Desarrollo del hígado de Plasmodium falciparum. - Productos calientes Co., Ltd de Zhejiang

Nature Communications volumen 14, número de artículo: 4631 (2023) Citar este artículo

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El desarrollo del parásito Plasmodium falciparum (Pf) en el hígado representa el paso inicial del ciclo de vida en el huésped humano después de la picadura de un mosquito infectado por Pf. Si bien es una etapa atractiva para la interrupción del ciclo de vida, la comprensión de la interacción parásito-hepatocitos es inadecuada debido a las limitaciones de los modelos in vitro existentes. Exploramos la idoneidad de los organoides de hepatocitos (HepOrgs) para el desarrollo de Pf y mostramos que estas células permitieron la invasión, diferenciación y maduración de parásitos de diferentes cepas de Pf. La secuenciación del ARN mensajero unicelular (scRNAseq) de células HepOrg infectadas con Pf ha identificado 80 transcripciones de Pf reguladas positivamente el día 5 después de la infección. Se encuentran cambios en el perfil transcripcional que involucran distintas vías metabólicas en hepatocitos con transcripciones del receptor eliminador B1 (SR-B1) altamente reguladas. Se confirma una nueva participación funcional en la maduración de los esquizontes en hepatocitos primarios frescos. Por lo tanto, HepOrgs proporciona una base sólida para un modelo in vitro versátil para las etapas hepáticas de Pf que se adapta a estudios biológicos básicos y al desarrollo clínico acelerado de nuevas herramientas para el control de la malaria.

La malaria es una de las principales enfermedades infecciosas en todo el mundo, responsable de una carga de morbilidad grande y creciente, particularmente en el África subsahariana, con 247 millones de casos y 619.000 muertes en 20211. Si bien varias especies de Plasmodium pueden afectar a los humanos, la mayor parte de la carga de morbilidad es causada por Plasmodium falciparum (PF). La malaria se contrae mediante una pequeña cantidad de parásitos Pf (esporozoitos) que infectan el hígado y que un mosquito hembra infectado inyecta en la piel del huésped humano mientras ingiere sangre. En unas pocas horas como máximo, algunos de estos esporozoitos llegan al hígado a través del torrente sanguíneo para invadir los hepatocitos. Después de un período clínicamente silencioso de siete días de replicación y diferenciación intracelular, cada esporozoito puede dar lugar a aproximadamente 10.000 parásitos hijos (merozoitos) que infectan la sangre. Estos merozoitos se liberan de los hepatocitos rotos al torrente sanguíneo, donde inician su ciclo de replicación asexual de 48 h en los glóbulos rojos circulantes, responsables de la enfermedad clínica.

Dada la baja cantidad de esporozoitos inyectados, esta fase temprana de la infección del huésped humano representa una etapa relativamente vulnerable y crítica en el ciclo de vida del parásito antes de que se generen grandes cargas de parásitos durante la malaria en etapa sanguínea. Por lo tanto, la disponibilidad de medicamentos y/o vacunas altamente eficaces dirigidas a estas etapas del parásito en el hígado sería una gran ventaja para el control y la eliminación de la malaria. Un factor importante que contribuye es la falta de comprensión de la biología básica de la interacción dinámica entre los parásitos en desarrollo en los hepatocitos invadidos. Esto se puede abordar mejor mediante el uso de una encuesta imparcial del transcriptoma/proteoma del huésped y del parásito durante un proceso de infección. Un obstáculo principal es la ausencia de cultivos representativos de células hepáticas in vitro que abarquen el desarrollo completo de Pf. Se han utilizado hepatocitos humanos primarios criopreservados, pero adolecen de una permisibilidad baja y variable, lo que proporciona material insuficiente para dicho análisis2. Alternativamente, el acceso y la disponibilidad de hepatocitos humanos primarios recién aislados son limitados. Los hepatocitos de ambas fuentes sólo pueden mantenerse en cultivo durante un número limitado de días. Finalmente, el uso de líneas celulares hepáticas, incluida HC-04, se restringe principalmente al examen de los primeros eventos de interacción parásito-hepatocitos (es decir, transversal e invasión), aunque se ha informado un desarrollo completo3.

Los organoides son estructuras tridimensionales que se derivan de células madre o tejidos primarios y recapitulan aspectos arquitectónicos y funcionales clave del órgano/tejido bajo investigación. Cuando se derivan de células madre adultas, estas estructuras in vitro pueden expandirse durante largos períodos de tiempo4. Recientemente hemos establecido un protocolo para cultivar organoides a partir de hepatocitos humanos5. Estos organoides pueden establecerse a partir de hepatocitos individuales y cultivarse durante varios meses, conservando al mismo tiempo características clave morfológicas, funcionales y de expresión genética. Los perfiles transcripcionales de los organoides se parecen a los de los hepatocitos en proliferación después de una hepatectomía parcial. Los organoides de hepatocitos humanos (HepOrgs) proliferan ampliamente después de su injerto en ratones. Hemos observado una correlación inversa entre la edad del donante y la duración de la fase de expansión exponencial. De hecho, los hepatocitos fetales producen líneas organoides que pueden expandirse indefinidamente, sin dejar de parecerse mucho a los hepatocitos primarios (HuHeps)6.

Aquí, mostramos la permisividad de Pf de una serie de HepOrgs diferenciados. Además, se ha realizado una secuencia de ARN mensajero unicelular en HepOrgs infectados y no infectados para estudiar los perfiles de transcripciones de genes regulados hacia arriba y hacia abajo tanto de Pf como de células huésped que contienen esquizontes maduros. Las transcripciones del receptor eliminador B1 (codificado por el gen SCARB1; proteína denominada SR-B1) están reguladas positivamente y posteriormente se confirma una nueva función crítica de esta proteína hepática para el desarrollo de Pf en HuHeps primarios frescos.

Se infectaron cuatro líneas fetales diferentes de HepOrg (KIFM, KK2, KK3 y KU1) con esporozoitos PfNF1757,8. Las tasas de infección se determinaron entre los días 5 a 8 después de la infección (pi) determinando el número de esquizontes positivos para PfHSP70 (Fig. 1A). Se obtuvo una tasa de infección entre 0,5 y 1% en las cuatro líneas de HepOrg, que es más baja que en HuHeps7 primario recién aislado.

Un porcentaje de células huésped (HepOrgs) con esquizontes NF175. Cada barra representa el promedio de triplicados, mientras que solo se muestran duplicados para el día 8 (n = 4 donantes; KIFM, KK2, KK3 y KU1; la barra de error es la media ± DE de tres réplicas técnicas). B El tamaño de los esquizontes NF175 en los experimentos A y B de HepOrg en comparación con HuHeps. Cada punto representa el promedio de la mediana de >100 esquizontes de tres réplicas biológicas con desviación estándar. Para HepOrg A, cada punto representa el promedio de la mediana de KK2, KIFM, KU1 donde se miden >25 esquizontes para cada línea en cada punto temporal. Para HepOrg B, cada punto representa el promedio de la mediana de KIFM, KK2, KK3 y KU1, donde se miden > 100 esquizontes para cada línea en cada punto temporal. Las áreas bajo las curvas de crecimiento de esquizontes de Huheps y, respectivamente, HepOrg A (p = 0,001; n = 4 donantes) y HepOrg B (p = 0,0002; n = 4 donantes) fueron significativamente diferentes (prueba t de Welch, bilateral). C Imágenes confocales de HepOrgs y D HuHeps en el día 5 pi que muestran la expresión de marcadores típicos de etapa hepática; de arriba a abajo: proteína circumsporozoito (CSP), proteína exportada 2 (EXP2), gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) y glutamina sintetasa humana (hGS). La barra de escala es de 25 micras. E Imágenes confocales de la proteína de superficie de merozoito 1 (PfMSP1) en esquizontes de HuHeps (arriba) y HepOrgs (abajo) en los días 7-9 pi La barra de escala es de 25 micrones. Para C, D y E, estas tinciones se han repetido en tres experimentos independientes y aquí se muestra una imagen representativa de cada combinación de tinciones. F Porcentaje promedio con desviación estándar de esquizontes positivos para PfMSP1 de HepOrg B (n = 4; KIFM, KK2, KK3, KU1) y HuHep (n = 3) evaluados >100 esquizontes por línea por punto temporal. Véase también la figura S1.

Los tamaños de los esquizontes HepOrg no fueron significativamente diferentes de los de los HuHeps primarios en dos experimentos independientes (HepOrg A y HepOrg B) en los días 3, 5 y 7 pi (Fig. 1B). Además, los esquizontes mostraron una expresión similar de marcadores típicos de la etapa hepática Pf, incluida la proteína circumsporozoíto (PfCSP), la proteína exportada 2 (PfEXP2) y la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (PfGAPDH) (Fig. 1C, D; Tabla 1). Finalmente, los esquizontes HepOrg mostraron la proteína 1 típica de la superficie del merozoito (PfMSP1) en los días 7 y 8 pi, lo que es indicativo de maduración (Fig. 1F).

A continuación, examinamos la sensibilidad de los esquizontes NF175 HepOrg a la atovacuona, que es un fármaco establecido con actividad anti-etapa hepática2 (Fig. S1). El tratamiento con atovacuona (10 nM y 50 nM) redujo la tasa de infección en más de un 75 %, lo que es similar a los resultados en HuHeps2,9. Los esquizontes restantes también mostraron una reducción de tamaño del 90%. NF175 no fue sensible a la pirimetamina tanto en HepOrgs como en HuHeps criopreservados. Los datos combinados muestran que los esporozoitos Pf infectan y se desarrollan en HepOrgs mientras mantienen una respuesta similar al fármaco esquizonticida hepático establecido, atovacuona.

A continuación, estudiamos las transcripciones de células huésped en HepOrgs infectados con NF175 y utilizamos la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) para obtener células individuales (tanto infectadas como no infectadas) (Fig. S2). Los hepatocitos primarios aislados se desdiferenciaron rápidamente en un formato 2D en un proceso conocido como transición epitelial-mesenquimatosa10. Esto también ocurrió en HepOrgs diferenciados, como lo muestra una reducción en los niveles de albúmina, cuando se cultiva en un medio propicio para el crecimiento de esquizontes (Fig. S2E). Para la evaluación de los cambios transcriptómicos en los hepatocitos durante el desarrollo intracelular del parásito, probamos varios medios con el objetivo de mantener el fenotipo hepático (lectura de albúmina) y al mismo tiempo permitir el desarrollo del parásito; Se seleccionó una mezcla de medio de hígado William's B (WLB) y HuHeps (HLM) utilizada en una proporción de 1:1 (Fig. S2C-E). En total, se aislaron 1920 células durante 4 y 5 días pi y se procesaron mediante clasificación y secuenciación del transcriptoma asistida por robot (SORT-seq)11. Las secuencias se asignaron a genomas de referencia de origen humano y Pf y se analizaron utilizando Seurat v412. Perfiles de expresión génica unicelular de lecturas humanas (n = 1277 células) agrupados en 5 grupos principales (Fig. 2A, Fig. S3A-C, Datos complementarios 1, 5 y 6). Los grupos 0, 1, 2 y 3 expresaron con fuerza ALB y AFP, dos marcadores de hepatocitos diferenciados (Fig. 2A, B). El grupo 2 se enriqueció en hepatocitos proliferativos que expresan MKI67 (Fig. 2A, B). Las células en el grupo 3 mostraron los recuentos de transcripción más altos de ALB y AFP y otros marcadores de diferenciación de hepatocitos, lo que sugiere un enriquecimiento para los hepatocitos más diferenciados (Fig. 2A-C, Fig. S4). El grupo 4 contenía células que expresaban altos niveles de marcadores de linaje de colangiocitos EPCAM y KRT7 (Fig. 2A, B, Fig. S5). Las proporciones de los principales grupos de células fueron consistentes entre las muestras de prueba (células expuestas a parásitos Pf) y los controles no infectados (Fig. S3D, E).

Un mapa t-SNE que muestra los grupos de Seurat y los principales tipos de células en el conjunto de datos de lectura humana (n = 1277 células; grupo 0, n = 571 células; grupo 1, n = 426 células; grupo 2, n = 117 células; grupo 3 , n = 100 células; grupo 4, n = 63 células). B Gráfico de violín que muestra la expresión del gen marcador de linaje por grupo de Seurat. C Gráfico de violín que muestra las puntuaciones de enriquecimiento de la firma del gen de los hepatocitos por grupo de Seurat. Mapa D t-SNE que resalta las tasas de infección de las células (ninguna, n = 786 células; baja, n = 269 células; alta, n = 222 células). E Gráfico de columnas que muestra las proporciones de células por grupo de Seurat y la tasa de infección. Gráfico de columnas que muestra las proporciones de células por tasa de infección y grupo F Seurat o día de recolección G (4 o 5 días pi). Mapa H t-SNE que muestra la expresión de SCARB1. Gráficos de violín que muestran la expresión de SCARB1 por grupo I de Seurat y tasa de infección J. Prueba bilateral de Mann-Whitney U (suma de rangos de Wilcoxon): ns p ≥ 0,05, ****p < 0,0001. Las estadísticas en C e I se calcularon en comparación con el grupo 3. C p < 2–16 (todas las comparaciones); I p < 2–16 (frente al grupo 0), p = 3,1–13 (frente al grupo 1), p = 8,6–8 (frente al grupo 2), p = 2,7–12 (frente al grupo 4); J p = 0,53 (ninguno versus bajo), p < 2,22–16 (ninguno versus alto), p = 1,9–14 (bajo versus alto). Los diagramas de caja en C, I y J indican la mediana (Q2), el percentil 25 (Q1) y el percentil 75 (Q3) con los bigotes mostrando el mínimo (Q1 – 1,5 × rango intercuartil) y el máximo (Q3+ 1,5 × rango intercuartil). Consulte también las figuras S2-S6, S11 y Datos complementarios 1. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen y Datos complementarios 5.

CD81 es un ligando bien establecido de la célula huésped para la entrada de hepatocitos Pf13,14,15, mientras que se ha propuesto un papel similar aunque controvertido para SR-B1 (codificado por el gen SCARB1) y EphA216,17,18. Tanto la expresión de CD81 como la de EPHA2 fueron más bajas en el grupo 3 (Fig. S6A, B), mientras que la expresión de SCARB1 (que codifica SR-B1) fue más alta en este grupo (Fig. 2H, I). El grupo 3 tuvo el mayor número de células infectadas (Fig. 2D-F) y, en línea, la expresión de SCARB1 aumentó significativamente en células altamente infectadas (es decir, células con altos recuentos de transcripción de parásitos) en comparación con células no infectadas o células con baja transcripción de parásitos. cuenta (Fig. 2J). Por el contrario, los recuentos de transcripción más bajos para CD81 y EPHA2 se encontraron en células altamente infectadas (Fig. S6A, B). Además, la expresión de SCARB1 se correlacionó fuertemente con los marcadores de hepatocitos ALB, AFP y RBP4 (r ~ 0,5), mientras que se correlacionó moderadamente negativamente con los marcadores de colangiocitos EPCAM, KRT19 y KRT8 (r <–0,2) (Fig. S6C). Los datos combinados muestran que los parásitos Pf se desarrollan en los cinco grupos de células identificados con una fuerte preferencia por los hepatocitos maduros, como se representa en el grupo 3.

En la búsqueda de posibles diferencias entre las células huésped entre HepOrgs infectados y no infectados, agrupamos en subgrupos el conjunto de datos de células altamente infectadas (n = 348 células) el día 5 pi (Fig. 2G, A). Los genes se expresaron diferencialmente (DE) en hepatocitos infectados, en comparación con los no infectados, mostrando 674 transcripciones reguladas positivamente y 1218 reguladas negativamente, respectivamente, en células infectadas (Fig. 3B, Datos complementarios 2). Los genes asociados con el metabolismo de los lípidos, incluidos APOA1, APOB, FASN, MTTP y PPARA, así como genes relacionados con la glucólisis, como G6PC, estaban significativamente regulados positivamente en los hepatocitos infectados (Fig. 3C, Datos complementarios 2). Un análisis imparcial utilizando EnrichR19 reveló que los genes asociados con el metabolismo del colesterol (WP4718), la vía de señalización de PPAR (WP3942), la enfermedad del hígado graso no alcohólico (WP4396), la vía metabólica de LDL, HDL y TG, incluidas enfermedades relacionadas (WP4522), los ácidos grasos la biosíntesis (WP357), la glucólisis y la gluconeogénesis (WP534), los receptores nucleares en el metabolismo y la toxicidad de los lípidos (WP299) y la betaoxidación de ácidos grasos (WP143) estuvieron significativamente regulados positivamente en los hepatocitos infectados (Datos complementarios 3). Los datos combinados indican que la infección por Pf induce cambios en el metabolismo del huésped que se adaptan al consumo de energía.

Un mapa t-SNE de células en el día 5 pi que muestra el estado de infección (células no infectadas, n = 222; células infectadas, n = 126). B Mapa de calor que muestra genes expresados diferencialmente (DE) entre células infectadas y no infectadas. C Gráficos de violín que muestran una selección de genes DE entre células infectadas y no infectadas. Prueba bilateral de Mann-Whitney U (suma de rangos de Wilcoxon): **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. CPT1A, p = 3,3-5; FASN, p = 5,8-10; APOA1, p > 2,22-16; HMGCR, p = 0,0062; G6PC, p = 0,0011; PCSK9, p = 2-10; APOB, p > 2,22-16; PPARA, p > 2,22-16; LSS, p = 1,3-7; MTTP, p > 2,22-16. Los diagramas de caja en C indican la mediana (Q2), el percentil 25 (Q1) y el percentil 75 (Q3) y los bigotes muestran el mínimo (Q1 – 1,5 × rango intercuartil) y el máximo (Q3 + 1,5 × rango intercuartil). Véanse también los Datos complementarios 2 y 3. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen y los Datos complementarios 5.

Finalmente, el transcriptoma de Pf en HepOrgs infectados el día 5 pi mostró una regulación positiva significativa de más de ochenta marcadores, incluidos CSP, LISP1 y SLARP específicos de la etapa hepática (Fig. 4A, C, D y Datos complementarios 4). El perfil de expresión también fue diferente del generado a partir de parásitos en etapa sanguínea (Fig. 4B, C, Datos complementarios 4, Datos complementarios 7).

A, B Mapas t-SNE derivados de parásitos de células individuales que muestran grupos de células de Seurat (A; n = 395 células; grupo 0, n = 109 células; grupo 1, n = 90 células; grupo 2, n = 66 células; grupo 3, n = 63 células; grupo 4, n = 36 células; grupo 5, n = 31 células) y células HepOrg infectadas (etapa hepática Pf; n = 40 células) o eritrocitos (etapa sanguínea Pf; n = 355 células), respectivamente B. El grupo 4 está enriquecido en células infectadas de HepOrgs, mientras que los grupos restantes contienen principalmente glóbulos rojos. C Mapa de calor que muestra genes expresados diferencialmente (DE) entre el estadio hepático y sanguíneo. D Gráficos de violín que muestran genes DE enriquecidos en la etapa hepática en comparación con la etapa sanguínea. Prueba bilateral de Mann-Whitney U (suma de rangos de Wilcoxon): *p < 0,05. PSC, p = 0,019; LISP1, p = 0,031; SLARP, p = 0,031. Los diagramas de caja en D indican la mediana (Q2), el percentil 25 (Q1) y el percentil 75 (Q3) con los bigotes mostrando el mínimo (Q1 – 1,5 × rango intercuartil) y el máximo (Q3 + 1,5 × rango intercuartil). Véase también Datos complementarios 4. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen y Datos complementarios 7.

SR-B1 es un factor del huésped bien conocido implicado en la invasión de células hepáticas por esporozoitos de Plasmodium16,17. Como se muestra en la Fig. 2I, J, hubo una clara regulación positiva de las transcripciones de SR-B1 desde el día 5 pi, lo que sugiere un papel funcional tardío y desconocido en el desarrollo del parásito, como lo refleja un aumento de la tinción de SR-B1 en HuHeps infectados el día 5. pi (Figura S12). Probamos los posibles efectos tóxicos de dos inhibidores SR-BI conocidos, Block Lipid Transport BLT116,17 e ITX506120 en cultivos de HepOrg y HuHep (Fig. S7A). Sólo ITX5061 mostró toxicidad tanto en HepOrg como en HuHeps en las dos concentraciones más altas probadas. La Figura S7C-E mostró una reducción del 50% en el número de esquizontes en HuHeps tratados con BLT1 a 20–40 μM, pero no para ITX5061, que requería una concentración más alta (40–80 μM). Las HuHeps, como células biológicamente más directamente relevantes, se trataron con BLT1 (20 μM) en diferentes momentos (Fig. S8) para examinar su impacto en el desarrollo del parásito de PfNF54, PfNF135 y PfNF175 en el día 7 pi (Fig. 5, Fig. S9)16,21. Cuando se aplicó 24 h antes de la infección (día -1), BLT1 no impidió la invasión de esporozoitos de NF135 y NF175, a diferencia de NF54 (Fig. 5A-C). Esto indicó que las cepas anteriores parecen tener vías de entrada alternativas independientes de SR-B1. Sin embargo, cuando la monocapa infectada se trató desde el día 1 pi en adelante, hubo una reducción drástica en el número de esquizontes para las tres cepas de Pf, en particular en los días 3 y 4 pi (Fig. 5A-C). Esto también se reflejó en el tamaño reducido del esquizonte para todas las cepas de Pf (Fig. 5D-F, Fig. S10). Los datos combinados muestran que SR-B1 participa funcionalmente en la maduración hepática en etapa tardía de las tres cepas de Pf analizadas, aunque solo es crítico para la invasión de NF54.

El número promedio (por triplicado) (A – C) y el tamaño (D – F) de esquizontes en HuHeps infectados con la cepa NF175 (Magenta), NF135 (verde) y NF54 (negro) y tratados con DMSO o BLT1. Cada barra representa el promedio y las barras de error (SD) de tres réplicas técnicas (A – C) de dos experimentos biológicos (n = 2). Para el tamaño de los esquizontes (D – F), se muestran datos de dos réplicas técnicas de al menos 100 esquizontes, excepto NF54, debido al bajo número de esquizontes que sobrevivieron (D – F). Los números brutos de este panel se muestran en las Figs. S8 y S9. La prueba de comparación múltiple de Sidak (bilateral) se utiliza para comparar las condiciones de DMSO y BLT1 para A – F y se anota como *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Para A, los valores de p de izquierda a derecha son 0,0014, 0,0004, 0,0004 y 0,0005. Para B, los valores de p son 0,0032, 0,0010, 0,0009. Para C, los valores de p son 0,0369, 0,0216, 0,0447. Para E, los valores de p son 0,0182 y 0,0387.

Anteriormente se ha demostrado que P. yoelii y P. berghei (especies de Plasmodium de modelos murinos de malaria) deben eliminar los lípidos del huésped para lograr un desarrollo exitoso en la etapa hepática22,23. Para su crecimiento y desarrollo intrahepático, los parásitos en crecimiento necesitan expandir sus membranas plasmáticas, así como la membrana de la vacuola parasitófora (PVM) circundante. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que la inhibición de la función SR-B1 puede interferir con el empaquetado del parásito hijo, que requiere lípidos esenciales. SR-B1 se une a las lipoproteínas de alta densidad (HDL) y media la entrada del éster de colesterilo u otros lípidos presentes en el núcleo de las partículas de HDL en los hepatocitos24,25. Los HuHeps infectados con PfNF54, PfNF135 y PfNF175 tratados con BLT1 mostraron una tendencia reducida de esquizontes hepáticos positivos para MSP-1 en los días 3 y 4 (Fig. 6A-C). Los esquizontes positivos para MSP-1 restantes mostraron un patrón de tinción de MSP-1 atípico (Fig. 6D-F). Los datos combinados sugieren que SR-B1 puede estar involucrado en la maduración de los esquizontes hepáticos.

El porcentaje de esquizontes HuHep positivos para la expresión de PfMSP1 para NF175 (A), NF135 (B) y NF54 (C). Se realizaron un total de dos experimentos biológicos (n = 2), cada uno con dos réplicas técnicas: se midieron al menos 100 esquizontes en cada réplica técnica, excepto NF54 debido al bajo número de esquizontes que sobrevivieron. Cada barra representa el promedio y las barras de error (SD) de dos réplicas técnicas (A – C) de dos experimentos biológicos (n = 2). Imágenes confocales que muestran esquizontes tratados con DMSO y BLT1 teñidos para PfMSP1 y PfHSP70 para NF175 (D), NF135 (E) y NF54 (F) en HuHeps. La barra de escala es de 25 micras. Estas imágenes son representativas de dos experimentos independientes. La prueba de comparación múltiple de Sidak (bilateral) se utiliza para comparar las condiciones de DMSO y BLT1 para cada cepa de parásito (A–C): se anotan los valores de p para los parámetros significativos (*p < 0,05, **p < 0,01, ** *p < 0,001). Para A, el valor de p es 0,0488; B (de izquierda a derecha), los valores de p son 0,0054 y 0,0012.

En este estudio, mostramos que los organoides de hepatocitos humanos fetales diferenciados son susceptibles a la infección con parásitos Pf y mantienen la etapa de hígado de esquizonte maduro. Los hepatocitos diferenciados generados a partir de HepOrg fetales proporcionan un sistema de cultivo in vitro alternativo que puede combinar características ventajosas tanto de los hepatocitos primarios como de las líneas celulares hepáticas. Los HepOrg infectados tienen características que incluyen morfología y perfil de marcador expresado que son similares a los de los HuHeps primarios. Los esquizontes formados en estos HepOrgs son generalmente más grandes que los presentes en HuHeps y de tamaño más cercano a los observados en ratones con hígados humanizados26,27. Además, la presencia de expresión de MSP-1 en las últimas etapas del hígado confirma una maduración adecuada. Es importante destacar que los parásitos intracelulares en desarrollo son sensibles al fármaco esquizonticida bien establecido atovacuona. En general, nuestros resultados muestran que los hepatocitos diferenciados generados a partir de HepOrgs fetales proporcionan un sistema de cultivo in vitro funcional que cumple con limitaciones importantes tanto de los HuHeps primarios como de las líneas celulares hepáticas. Por ejemplo, las HuHeps frescas y/o criopreservadas sufren de heterogeneidad en la permisividad de Pf, así como una vida útil celular in vitro limitada que comienza a deteriorarse ya unos días después de la siembra28, mientras que las líneas celulares hepáticas solo muestran un apoyo limitado al desarrollo de Pf28.

Anteriormente, hemos demostrado una fuerte correlación entre el tamaño del esquizonte y los niveles de glutamina sintetasa (GS) humana intraparásita en esquizontes NF175 HuHeps7. Sin embargo, la capacidad de acumular GS no parece ser el factor determinante para el tamaño del esquizonte en HepOrgs, ya que los esquizontes GS positivos y negativos muestran tamaños similares. Una posible explicación puede estar relacionada con la disponibilidad y redistribución de GS dentro del parásito: los esquizontes HepOrg muestran redes GS más extensas en comparación con el único punto concentrado presente en los esquizontes HuHeps. Una razón puede ser que los HepOrgs se cultivan en presencia de CHIR99021, un potente inhibidor de la glucógeno sintasa quinasa 3 (GSK3), una proteína que fosforila la β-catenina dirigida a la degradación proteasomal29,30. Una de las funciones de la β-catenina es la de ser un efector clave de la vía de señalización Wnt, que induce la transcripción de varios genes diana de Wnt/β-catenina, incluido GLUL (que codifica GS)31. Por lo tanto, se puede suponer que las células HepOrg contienen un exceso de GS (Fig. S11), lo que puede beneficiar el crecimiento del parásito incluso si no se transporta al parásito.

La tecnología organoide surge como un sistema modelo in vitro para superar algunos de los desafíos de los modelos convencionales32,33. Una ventaja de los organoides es el potencial de formar un grupo celular tridimensional que se asemeja anatómica y funcionalmente mejor al órgano huésped en estudio, manteniendo al mismo tiempo la capacidad de autorrenovación y autoorganización. En el caso de estudios hepáticos, los hepatocitos en una monocapa bidimensional pierden rápidamente sus funciones hepatocíticas20. Chua y sus colegas introdujeron un modelo de esferoides hepáticos para la investigación de la etapa hepática de la malaria basado en hepatocitos primarios cultivados en 3D Cellusponge para formar esferoides21. Una deficiencia importante es la incapacidad de visualizar imágenes de esquizontes debido a las limitaciones de las imágenes en 3D. Aquí, pudimos superar tal limitación disociando organoides diferenciados y colocando células individuales en una monocapa 2D durante 24 a 48 h antes de la infección. Otra ventaja de HepOrg es la posibilidad de modificar genéticamente el genoma del huésped para comprender los factores implicados en el desarrollo del parásito utilizando el protocolo recientemente establecido de activación y desactivación de genes basado en CRISPR/Cas96.

Los estudios transcriptómicos detallados del desarrollo intracelular de Plasmodium en células hepáticas han sido notoriamente difíciles de realizar y están restringidos a especies de Plasmodium que infectan huéspedes no humanos, incluidos P. berghei34, P. yoelii34,35 murino y P. cynomolgi36 de mono. Estos estudios utilizaron una línea de parásito reportero transgénico marcado con fluorescencia para separar las células infectadas de las no infectadas. Aquí, mostramos datos de secuencia de ARN unicelular de células HepOrgs infectadas con Pf obtenidos en los días 4 y 5 pi. Se pueden identificar grupos distintos que incluyen hepatocitos maduros, hepatocitos en proliferación y células similares a colangiocitos tanto en los controles como en las células infectadas. Esto confirma que una estrategia de aislamiento basada en clasificación de flujo no sesga la selección hacia ningún tipo de célula específica y que los datos de scRNA-seq son representativos de la célula HepOrg integral. El mayor número de células altamente infectadas se encuentra en un grupo particular enriquecido con hepatocitos maduros. Esto apoya la idea de que el desarrollo del parásito tiene lugar preferentemente en los hepatocitos más diferenciados que en las células similares a los colangiocitos7.

Anteriormente, los cambios en la transcripción del huésped se analizaron cuidadosamente a lo largo del desarrollo del modelo de malaria en ratón, P. berghei34. En este estudio, se estudiaron dos puntos de tiempo secuenciales (días 4 y 5 pi) con regulación positiva de genes involucrados en el metabolismo de los lípidos y la generación de energía (glucólisis y gluconeogénesis) comparable con el punto de tiempo de 12 a 18 h pi en el desarrollo de la etapa hepática de P. berghei (que se completa en 48 h). Otro cambio notable en el desarrollo de la etapa hepática de P. berghei es la regulación negativa general de la maquinaria de apoptosis y la respuesta inflamatoria a medida que se desarrolla el parásito (12 h pi en adelante). Esto no se observó en nuestro conjunto de datos, pero podría deberse a la naturaleza no cancerosa de HepOrg, a diferencia de la línea celular de hepatoma Hepa1-634.

El hallazgo de una regulación positiva de SR-B1 hepático después de la infección por Pf es novedoso; anteriormente solo se asociaba como receptor del huésped implicado en la invasión16,17, también tiene un papel adicional en el desarrollo de modelos de malaria en roedores (P. berghei y P. yoelii) en líneas celulares de hepatocitos. En modelos de malaria en roedores, el huésped SR-B1 es el factor determinante natural o limitante de la infección del parásito. Este puede ser el caso de PfNF54, donde la incubación previa de HuHeps con inhibidores de BLT1 reduce drásticamente el número de parásitos intracelulares, pero no de PfNF135 y PfNF175. La secuencia de ARN unicelular de HuHeps recién aislado muestra que muy pocas células contienen transcripciones de SCARB1 (en comparación con CD81, otro receptor de invasión del huésped), lo que puede explicar la relativa baja infectividad de PfNF54 en comparación con NF175 y NF135 (datos no publicados). Si bien la infección por el parásito de la malaria en roedores puede estar limitada por SR-B1 de origen natural, esto es diferente para Pf, ya que existe una regulación positiva de las transcripciones de SCARB1 después de la infección, que puede ser una respuesta del huésped a la infección o una manipulación activa del parásito del huésped. Desafortunadamente, no pudimos probar el impacto del inhibidor de SR-B1 en los HepOrg infectados debido a la pérdida progresiva de la capacidad de PfNF175 para transmitir y generar esporozoitos37,38. Con base en nuestros hallazgos, planteamos la hipótesis de que la captación de lípidos mediada por SR-B1 se utiliza para la generación de membranas del parásito, incluidas las membranas plasmáticas y/o para la vacuola parasitófora, pero también para empaquetar los merozoítos hijos: los esquizontes tratados con BLT1 son más pequeños en tamaño y muestran Tinción atípica de MSP-1. Los lípidos también pueden usarse para que el huésped expanda su membrana plasmática para acomodar a los parásitos en crecimiento.

En conclusión, los HepOrgs humanos representan una fuente versátil para el cultivo in vitro que contribuirá a una mejor comprensión de la biología del estadio hepático Pf. Proporcionamos perfiles de secuencia de ARN de células infectadas individuales. Se identifica un papel novedoso para el factor hepático del huésped, SR-B1, que revela heterogeneidad entre las cepas de Pf. El uso de HepOrgs humanos acelerará el desarrollo clínico de nuevos fármacos y vacunas. Estudios futuros con otras especies de Plasmodium (humanas) arrojarán más luz sobre este potencial.

Se obtuvieron muestras de hígado fetal humano en el Centro Médico de la Universidad de Leiden (LUMC). El uso de muestras con fines de investigación fue aprobado por el comité de ética de LUMC y se obtuvo el consentimiento informado de los donantes según fuera necesario.

Las células primarias del hígado humano se aislaron recientemente del material quirúrgico remanente. Las muestras son anónimas y la aprobación general para el uso del material quirúrgico remanente se otorgó de acuerdo con la legislación ética holandesa como se describe en la Ley de Investigación Médica (Sujetos Humanos), y fue confirmada por el Comité de Investigación con Seres Humanos, en la región de Arnhem. -Nijmegen, Países Bajos.

Se establecieron y cultivaron organoides de hepatocitos humanos (HepOrgs), esencialmente como se describe en Hendriks et al.6. Brevemente, se aislaron hepatocitos humanos de tejido fetal humano mediante digestión con colagenasa IV seguida de centrifugación de 100 g durante 5 minutos. Aproximadamente, se mezclaron 10.000 células con medio Hep humano (medio de hígado HuHep o HLM) y MatrigelR (con una proporción de 1:3) y se sembraron en 24 pocillos. Después de la solidificación, se añadió medio de expansión HLM (ver más abajo) y se actualizó cada 2 días. Para el presente estudio, se utilizaron cuatro líneas de organoides de hepatocitos previamente establecidas (KK2, KK3, KU1 y K1FM).

El medio de expansión del medio hepático Human HepOrg (HLM-EM) consta de AdDMEM/F12 (Thermo Scientific, con Hepes, GlutaMax y penicilina-estreptomicina) más un 15 % de medio acondicionado RSPO1 (hecho en casa), B27 (sin vitamina A), 50 ng /ml EGF (Peprotech), N-acetil-L-cisteína 1,25 mM (Sigma), gastrina 10 nM (Sigma), ChIR99021 3 mm (Sigma), HGF 50 ng/ml (Peprotech), FGF7 100 ng/ml (Peprotech ), 100 ng/ml de FGF10 (Peprotech), 2 nM A83-01 (Tocris), 10 mM de nicotinamida (Sigma), 10 mM de inhibidor de Rho Y-27632 (Calbiochem) y 20 ng/ml de TGFa.

Para los HepOrg fetales, se utilizaron medios de diferenciación del medio hepático HepOrg humano (HLM-DM) para la diferenciación de organoides. DM consta de EM más Oncostatina M 10 ng/ml, DAPT 100 nM y Dexametasona 100 nM. Durante el cultivo, el medio se renovó cada 2 a 3 días. Los organoides generalmente se pasan en una proporción de 1:3 a 1:4 cada 7 días antes del paso 6, 1:3 cada 7 a 10 días después del paso 6. La distribución futura de organoides a cualquier tercero (académico o comercial) tendrá que realizarse ser autorizado por el METC UMCU a solicitud del HUB para garantizar el cumplimiento de la ley holandesa de investigación médica con seres humanos.

El medio William's B consta de 1X William's E+ Glutamax (Invitrogen 32551-087) con piruvato de sodio 100 mM (Invitrogen 11360-036), 1% de insulina, transferrina, selenio (Invitrogen 41400-045), 1% de MEM-NEAA (Invitrogen 11140- 035), 2 % Pen/Strep (Invitrogen 15140-122), 1 % Fungizone (GE Healthcare SV30078.01) y dexametosona 12,8 mM. Los medios se esterilizaron por filtración y se añadió suero humano inactivado por calor al 10 % (obtenido localmente de acuerdo con protocolos éticamente aprobados) cuando estuviera indicado.

Los medios HLM:WLB constan de volúmenes iguales (1:1) de medios HLM-DM y WLB sin suero. Ambos medios deben prepararse recién y mezclarse.

Se mantuvieron cinco líneas de organoides (KU1, KK2, KK3, K1FM) en medio HLM-EM. 10 a 14 días antes de la infección, los HepOrgs se transfirieron al medio HLM-DM. El medio se repuso cada 2 a 3 días y se reemplazó en Matrigel fresco alrededor del día 7. Se recubrieron microplacas de imágenes tratadas con TC de fondo plano negro/transparente Falcon (Corning 353219) con una solución de recubrimiento de colágeno (Sigma 125-50) durante 2 días. en la incubadora. Antes del recubrimiento celular, el colágeno se neutralizó con 150 µl de DMEM. Se disociaron HepOrgs en células individuales utilizando TrypLE y se sembraron 50.000 células/pocillo en placas recubiertas de colágeno con 150 µl de HLM. Las células en placas se centrifugaron a 3000 rpm durante 10 minutos (acc 9, freno 1) y se incubaron en la incubadora hasta la infección.

Las etapas de sangre asexual y sexual se cultivaron en un sistema semiautomático como se describe en las refs. 39,40,41. Se criaron mosquitos Anopheles stephensi en el insectario del Centro Médico de la Universidad de Radboud (Nijmegen, Países Bajos) de acuerdo con procedimientos operativos estándar. Se diseccionaron manualmente las glándulas salivales de los mosquitos infectados, que se recogieron en medio William's B completo (medio William's E con Glutamax [Thermo Fisher, 32551-087], suplementado con 1X insulina/transferrina/selenio [Thermo Fisher, 41400-045], Piruvato de sodio 1 mM [Thermo Fisher, 11360-070], 1X MEM-NEAA [Thermo Fisher, 11140-035], 2,5 µg/ml de fungizona [Thermo Fisher 15290-018], 200 U/ml de penicilina/estreptomicina [Thermo Fisher 15140 -122] y dexametasona 1,6 µM [Sigma Aldrich D4902-100MG]) sin suero. Después de la homogeneización, se contaron los esporozoitos en una cámara de Burker-Turk en un microscopio de contraste de fases. Los esporozoitos se complementaron con sueros humanos inactivados por calor (HIHS) al 10% del volumen total, inmediatamente antes de la infección con HepOrg o HuHeps.

Se diseccionaron glándulas salivales de mosquitos A. stephensi infectados criados en laboratorio entre los días 16 y 21 después de la ingesta de sangre. Para la infección, se agregaron 50.000 esporozoitos a cada pocillo suspendidos en WLB+ suero humano al 10 % a MOI = 1. Las placas se centrifugaron a 3000 g durante 10 min (acc 9, freno, 1) y se incubaron a 37 °C durante 3 h. Los medios se repusieron después de 3 h para eliminar los residuos. Después de la infección inicial, las monocapas de HepOrg se mantuvieron en HLM:WLB (1:1) sin suero. Después de la infección, los medios se repusieron con HLM:WLB (1:1) todos los días.

Se aislaron hepatocitos humanos primarios de pacientes sometidos a hepatectomía parcial electiva en Yang et al.7. Los hepatocitos recién aislados suspendidos en medio Williams' B completo se sembraron en 96 pocillos a 62.500 células por pocillo y se mantuvieron en una incubadora a 37 °C (5 % de CO2) con refrescos diarios del medio. Se agregaron esporozoitos disecados (día 16-21 después de la ingesta de sangre) a los HuHeps 48 h después del cultivo en placas en una proporción de 1:1 por duplicado/triplicado y se centrifugaron a 3000 rpm durante 10 minutos con frenos bajos. El medio se renueva después de 3 hy luego diariamente. El cultivo infectado con esporozoitos se mantuvo durante 5 o 7 días, después de lo cual las células se fijaron con paraformaldehído al 4% (ThermoFisher Scientific: número de catálogo 28906) durante 10 minutos. Las muestras se permeabilizaron usando Triton al 1% y se tiñeron con los diversos anticuerpos humanos o de P. falciparum enumerados anteriormente.

Para la curva dosis-respuesta de BLT1 e ITX5061: los hepatocitos criopreservados (dos donantes: AY40 y AY76) se descongelaron y se infectaron con PfNF175 o PFNF135 después de la siembra. Se añadió una serie de concentraciones de fármaco (0, 0,5, 1, 5, 10, 20, 40, 80, 100 μM) a los cultivos infectados el día 3 después de la infección durante 48 h (un refresco del medio a las 24 h). La monocapa infectada se fijó el día 7 después de la infección y se procesó.

Los hepatocitos criopreservados se descongelan y se tratan con diferentes concentraciones de ITX5061 o BLT1 cinco o seis días después de la siembra (es decir, el día 3 o el día 4 después de la infección). El día 9 después del cultivo en placas, se determinó la viabilidad utilizando el ensayo de viabilidad de células luminiscentes CellTiter-Glo® (Promega: #G7570). Para probar la toxicidad de estos respectivos fármacos también en HepOrgs (KK2), se prepararon monocapas como se describe anteriormente. Tres días después de la siembra, las monocapas de HepOrg se trataron con un rango de dosis de ITX5061 o BLT1 durante 48 h y el día 7, se midió la viabilidad utilizando CellTiter-Glo. Debido a las variaciones en parámetros como la densidad de siembra o la ubicación de los pocillos en una placa, las variaciones entre pocillos pueden oscilar entre el 80 y el 120 % de la viabilidad. La toxicidad verdadera solo debe considerarse para una viabilidad inferior al 80 % en comparación con muestras de control o no tratadas.

Las etapas asexuales de Pf se cultivaron en un sistema semiautomático como se describe en La purificación de glóbulos rojos parasitados se realizó en un gradiente de Percoll escalonado que consta de una capa superior de Percoll del 35 % y una inferior del 65 % como se mostró anteriormente42. Después de la centrifugación, la interfaz inferior contiene glóbulos rojos parasitados enriquecidos. Esta interfaz se recogió y se diluyó en PBS y luego se clasificó utilizando las puertas utilizadas para las células hepáticas infectadas. Como los glóbulos rojos no tienen núcleo, se consideró que cualquier granularidad en las células (SSC) se debía a una infección y a la presencia de parásitos. El método relacionado con el aislamiento de ARN se puede encontrar en la sección de métodos titulada "Aislamiento de ARN y qRT-PCR".

El aislamiento de ARN de organoides, tejidos y células primarias se realizó con RNeasy Micro Kit (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. El ARN se transcribió de forma inversa con la transcriptasa inversa M-MLV, RNase H Minus (Promega). El análisis de qPCR se realizó con la máquina qPCR SYBR Green Mixture (Bio-rad Laboratories) 384 (Bio-rad Laboratories). Los cebadores para qPCR se diseñaron utilizando NCBI Primer-BLAST y se enumeran en la tabla complementaria.

Los organoides se tripsinizaron en células individuales utilizando TryPLE. Para las monocapas, se usaron raspadores de células de 96 pocillos (Biotium 22003) para separar las células y se trataron con Accutase (Sigma A6964) durante 3 minutos seguido de neutralización con DMEM. Las células se centrifugaron a 1200 rpm durante 5 minutos y se resuspendieron en medio HLM:WLB. Los grupos de células se eliminaron filtrando a través de un filtro de 70 µm. Se utilizó yoduro de propidio (Thermo Fisher P1304MP) para la discriminación de células vivas/muertas. Se utilizaron células de control no infectadas para establecer las puertas FSC y SSC. Las células infectadas se clasificaron mediante puertas regulares y estrictas. Se establecieron puertas estrictas para incluir células que tuvieran la mayor granularidad (SSC).

La secuenciación de ARNm unicelular (scRNA-seq) se realizó utilizando el método SORT-seq11, que se basa en el método CEL-Seq243. Brevemente, se clasificaron células viables individuales (es decir, células o glóbulos rojos derivados de HepOrg) directamente en pocillos de una placa de 384 pocillos llena con tampón de lisis que contenía cebadores CEL-Seq2 específicos de pocillos. Las placas se centrifugaron brevemente a 500 × g en una centrífuga de mesa enfriada y se almacenaron inmediatamente a –80 °C. Para la preparación de la biblioteca, las placas almacenadas se descongelaron y se calentaron a 70 °C durante 5 minutos para lisar las células y extraer el ARN. Luego, el ARN purificado se sometió a la síntesis de la primera y la segunda hebra, seguido de un paso de transcripción in vitro durante la noche para generar ARN amplificado (ARNa). El ARNa se utilizó como entrada para generar bibliotecas complementarias (ADNc) utilizando cebadores Illumina TruSeq. El control de calidad se realizó utilizando un fluorómetro Qubit (Thermo Fisher Scientific) y un instrumento bioanalizador 2100 (Agilent), según las instrucciones del fabricante. Todas las bibliotecas enviadas se secuenciaron en un Illumina NextSeq500 utilizando una secuenciación de pares de 75 pb con alto rendimiento (150 millones de lecturas por ejecución).

Las lecturas se asignaron al conjunto del genoma humano GRCh37 concatenado con el transcriptoma de referencia de la cepa 3D7 de P. falciparum (PF3D7), descartando cualquier lectura de mapeo múltiple. Los recuentos de lectura se filtraron para excluir lecturas con códigos de barras de biblioteca, células y moléculas idénticos y los recuentos de UMI se ajustaron utilizando estadísticas de recuento de Poisson11.

Todos los análisis bioinformáticos adicionales se realizaron en el entorno R/Bioconductor. Las bibliotecas scRNA-seq se analizaron utilizando el paquete Seurat v412. El conjunto de datos inicial que contenía lecturas 3D7 tanto humanas como de P. falciparum se dividió por especie y los dos conjuntos de datos resultantes se analizaron por separado.

Para el conjunto de datos humanos, los nombres de genes duplicados se hicieron únicos utilizando la función make.unique y los picos de ERCC92, y los transcriptomas celulares totales con menos de 2001 UMI transcritos se eliminaron del conjunto de datos. Los transcriptomas restantes se normalizaron utilizando la función SCTransform de Seurat usando la configuración vars.to.regress para eliminar fuentes de variación confusas, como los recuentos totales de UMI (nCount_RNA), los recuentos totales de genes (nFeature_RNA) y las placas procesadas. Utilizamos la función AddModuleScore de Seurat para evaluar la expresión de genes de necrosis (FOSB, FOS, JUN, JUNB, ATF3, EGR1, HSPA1A, HSPA1B, HSPB1, IER3, IER2, DUSP1)44. Sólo las células con una puntuación de enriquecimiento del gen de necrosis inferior a 1 se conservaron para análisis adicionales. SCTransform con la misma configuración que antes se volvió a ejecutar en el conjunto de datos limpio. La agrupación de células inicial se generó en función de las similitudes de expresión genética utilizando FindClusters de Seurat con una resolución = 0,4. El gráfico SNN se calculó utilizando la función FindNeighbor de Seurat y se visualizó utilizando un script publicado en otro lugar (https://romanhaa.github.io/projects/scrnaseq_workflow/#snn-graph). El árbol del clúster se generó utilizando la función BuildClusterTree de Seurat. El análisis del ciclo celular se realizó utilizando la función CellCycleScoring de Seurat. Para calificar la expresión génica de cualquier marcador de hepatocitos (ALB, AFP, RBP4, FABP1, SERPINA1, ASGR2, ASGR1, APOA2, APOC3) o marcador de colangiocitos (KRT19, KRT8, KRT18, EPCAM, KRT7), utilizamos la función AddModuleScore de Seurat. Los genes marcadores de grupos celulares se identificaron utilizando la función FindAllMarkers de Seurat con las siguientes configuraciones: only.pos = TRUE, min.pct = 0,25, thresh.use = 0,25. La expresión de genes marcadores de linaje (ALB, AFP, MKI67, KRT7, EPCAM) por grupo de células se visualizó utilizando la función VlnPlot de Seurat configurada en stack = TRUE. La tasa de infección de las células HepOrg se definió de la siguiente manera: ninguna, transcripciones ≤ 1 Pf; bajo, 1 50 Pf transcripciones. Se definió que las células HepOrg infectadas tenían más de 1 transcripción de Pf.

Para la subagrupación del conjunto de datos desde el día 5 pi, el conjunto de datos humanos se dividió por día de recolección utilizando la función SplitObject de Seurat. Después de la subagrupación utilizando la misma estrategia y configuración (p. ej., resolución = 0,4) que se utilizó para la agrupación inicial, utilizamos el paquete EnrichR19 y la función FindMarkers de Seurat para, respectivamente, realizar un análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) e identificar expresiones expresadas diferencialmente. (DE) genes (valor de p ajustado ≤ 0,05) que comparan células infectadas (es decir, células con más de un recuento de lectura total asignado a genes de Plasmodium falciparum) y células no infectadas (es decir, células con 1 o menos recuento de lectura total asignado a genes de Plasmodium falciparum ). Los genes DE entre infectados y no infectados se trazaron utilizando la función DoHeatmap de Seurat.

Para el conjunto de datos 3D7 de P. falciparum, los nombres de genes duplicados se hicieron únicos utilizando la función make.unique y los transcriptomas celulares totales con menos de 50 UMI transcritos se eliminaron del conjunto de datos. La normalización se realizó nuevamente utilizando la función SCTransform de Seurat con la configuración vars.to.regress para eliminar fuentes de variación confusas, como los recuentos totales de UMI (nCount_RNA), los recuentos totales de genes (nFeature_RNA) y las placas procesadas. La agrupación se realizó como se describió anteriormente utilizando FindClusters de Seurat con una resolución = 0,4 y los genes marcadores de agrupación se identificaron utilizando la función FindAllMarkers de Seurat con las siguientes configuraciones: only.pos = TRUE, min.pct = 0,25, thresh.use = 0,25. La expresión de los 2 genes TOP de cada grupo (es decir, los genes más expresados por grupo) se visualizó utilizando la función VlnPlot de Seurat configurada en stack = TRUE. Para identificar genes DE (valor de p ajustado ≤ 0,05) comparando los transcriptomas de la etapa hepática (es decir, células recolectadas de HepOrgs infectados) y la etapa sanguínea (es decir, eritrocitos infectados recolectados), utilizamos la función FindMarkers de Seurat. Los genes DE que comparan las dos etapas se trazaron utilizando la función DoHeatmap de Seurat.

Se utilizó el microscopio de alto contenido Leica DMI6000B para colocar mosaicos en 96 pocillos para determinar la tasa de infección. Para cada pocillo, se obtuvo un tamaño de mosaico de 9 × 9 con objetivos de 20 ×. Para obtener imágenes confocales de alta resolución se utilizó el Zeiss LSM880 con Airyscan con objetivos de 63× (aceite) y zoom de 2× o el Leica SP8 SMD con objetivo de 63× (agua).

Versión FIJI utilizada para el análisis 1,53t

Véase la sección de métodos de Yang et al.7.

Las imágenes obtenidas con el microscopio de alto contenido se abrieron en FIJI. Se eligieron imágenes aleatorias hasta medir 100 parásitos. Los parásitos se seleccionaron mediante la herramienta de región de interés (ROI) utilizando la positividad de PfHSP70 (canal rojo) y se midieron.

Esto ha sido publicado antes7. Brevemente, para cada una de las imágenes medidas en la sección anterior, se determinó una intensidad de fondo total (RawIntDen) en el canal verde (como PfMSP-1/hGS está etiquetado con Alexa-488) utilizando la región de interés (ROI). Se determinó una intensidad de fondo por área (x) (intensidad total de toda la imagen dividida por el tamaño del área de la imagen). Se determinó una intensidad de fondo total para el parásito usando la fórmula x multiplicada por el tamaño medido del parásito. La intensidad verde medida dentro de un parásito se determina utilizando la herramienta ROI para seleccionar simplemente el parásito en cuestión. La intensidad real dentro del parásito se calcula restando el valor de fondo de la intensidad medida. Si la intensidad real es mayor que el valor de fondo, entonces el parásito se considera "positivo" para la expresión de hGS/PfMSP1. Si es inferior, el parásito es “negativo”. Para cada condición, se midieron más de 50 esquizontes, excepto en los casos de tratamiento con BLT1 debido al bajo número de esquizontes supervivientes para algunas líneas Pf.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos de secuenciación generados en este estudio se han depositado en Gene Expression Omnibus (GEO) con el número de acceso GSE199239. Los datos originales se proporcionan con este documento.

Los scripts R para el análisis unicelular están disponibles en https://github.com/KaiKretzschmar/HepOrgMalaria.

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Descargar referencias

Nos gustaría agradecer a Marga van de Vegte-Bolmer, Rianne Stoter y Wouter Graumans por su excelente trabajo en la generación de parásitos P. falciparum e infecciones por mosquitos. Queremos agradecer a Jolanda Klaasan, Laura Pelser-Posthumus, Astrid Pouwelsen y Jacqueline Kuhnen por la hábil cría de mosquitos y la disección de mosquitos infectados en busca de esporozoitos. Nos gustaría agradecer al Centro de Imágenes Microscópicas (MIC) de la Universidad de Radboud por el acceso a sus instalaciones. Nos gustaría agradecer a Reinier van den Linden por su ayuda con la clasificación de flujo; Maya Sen, Judith Vivié y Single Cell Discoveries por su ayuda con SORT-seq; el Utrecht Sequencing Facility (USEQ) para la secuenciación y Anko de Graaf y el Hubrecht Imaging Center (HIC) para ayuda con la microscopía confocal. Finalmente, nos gustaría agradecer a Judith Bolscher y Marloes de Bruijni (TropIQ Health Sciences) por los datos de sensibilidad a los medicamentos de las cepas Pf. ASPY recibió una subvención Veni del programa de talentos del Consejo Holandés de Investigación (NWO) (VI.Veni.192.171) y una subvención ZonMW Off-Road (04510012010050). GJvG cuenta con el apoyo del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea en virtud del acuerdo de subvención n.° 733273. Este trabajo fue respaldado por una subvención avanzada EU/ERC (a HC, acuerdo de subvención: 67013e) y una subvención CRUK OPTIMISTICC (a HC, número de subvención : C10674/A27140). DD recibió una subvención VENI del Consejo Holandés de Investigación (NWO-ALW, 016.Veni.171.015). KK fue miembro a largo plazo de la Organización del Programa Científico de la Frontera Humana (HFSPO, LT771/2015), recibió una subvención VENI (NWO-ZonMW, 016.166.140) y actualmente está financiado por German Cancer Aid (a través de MSNZ Würzburg/ NG3) y una subvención inicial UE/ERC (acuerdo de subvención: 101042738). DH recibió el apoyo de una beca postdoctoral de la Sociedad Sueca de Investigación Médica (n.º P19-0074) y cuenta con el apoyo de una subvención VENI del Consejo Holandés de Investigación (n.º VI.Veni.212.134).

Devanjali Dutta

Dirección actual: Merus, Utrecht, Países Bajos

Jens Puschhof

Dirección actual: Departamento de Microbioma y Cáncer, Centro Alemán de Investigación del Cáncer (DKFZ), Im Neuenheimer Feld 280, 69120, Heidelberg, Alemania

Huili Hu

Dirección actual: Centro de Investigación de Células Madre y Medicina Regenerativa, Departamento de Biomedicina de Sistemas, Facultad de Ciencias Médicas Básicas, Facultad de Medicina Cheeloo, Universidad de Shandong, Jinan, China

Kim E. Boonekamp

Dirección actual: División de Señalización y Genómica Funcional, Centro Alemán de Investigación del Cáncer (DKFZ), Im Neuenheimer Feld 280, 69120, Heidelberg, Alemania

Hans Clevers

Dirección actual: Farmacia, Investigación y Desarrollo Temprano (pRED) de F. Hoffmann-La Roche Ltd, Basilea, Suiza

Robert W. Sauerwein

Dirección actual: TropIQ Health Sciences, Nijmegen, Países Bajos

Estos autores contribuyeron igualmente: Annie SP Yang, Devanjali Dutta, Kai Kretzschmar, Delilah Hendriks.

Estos autores supervisaron conjuntamente este trabajo: Hans Clevers, Robert W. Sauerwein.

Centro Radboud de Enfermedades Infecciosas, Departamento de Microbiología Médica, Centro Médico de la Universidad de Radboud, Nijmegen, Países Bajos

Annie SP Yang, Youri van Waardenburg, Geert-Jan van Gemert, Teun Bousema y Robert W. Sauerwein

Instituto Hubrecht, Real Academia de Artes y Ciencias de los Países Bajos, Utrecht, Países Bajos

Devanjali Dutta, Kai Kretzschmar, Delilah Hendriks, Jens Puschhof, Huili Hu, Kim E. Boonekamp y Hans Clevers

Instituto Oncode, Utrecht, Países Bajos

Devanjali Dutta, Kai Kretzschmar, Delilah Hendriks, Jens Puschhof, Huili Hu, Kim E. Boonekamp y Hans Clevers

Centro de Carrera Temprana Mildred Scheel (MSNZ) para la Investigación del Cáncer de Würzburg, Hospital Universitario de Würzburg, Würzburg, Alemania

Kai Kretzschmar

Anatomía y Embriología, Centro Médico de la Universidad de Leiden, Leiden, Países Bajos

Susana M. Chuva de Sousa Lopes

Departamento de Cirugía, Centro Médico de la Universidad de Radboud, Nijmegen, Países Bajos

Johannes HW de Wilt

Centro Princesa Máxima (PMC) de Oncología Pediátrica, Utrecht, Países Bajos

Hans Clevers

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

Este estudio fue diseñado por ASPY, DD, KK, HC y RWS. Los experimentos fueron realizados por ASPY, DD, KK, DH e YvWHH, KEB y SMCdSL ayudaron con el cultivo de organoides. El análisis de los datos fue realizado por ASPY, DD, KK, HC y DH. El análisis bioinformático fue realizado por KK y JPJHWdW y GJvG proporcionaron los segmentos de hígado humano y los mosquitos infectados, respectivamente. El manuscrito fue escrito por ASPY, DD, KK, TB, HC, RWS y comentado por todos los coautores.

Correspondencia a Annie SP Yang, Hans Clevers o Robert W. Sauerwein.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Gary Peltz, Roberta O'Connor, Alexis Cotto-Rosario, Stefan Kappe y los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Un archivo de revisión por pares está disponible.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Yang, ASP, Dutta, D., Kretzschmar, K. et al. Desarrollo de estadios hepáticos de Plasmodium falciparum en hepatocitos derivados de cultivos de organoides de hígado fetal humano. Nat Comuna 14, 4631 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-40298-7

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Recibido: 08 de mayo de 2022

Aceptado: 19 de julio de 2023

Publicado: 02 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-40298-7

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