrial, así como un aumento agudo en la glucólisis (p <0,0001 para ambas comparaciones; Fig. 3A-C, líneas azules y Fig. 3D, E), sin embargo, estos efectos fueron anulados en presencia de ETI. donde la función mitocondrial basal era baja, lo que sugiere un efecto techo.

El medio acondicionado Pa inhibe la función mitocondrial de MDM. Al mismo tiempo que los ensayos de la Fig. 2, la inyección aguda de medio condicionado con Pa se comparó con los pocillos de control en un ensayo de mitoestrés Seahorse. (A – C) Ensayo de mitoestrés representativo con MDM sin CF pretratado con DMSO, TI o ETI. (D – F) Parámetros calculados según lo indicado en función del ensayo de mitoestrés. Cada punto con líneas de conexión representa la media de réplicas técnicas de un sujeto individual (CF n = 10, no CF n = 11). Las barras representan medias de todos los sujetos dentro del grupo.

Hubo disminuciones correspondientes en la respiración máxima (p <0,0001 para Pa CM y ETI en relación con los controles; Fig. 3F), respiración ligada a ATP (p <0,001 para Pa CM, p <0,0001 para ETI, Fig. 3G) y capacidad respiratoria adicional (p <0,0001 para Pa CM, p <0,001 para ETI; figura complementaria 1A).

No hubo efectos estadísticamente significativos en otros parámetros medidos, incluida la respiración no mitocondrial y la fuga de protones (Figuras complementarias 1B, C, respectivamente).

Dados los efectos sobre la función mitocondrial, confirmamos que los moduladores no inducían la muerte celular (Figura complementaria 2); No encontramos evidencia de liberación de LDH en presencia de moduladores.

Es posible que algunos de los efectos observados sobre la fagocitosis con el ensayo de protección con gentamicina puedan explicarse por efectos fuera del objetivo de los moduladores de CFTR sobre Pa in vitro. Por lo tanto, probamos si los moduladores de CFTR alteraron el crecimiento de Pa en las condiciones de nuestro ensayo de fagocitosis y no encontramos ningún impacto en varios medios, incluidos LB, RPMI o medios MDM sin antibióticos (Fig. 4A-C). Hubo una señal hacia una disminución de la densidad bacteriana en la fase estacionaria > 12 h en el ensayo; sin embargo, no se observaron diferencias en el período de tiempo (generalmente menos de 1 h en total) de los ensayos de fagocitosis. La motilidad de Pa es necesaria para una fagocitosis eficiente37; sin embargo, los moduladores de CFTR no afectaron apreciablemente la motilidad de PA14, con un mutante flgK que carece de flagelos y sirve como control no móvil para comparación (Fig. 4D).

Los moduladores de CFTR no tienen ningún efecto apreciable sobre el crecimiento o la motilidad del Pa. (A – C) El crecimiento de PA14 se midió a 37 °C en un lector de placas en diversos medios con o sin moduladores CFTR añadidos. Los puntos representan las medias y SEM de tres experimentos individuales; de cada punto de datos se restó la DO600 de los medios solos sin bacterias. (D) La motilidad de las cepas indicadas se midió en un portaobjetos de vidrio mediante seguimiento manual de partículas en presencia o ausencia de ETI. Se utilizaron mutantes flagelares FlgK como control. Cada punto de datos representa la distancia total (unidades arbitrarias) recorrida por cada bacteria a lo largo de la serie con líneas en la media.

Se ha informado que los moduladores tempranos (lumacaftor/ivacaftor) mitigan un estado hiperinflamatorio basal de CF MDM18; sin embargo, no se han estudiado los efectos de ETI en CF MDM en presencia de Pa. Analizamos la producción de citocinas por MDM después de la infección con DH1137 durante 2 h mediante un ensayo múltiple. En ausencia de infección, la secreción de citoquinas fue generalmente baja sin efectos discernibles de TI y ETI. Tras la adición de Pa, hubo una inducción sólida de muchas citocinas tanto en la MDM con FQ (Fig. 5A) como en la MDM sin FQ (Fig. 5B). Los moduladores tuvieron un efecto mínimo sobre la producción de citocinas y la ETI provocó solo aumentos no estadísticamente significativos en las citocinas inflamatorias como TNFα, IL-1β, IL-8, IL-10, IL-18 y MCP-1 (Figura complementaria 3). No hubo indicios de una disminución de los marcadores inflamatorios con TI o ETI como se ha informado con otras combinaciones de moduladores.

La sólida inducción de citoquinas inflamatorias por la cepa clínica Pa DH1137 se ve mínimamente afectada por los moduladores de CFTR. (A) CF MDM (n = 7) se trataron durante 48 h in vitro con moduladores de CFTR, luego se intercambió el medio y se infectó un subconjunto con DH1137 a una MOI de 10 durante 2 h. Los sobrenadantes se centrifugaron y recogieron. La multiplexación de citoquinas se realizó en muestras agregadas con 2 a 4 réplicas técnicas por punto. Las medias de cada sujeto se transformaron logarítmicamente y se representaron gráficamente como se indica. (B) Se utilizaron MDM sin FQ (n = 5) en experimentos por lo demás idénticos a (A).

Se sabe que los moduladores de CFTR aumentan la fagocitosis por parte de los macrófagos de la FQ18,19,38,39, y se ha demostrado que el inicio de moduladores de CFTR en personas con FQ disminuye los perfiles inflamatorios de los monocitos5,14,15,17,40. Sin embargo, estos estudios no han abordado los efectos de los moduladores más nuevos y altamente eficaces directamente sobre la función de los macrófagos, que probablemente sea distinta de los efectos sobre los monocitos séricos cuando los moduladores se inician in vivo. De hecho, nuestros estudios muestran que, si bien la ETI aumenta la fagocitosis directamente en macrófagos aislados, estos efectos parecen ser algo independientes de la mutación CFTR, ya que la MDM sin CF también respondió (Fig. 1). Esto concuerda con un informe publicado recientemente sobre los efectos de la ETI en la fagocitosis de Burkholderia en MDM aislado por Zhang y colegas, donde también observaron efectos en MDM sin FQ19. Curiosamente, los autores de ese estudio encontraron efectos variables de la ETI en la eliminación de Staphylococcus aureus, Pa y Burkholderia, donde la MDM sin FQ no respondió y la MDM con FQ sí. Tampoco encontraron ningún impacto de la ETI en la producción de citocinas inflamatorias en respuesta a Burkholderia, similar a nuestros resultados con Pa (Fig. 5) y en contraste con los estudios que muestran una disminución de citocinas con lumacaftor/ivacaftor18 y en huéspedes completos5,14,15.

El mecanismo subyacente a los efectos de los moduladores de CFTR en la fagocitosis de MDM sin FQ no está del todo claro y se consideraron efectos fuera del objetivo. No pareció haber ningún efecto importante de los moduladores de CFTR sobre el crecimiento o la motilidad de Pa (Fig. 4), lo que explicaría las diferencias en la eficiencia fagocítica. Es importante señalar que estos ensayos fueron diseñados para abordar la cuestión de los efectos de los moduladores en nuestro sistema in vitro y no abordan la cuestión separada de si los moduladores impactan directamente la Pa en las vías respiratorias, donde las concentraciones del modulador no se conocen pero probablemente sean más bajas. .

Finalmente, investigamos los efectos metabólicos de los moduladores de CFTR y nuevamente descubrimos consecuencias imprevistas. Se ha informado que los macrófagos de ratones con mutación CFTR F508del/F508del tienen una función mitocondrial deteriorada en comparación con sus homólogos WT33. Por el contrario, Lara-Reyna et al.41 encontraron que los monocitos con FQ y MDM tienen aumentos tanto en la función mitocondrial como en la actividad glucolítica en relación con los no FQ cuando se estimulan con IFNγ y LPS, un efecto atribuido a la activación de la respuesta de la proteína desplegada. Hasta donde sabemos, este es el primer estudio del metabolismo primario de los macrófagos de la FQ humana y la respuesta a los moduladores de CFTR. A diferencia de otros sistemas experimentales que utilizan diferentes tipos de células42,43,44, en MDM no encontramos diferencias consistentes en la función mitocondrial basal o máxima entre FQ y no FQ. Sin embargo, encontramos una inhibición fuerte y reproducible de la respiración mitocondrial mediante moduladores de CFTR triples, pero no dobles (Fig. 2). Presumiblemente, esto se debe a la actividad directa del elexacaftor, pero el mecanismo de inhibición no está claro actualmente. Dado que disminuyó la respiración máxima en presencia del FCCP desacoplador de protones (Fig. 3), es posible que disminuya directamente el potencial de membrana mitocondrial. En particular, los efectos fueron similares en macrófagos con y sin FQ. Dado que los moduladores de CFTR son de interés en otras enfermedades respiratorias como la enfermedad pulmonar obstructiva crónica45,46,47, esto puede afectar la comprensión de los efectos de los moduladores fuera de la FQ específicamente. Se están realizando estudios en nuestro laboratorio para dilucidar aún más el mecanismo de su inhibición mitocondrial. Curiosamente, Riquelme et al. describieron la colocalización de la señal CFTR con mitocondrias en líneas celulares epiteliales de las vías respiratorias48, así como perfiles de actividad mitocondrial alterados en PBMC de sujetos con FQ y en ratones mutantes CFTR. Estos efectos incluyeron niveles elevados de superóxido y succinato. La transfección CFTR pareció mejorar estos fenotipos; sin embargo, no se probaron los efectos de los moduladores. La glucólisis aeróbica también se ha descrito en los neutrófilos de la FQ de una manera que se resuelve después del trasplante de pulmón, argumentando que el efecto es secundario a la inflamación sistémica más que al CFTR dentro de los propios neutrófilos49.

Además, los factores secretados por Pa inhibieron la función mitocondrial (Fig. 3), un efecto que se ha descrito previamente en diferentes tipos de células, incluido el hígado de ratón50, los fibroblastos51, las células epiteliales52 y las líneas celulares cancerosas53.

La glucólisis aeróbica en macrófagos se asocia clásicamente con un fenotipo proinflamatorio, incluido un aumento de la fagocitosis34,54, lo que es potencialmente compatible con un modelo en el que los moduladores triples del CFTR y el Pa activan los macrófagos y, por lo tanto, mejoran la fagocitosis; sin embargo, esto no explica los efectos de la TI que tuvo un fenotipo de fagocitosis intermedio pero sin efecto sobre el metabolismo (Figs. 1 y 2). En última instancia, es probable que haya muchos factores en juego que resulten en el criterio de valoración de la fagocitosis.

Un punto fuerte de nuestro trabajo es la comparación directa entre los efectos del vehículo, TI y ETI en paralelo en células de los mismos sujetos. Esto nos permite descubrir efectos específicos de los moduladores más que los estudios que investigan la función celular antes y después del inicio de los moduladores. La ETI causa numerosos efectos, incluida la disminución de la acumulación de moco y la posterior caída de la carga bacteriana, que pueden tener efectos indirectos posteriores sobre la función de los monocitos/macrófagos, disminuyendo la inflamación general dentro del huésped y, por lo tanto, limitando la capacidad de sacar conclusiones sobre los efectos directos de los moduladores sobre las células inmunes. Por lo tanto, nuestro diseño experimental proporciona un enfoque complementario a los estudios en humanos previos y posteriores a la ETI, lo que permite interrogar los efectos de la ETI con una resolución más fina.

Las limitaciones de este trabajo incluyen que todos los voluntarios con FQ para este estudio estaban tomando ETI al inicio del estudio, lo que puede tener efectos duraderos en la biología de los monocitos, incluida la modificación epigenética13. Sin embargo, en nuestro sistema, los monocitos se cultivan durante 7 días durante el proceso de diferenciación de macrófagos in vitro antes de volver a agregar los moduladores de CFTR, lo que da tiempo para eliminar los fármacos. Otros han observado la desaparición de los efectos moduladores en monocitos después de 36 h40. Además, la investigación paralela de DMSO versus células tratadas con moduladores aboga por efectos directos de los propios moduladores en lugar de efectos de arrastre del tratamiento con moduladores in vivo. Además, los efectos en MDM sin FQ que no tienen antecedentes de exposición previa a moduladores proporcionan evidencia adicional que respalda sus efectos a corto plazo. Nuestro sistema ex vivo para la investigación de la función de los macrófagos ciertamente no es completamente indicativo de las condiciones in vivo donde hay muchas más interacciones durante un período prolongado, pero permite interrogar esas interacciones a un nivel más fino que puede informar la comprensión de las células inmunes y las bacterias. biología.

Además, si bien los MDM se obtienen y estudian más fácilmente que los macrófagos pulmonares aislados mediante lavado broncoalveolar, presentan diferencias importantes. Se están realizando investigaciones en nuestro laboratorio para discernir si los efectos encontrados aquí se replican en los macrófagos pulmonares primarios. Finalmente, se desconocen las concentraciones de moduladores de CFTR en el líquido de revestimiento epitelial dentro de los alvéolos. Se han informado concentraciones de ivacaftor en el esputo en sujetos individuales55,56 y parecen caer en el rango de 10 a 100 veces más bajas que las concentraciones séricas. No conocemos ningún estudio que haya informado directamente la concentración en el lavado broncoalveolar o en el líquido del revestimiento epitelial en sujetos humanos. Los macrófagos pulmonares existen en un continuo desde los monocitos infiltrantes hasta los macrófagos alveolares diferenciados57, por lo que probablemente estén expuestos inicialmente a concentraciones séricas de moduladores, seguidas de las concentraciones dentro del líquido del revestimiento epitelial. Estamos planeando estudios futuros para discernir los efectos de los moduladores en varias dosis sobre la función de los macrófagos, así como los efectos de los moduladores individuales no utilizados en combinación.

En resumen, hemos demostrado que los moduladores de CFTR impactan positivamente la fagocitosis primaria de macrófagos humanos de una manera sorprendentemente independiente de la mutación de CFTR, que se asoció con la inhibición de la función mitocondrial y sin alterar sustancialmente la secreción de citocinas. Estos estudios, junto con estudios futuros sobre macrófagos pulmonares primarios que exploran respuestas funcionales y transcripcionales a moduladores, ayudarán a dilucidar los mecanismos de fagocitosis alterada en la FQ, con el objetivo de mejorar el control de patógenos y disminuir la carga bacteriana en el pulmón de la FQ.

Los datos primarios utilizados para generar las figuras de este manuscrito están disponibles previa solicitud a DSA.

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Sección de Medicina Pulmonar y de Cuidados Intensivos, Centro Médico Dartmouth-Hitchcock, Lebanon, NH, EE. UU.

Daniel S. Aridgides, Diane L. Mellinger, Lorraine L. Gwilt y Alix Ashare

Departamento de Microbiología e Inmunología, Dartmouth College, Geisel School of Medicine, Hanover, NH, EE. UU.

Thomas H. Hampton, Dallas L. Mould, Deborah A. Hogan y Alix Ashare

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Correspondencia a Daniel S. Aridgides.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Aridgides, DS, Mellinger, DL, Gwilt, LL et al. Efectos comparativos de los moduladores de CFTR sobre los perfiles fagocíticos, metabólicos e inflamatorios de macrófagos con y sin FQ. Representante científico 13, 11995 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-38300-9

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Recibido: 14 de abril de 2023

Aceptado: 06 de julio de 2023

Publicado: 25 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-38300-9

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