Efectos del norte

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 12502 (2023) Citar este artículo

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Investigar el efecto del antioxidante N-acetilcisteína (NAC) sobre la proliferación y apoptosis en células embrionarias de Drosophila S2 que interfieren con el gen CG8005 mediante la eliminación de especies reactivas de oxígeno (ROS) intracelulares. La eficacia de interferencia del gen CG8005 en células embrionarias de Drosophila S2 se verificó mediante PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR). Se utilizaron diferentes concentraciones de NAC y solución salina tamponada con fosfato (PBS) para afectar las células embrionarias de Drosophila S2. El estado de crecimiento de las células embrionarias de Drosophila S2 se observó mediante un microscopio óptico. Se utilizaron dos sondas de dihidroetidio (DHE) y 2,7-diclorodihidrofluoresceína-acetoacetato (DCFH-DA) para observar la producción de ROS en cada grupo después de la tinción por inmunofluorescencia. Se utilizaron tinción TUNEL y citometría de flujo para investigar el nivel de apoptosis de los embriones de Drosophila S2, y se utilizó CCK-8 (Cell Counting Kit-8) para detectar la viabilidad celular de los embriones de Drosophila S2. La eficiencia de eliminación del fragmento siCG8005-2 fue alta y estable, lo que se verificó mediante la eficiencia de interferencia (P <0,05). No hubo cambios significativos en el crecimiento de las células embrionarias de Drosophila S2 después del tratamiento con NAC en comparación con el grupo de PBS. Además, la destrucción del gen CG8005 resultó en un aumento de ROS y apoptosis en células embrionarias de Drosophila S2 (P <0,05) y una disminución en la actividad de proliferación (P <0,05). Además, el tratamiento previo con NAC antioxidante podría inhibir la producción de ROS en células embrionarias de Drosophila S2 (P <0,05), reducir la apoptosis celular (P <0,05) y mejorar la supervivencia celular (P <0,05). El gen CG8005 en las células embrionarias de Drosophila S2 podría regular la proliferación y apoptosis de las células embrionarias S2 al alterar la homeostasis redox, y el antioxidante NAC podría inhibir la apoptosis celular y promover la proliferación celular al eliminar ROS en las células embrionarias de Drosophila S2, lo que se espera que proporcione nuevos conocimientos sobre la patogénesis de la infertilidad masculina y la espermatogénesis.

La homeostasis redox intracelular, que se refiere al equilibrio dinámico entre especies oxidantes y reductoras, desempeña un papel fundamental en el mantenimiento de los procesos fisiológicos normales, incluido el crecimiento celular, el metabolismo, la apoptosis y la proliferación1,2. Cuando el organismo es sometido a estímulos nocivos, el sistema oxidativo y el sistema antioxidante se desequilibran y luego tienden a ser oxidativos, resultando en infiltración de neutrófilos, secreción de proteasas y producción de un gran número de intermediarios oxidativos3,4. Especies reactivas de oxígeno (ROS) es un término general para compuestos activos que contienen oxígeno, incluidos el radical hidroxilo (·OH), el peróxido de hidrógeno (H2O2) y el radical superóxido (O2-), que se generó en el proceso del metabolismo oxidativo5,6,7 . En condiciones normales, el cuerpo puede producir una pequeña cantidad de ROS para mantener el equilibrio del metabolismo del oxígeno bajo los efectos de las enzimas eliminadoras de radicales libres y los antioxidantes8,9. Sin embargo, se puede producir una gran cantidad de ROS después de estímulos dañinos, lo que provoca la alteración de la homeostasis redox y, en última instancia, contribuye a la aparición de estrés oxidativo10. Durante los últimos años, la evidencia acumulada ha demostrado que el estrés oxidativo está estrechamente involucrado en la aparición de la proliferación celular y la apoptosis. El tratamiento con oxidantes puede inducir la apoptosis e inhibir la proliferación celular, mientras que el uso de antioxidantes puede reducir la apoptosis y aumentar la viabilidad celular11,12. La N-acetilcisteína (NAC), un antioxidante que contiene tiol y precursor del glutatión (GSH), podría atenuar el estrés oxidativo al eliminar los radicales libres y estimular la actividad de la enzima antioxidante13,14. Existe un informe de que el uso de NAC también se ha asociado con una reducción significativa de la peroxidación lipídica y un aumento significativo de los niveles de GSH en el hígado y los eritrocitos de ratones15.

CG8005 es una treonina sintasa desoxigenada que cataliza la escisión oxidativa de la espermidina dependiente de NAD. Usando la herramienta de análisis en línea Bing (string db. Org/network/7227.FBpp0072081), puede haber interacción entre la proteína del factor de iniciación 5A (elf-5A) y la traducción eucariótica, que puede estar involucrada en la respuesta al estrés oxidativo y la integridad de la membrana celular16. Estudios anteriores han demostrado que CG8005 puede afectar la respuesta al estrés oxidativo y participar en el proceso de proliferación y apoptosis de las células madre reproductivas testiculares de Drosophila17.

Las células embrionarias de Drosophila S2, como modelo celular para expresar proteínas extrañas, son superiores a las células de mamíferos comunes. Cuando el gen diana se integra en el genoma celular mediante operaciones experimentales, las células embrionarias de Drosophila S2 pueden completar la transcripción, traducción y procesamiento de proteínas correctos. Y la proteína diana es estructural y funcionalmente idéntica a la proteína natural18. Al mismo tiempo, las células embrionarias de Drosophila S2 son células semisuspendidas que poseen las ventajas de un cultivo conveniente y una rápida proliferación. En nuestro estudio, las células embrionarias de Drosophila S2 funcionaron como modelo in vitro para detectar el nivel oxidativo mediante la regulación de la expresión del gen CG8005, y en nuestro estudio también se investigó el efecto de la NAC sobre la proliferación y la apoptosis en células embrionarias de Drosophila S219. .

Las células embrionarias de Drosophila S2 se obtuvieron del Drosophila Genomics Resource Center.

La información sobre los reactivos y el equipo utilizados en este estudio es la siguiente: DMEM (Gibco, EE. UU.), Suero bovino fetal (Bioind, Israel), LipofectamineTM2000 (Invitrogen, EE. UU.), opti-MEM (Gibco, EE. UU.), ARN de interferencia pequeña (Suzhou Gema Gene), N-acetil-l-cisteína (Shanghai Biyuntian), reactivo TRIzol (TaKaRa, Japón), instrucciones de transcripción inversa Prime Script RT Reagent Ki (TaKaRa, Japón), colorante de mezcla maestra SYBG (TaKaRa, Japón), 2, Acetoacetato de fluoresceína de 7-diclorodihidrógeno (DCFH-DA) y dihidroetidio (DHE) 1 uM (Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd.), DAPI (Invitrogen, EE. UU.). Incubadora de temperatura (Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.), instrumento de PCR cuantitativa de fluorescencia Mx3000P (Agilent, EE. UU.).

Las células embrionarias de Drosophila S2 congeladas en un tanque de nitrógeno líquido a -80 °C se resucitaron siguiendo el principio de congelación lenta y descongelación rápida. Se preparó un medio de cultivo completo a base de DMEM (Gibco, USA) + suero fetal bovino al 10% (Bioind, Israel). Se cultivaron células embrionarias de Drosophila S2 a una temperatura constante de 28 °C en una atmósfera libre de CO2. Las células se cultivaron en una densidad adecuada y se inocularon en una nueva botella de cultivo para su posterior cultivo y experimentos posteriores.

Se inocularon células embrionarias de Drosophila S2 en una placa de 6 pocillos con una densidad de 1,5 x 105 células/ml para la transfección celular de acuerdo con las instrucciones del reactivo de transfección del liposoma LipofectamineTM2000 (Invitrogen, EE. UU.). Se agregaron 15 ul de ARN de interferencia pequeño (ARNip diseñado y sintetizado por Suzhou Jima Gene Company) a 250 ul de MEM óptimo, y se agregaron 15 ul de LipofectamineTM2000 a 250 ul de MEM óptimo. Estas dos soluciones se dejaron reposar durante otros 5 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, se fusionaron completamente dos soluciones mixtas y luego se dejaron reposar durante otros 20 minutos a temperatura ambiente. Finalmente, se añadió una concentración de 150 nmol/l de solución mixta a una placa de 6 pocillos para la transfección celular. Después de 6 h de transfección, se reemplazó el nuevo medio de cultivo para continuar la incubación durante otras 48 h en una incubadora a temperatura constante. La información de ARNip se enumeró en la Tabla 1.

Se inocularon células S2 de Drosophila melanogaster en una placa de 6 pocillos con una densidad celular de 1,5 x 105 células/ml. Se añadieron a cada pocillo para el pretratamiento, respectivamente, solución de NAC 1,25 mM, solución de NAC 2,5 mM, solución de NAC 5,0 mM, 3,75 ul de solución de PBS, 7,5 ul de solución de PBS y 15 ul de solución de PBS. Las células S2 se incubaron conjuntamente durante 1 h para cambiar el nivel de ROS intracelular. Luego, se agregaron control negativo y solución de transfección de siCG8005 150 nmol/l (preparada según el paso 1.3.1, con un volumen final de 530 ul) a la placa de seis pocillos correspondiente. Las células S2 se incubaron conjuntamente en una incubadora a temperatura constante y completaron una serie de operaciones experimentales.

El ARN total se extrajo utilizando el reactivo TRIzol (TaKaRa, Japón). La concentración de ARN se midió utilizando un espectrofotómetro UV y la transcripción de ARN se invirtió en ADNc de acuerdo con las instrucciones de transcripción inversa Prime Script RT Reagent Ki (TaKaRa, Japón). Se preparó el tinte de mezcla maestra SYBG (TaKaRa, Japón) con ADNc y los cebadores correspondientes para formar un sistema de reacción (operación con hielo), que se mezcló completamente y se centrifugó brevemente. Para la reacción posterior se utilizó el instrumento de PCR cuantitativa de fluorescencia Mx3000P (Agilent, EE. UU.). Se utilizó gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) como gen de referencia interna. De acuerdo con las regulaciones del fabricante, se usó la curva estándar para calcular la relación múltiple con Folds = 2 − ΔΔ CT que representa la relación de ploidía entre la expresión del gen diana en el grupo experimental y el grupo de control. Cada experimento se repitió tres veces de forma independiente. (Tabla 2).

El kit de ensayo de ROS es el método comúnmente utilizado para la detección de la generación de ROS basado en el cambio de intensidad de fluorescencia del tinte fluorescente DCFH -DA (diacetato de 2,7 -diclorofluoresceína). Las ROS intracelulares pueden oxidar el DCFH no fluorescente para generar DCF (diclorofluoresceína) fluorescente. Después del tratamiento correspondiente durante 48 h, las células S2 se sembraron en placas de 96 pocillos y se incubaron con DCF 10 μM durante 30 minutos a 37 °C. Después de retirar el DCF, las células se lavaron con PBS y se midió la fluorescencia de las células de cada pocillo mediante un lector de microplacas SYNERGY. Mientras tanto, se fotografiaron las células sembradas en placas de 24 pocillos y se realizó un análisis de intensidad de fluorescencia como se describe para la tinción con DHE.

La apoptosis celular se determinó mediante el ensayo TUNEL según los protocolos del fabricante. El kit de detección de apoptosis TUNEL BrightRed se obtuvo de Vazyme. La solución de marcado según las instrucciones de la Tabla 3.

La viabilidad celular de las células embrionarias de Drosophila S2 se detectó mediante el ensayo CCK-8 (kit de recuento de células-8). Se incubaron células embrionarias de Drosophila S2 en placas de 96 pocillos (104 células por pocillo) durante 12 h. Se añadió medio de cultivo CCK-8 al 10 % preparado previamente a cada pocillo y luego se coincubó durante 1 h más en una incubadora a 37 °C. La absorbancia a 450 nm se midió utilizando un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima después de la transfección durante 0, 24 y 48 h. Los valores de DO se registraron y representaron utilizando el software GraphPad.

Se utilizaron colorantes de anexina V y yoduro de propidio (PI) como sondas fluorescentes para detectar la apoptosis mediante citometría de flujo. Se transfectaron células embrionarias de Drosophila S2 según los pasos anteriores. Después de la transfección 48 h, las células se lavaron con PBS enfriado con hielo a 4 °C. Luego, la concentración de células se ajustó a 1 x 106 células por pocillo según la fórmula de recuento de células. Se agregaron 5 μl de Anexina V-Alexa Fluor 647 y 10 μl de solución de PI a cada tubo de muestra y luego se incubaron conjuntamente a temperatura ambiente durante 15 minutos en la oscuridad. Se agregaron 200 ul de PBS a cada tubo de muestras y luego estas muestras se analizaron mediante un citómetro de flujo FACS. Los resultados se organizaron y trazaron adicionalmente utilizando el software Flowjo.

Todos los datos cuantitativos se expresaron como media ± desviación estándar (DE) de al menos tres pruebas de muestras independientes. Las comparaciones estadísticas se realizaron mediante la prueba t de Student. Las diferencias se consideraron significativas en P < 0,05 (*P < 0,05, **P < 0,01 y ***P < 0,001).

Se seleccionaron dos pequeños ARN de interferencia (siCG8005-1 y siCG8005-2) para silenciar el gen CG8005 en células embrionarias de Drosophila S2. Se utilizó la PCR cuantitativa en tiempo real para comparar el nivel de expresión del ARN mensajero (ARNm) en el grupo de control negativo, el grupo siCG8005-1 y el grupo siCG8005-2. Como se muestra en la Fig. 1, la eficiencia de interferencia del fragmento siCG8005-2 fue mayor que la del fragmento siCG8005-1 (Fig. 1, P <0,001).

Nivel relativo de ARNm de CG8005 en células de control y ARNip CG8005 (CG8005 siRNA-1 y CG8005siRNA-2) para validar la eficiencia de eliminación. Las barras de error representan la media ± desviación estándar (sd) de tres réplicas.

La solución salina tamponada con fosfato (PBS) se utiliza generalmente como disolvente para disolver el reactivo protector. Después de que las células embrionarias de Drosophila S2 se trataran con diferentes dosis de PBS (3,75 ul, 7,5 ul, 15 ul), el número de células embrionarias de Drosophila S2 aumentó exponencialmente. La morfología de las células embrionarias de Drosophila S2 permaneció pequeña y redonda, que estaban medio suspendidas en el frasco de cultivo. La N-acetilcisteína (NAC), eliminadora reactiva de oxígeno, es un antioxidante de uso común que podría inhibir la producción intracelular de ROS20. Después de 48 h de tratamiento con diferentes concentraciones de NAC (1,25 mM, 2,5 mM, 5,0 mM), el número de células embrionarias de Drosophila S2 aumentó significativamente, mientras que el estado de crecimiento de las células no se vio obviamente afectado en comparación con el grupo PBS (Fig. 2).

Observación del crecimiento de células embrionarias de Drosophila S2 después del tratamiento con NAC y PBS. Barra de escala: 30 μm.

Se reconoce que ROS es un regulador esencial de las células madre, que puede influir en la homeostasis de las células madre al promover la diferenciación y la autorrenovación en diferentes poblaciones de células madre21. Para examinar si los defectos disfuncionales de diferenciación espermatogonial inducidos por CG8005 estaban relacionados con el estrés oxidativo, se investigó el estado redox en el grupo de Control Negativo, siCG8005 y NAC + siCG8005. Después del tratamiento con siCG8005, el nivel de ROS en las células embrionarias S2 aumentó drásticamente. Sin embargo, la generación de ROS en el grupo de NAC + siCG8005, como se observó con las sondas DHE y DCF, disminuyó considerablemente en un efecto dependiente de la dosis (Fig. 3A-C).

Detección de contenido de ROS en células embrionarias de Drosophila S2. (A) Diagrama de fluorescencia de DHE y DCF-DA en células S2 después de diferentes tratamientos. Barra de escala: 30 μm. (B) Análisis cuantitativo de la tinción con DHE en células S2 después de diferentes tratamientos. (C) Análisis cuantitativo de la tinción con DCF en células S2 después de diferentes tratamientos. Las barras de error representan la media ± desviación estándar (sd) de tres réplicas en (B, C).

Para investigar más a fondo el efecto de NAC sobre la apoptosis mediada por CG8005 en células embrionarias de Drosophila S2, se utilizó el reactivo TUNEL para detectar la apoptosis celular. Los resultados de la inmunofluorescencia confirmaron que las señales positivas de TUNEL aumentaron significativamente durante la activación del estrés oxidativo. La apoptosis celular podría rescatarse gradualmente a medida que aumenta gradualmente la concentración de NAC (Fig. 4A), lo que fue consistente con el análisis cuantitativo (Fig. 4B). El análisis de citometría de flujo demostró que después de eliminar CG8005, hubo un aumento significativo en las células apoptóticas tempranas y tardías en comparación con el grupo negativo. Pero estas células apoptóticas disminuyeron gradualmente después del tratamiento de intervención con NAC (Fig. 4C, D).

Detección de apoptosis en células embrionarias de Drosophila S2 tras diferentes tratamientos. (A) Fluorescencia de TUNEL en células S2 después de la intervención siCG8005 y NAC. Barra de escala: 30 μm. (B) Análisis cuantitativo de la tinción TUNEL después de diferentes tratamientos. (C) Análisis de citometría de flujo de células S2 después de diferentes tratamientos. (D) Análisis cuantitativo de la apoptosis por citometría de flujo tras diferentes tratamientos. Las barras de error representan la media ± desviación estándar (sd) de tres réplicas en (B, D).

La actividad de proliferación de células embrionarias S2 después de diferentes tratamientos se detectó mediante el experimento CCK-8 en diferentes momentos. La actividad de proliferación de las células en el grupo siCG8005 se inhibió en comparación con el grupo de control negativo, que mostró un efecto dependiente del tiempo. Además, la inhibición celular de las células embrionarias S2 fue rescatada gradualmente, cuando aumentó la concentración de NAC. Se observa que no hubo diferencia estadística en el nivel de proliferación celular entre el grupo de control negativo y el grupo siCG8005 más NAC, lo que demostró claramente que la NAC antioxidante inhibe la apoptosis celular y promueve la proliferación celular al eliminar ROS en células embrionarias de Drosophila S2. (Figura 5).

Detección de proliferación de células embrionarias de Drosophila S2 tras los diferentes tratamientos en los intervalos de tiempo indicados. Las barras de error representan la media ± desviación estándar (sd) de tres réplicas.

El estrés oxidativo está estrechamente asociado con diferentes tipos de enfermedades humanas, incluidas enfermedades cardiovasculares, enfermedades neurodegenerativas, diabetes tipo II y tumores malignos22,23. La alteración de la homeostasis redox afecta la proliferación, diferenciación y división en diferentes poblaciones de células madre24. Se informa que Drosophila es un modelo in vivo clásico en el campo de la investigación del sistema reproductivo y se utiliza a menudo para investigar la infertilidad masculina y la espermatogénesis25,26. Cuando las células embrionarias de Drosophila S2 se someten a estímulos dañinos, una gran cantidad de especies reactivas de oxígeno (ROS) podrían acumularse en las células y, en última instancia, provocar una muerte apoptótica27. Además, el gen CG8005 es un gen de expresión dominante en los testículos de Drosophila y se ha documentado que es uno de los factores reguladores en las células madre reproductivas testiculares de Drosophila20. La evidencia acumulada informó que CG8005, una potencial desoxitreonato sintasa, participa en el ciclo celular, la descomposición del ARN mensajero y la respuesta al estrés, y también está estrechamente relacionada con la homeostasis redox. Sin embargo, existen pocas investigaciones relacionadas sobre la función biológica y el mecanismo regulador del gen CG8005 en células embrionarias de Drosophila S2.

En el estudio actual, la eliminación de CG8005 indujo una cantidad de producción de ROS, que luego se eliminaron mediante el tratamiento de intervención con NAC, lo que sugiere que CG8005 puede regular el estrés oxidativo en las células embrionarias de Drosophila S2. En el informe anterior del profesor Yu et al.20,21 se identificó el CG8005 como un regulador de la homeostasis del nicho de células madre en los testículos de Drosophila, y la eliminación del CG8005 podría aumentar efectivamente la concentración de ROS en las células S2, lo cual fue similar al hallazgo de nuestros experimentos. Es bien sabido que las ROS desempeñan un papel fundamental en los procesos biológicos; mientras que una alta concentración de ROS podría causar daño oxidativo a las biomoléculas celulares, contribuyendo así a la muerte celular, como la apoptosis celular28. La NAC, un eliminador de antioxidantes comúnmente, se usó generalmente para inhibir la generación de ROS intracelular para aumentar la supervivencia celular, lo que también fue similar al informe anterior29.

El gen CG8005 en las células embrionarias de Drosophila S2 podría regular la proliferación y apoptosis de las células embrionarias S2 al regular la homeostasis redox, y el antioxidante NAC podría inhibir la apoptosis celular y promover la proliferación celular al eliminar ROS en las células embrionarias de Drosophila S2, lo que se espera que proporcione nuevas conocimientos sobre la patogénesis de la infertilidad masculina y la espermatogénesis.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado.

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Este trabajo fue apoyado por el Programa de Capacitación de Jóvenes Talentos de la Universidad de Jiangsu (5521470000), la Fundación de Investigación Clave del Desarrollo Social de Zhenjiang (SH2018065, SH2022066), la Fundación de Ciencias Postdoctorales de China (2022M711721) y el Fondo de Innovación Colaborativa de Educación Médica de la Universidad de Jiangsu (JDY2022002).

Departamento de Ginecología Médica, Hospital Afiliado de la Universidad de Jiangsu, Zhenjiang, 212000, República Popular de China

Wanyin Chen

Departamento de Ultrasonido Médico, Hospital Afiliado de la Universidad de Nantong, Nantong, 226006, República Popular China

Yifei Yin

Departamento de Ultrasonido Médico, Hospital Afiliado de la Universidad de Jiangsu, Zhenjiang, 212000, República Popular de China

Zheng Zhang

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Concibió y diseñó los experimentos: WYC y ZZ Realizó los experimentos: YFY y ZZ Contribuyó con reactivos/materiales/herramientas de análisis: YFY Escribió el artículo: WYC Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Yifei Yin o Zheng Zhang.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Chen, W., Yin, Y. y Zhang, Z. Efectos de la N-acetilcisteína sobre la proliferación mediada por el gen CG8005 y la apoptosis de células embrionarias de Drosophila S2. Representante científico 13, 12502 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39668-4

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Recibido: 03 de abril de 2023

Aceptado: 28 de julio de 2023

Publicado: 02 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39668-4

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