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El modelo de conjuntiva in vitro 3D de espesor completo permite la diferenciación de células caliciformes
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El modelo de conjuntiva in vitro 3D de espesor completo permite la diferenciación de células caliciformes

Jul 15, 2023

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 12261 (2023) Citar este artículo

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El cultivo in vitro y la generación de células caliciformes altamente especializadas sigue siendo un desafío importante en los equivalentes in vitro 3D conjuntivales. Un modelo que comprende todos los factores fisiológicos, incluidas las células caliciformes secretoras de moco, tiene el potencial de actuar como una nueva plataforma para estudios sobre enfermedades conjuntivales. Aislamos células epiteliales conjuntivales primarias y fibroblastos de biopsias humanas. Se generaron modelos 3D a partir de capas epiteliales o una combinación de ellas con un equivalente de tejido conectivo. Se investigaron modelos epiteliales para determinar la expresión de marcadores y la función de barrera. Se analizaron modelos de espesor total para determinar la morfología de las células caliciformes y la expresión de marcadores mediante inmunofluorescencia y PCR cuantitativa en tiempo real. Los modelos epiteliales simples cultivados en la interfaz aire-líquido mostraron epitelios multicapa estratificados con queratinización patológica y sin formación de células caliciformes. La combinación con un equivalente de tejido conectivo para generar un modelo de espesor total condujo a la formación de un epitelio multicapa estratificado no queratinizado y a la diferenciación de células caliciformes inducidas. En nuestro modelo, se logró un gran parecido con la conjuntiva natural mediante la combinación de células epiteliales conjuntivales con fibroblastos incrustados en un hidrogel de colágeno como equivalente de tejido conectivo. En el futuro, nuestro equivalente conjuntival in vitro permitirá la investigación de la diferenciación de células caliciformes, patologías conjuntivales y pruebas de fármacos.

La conjuntiva contribuye a la película lagrimal de la superficie ocular secretando moco suavizante1,2. Las funciones cruciales de la conjuntiva son la protección contra influencias mecánicas y patógenas y la capacidad de reaccionar ante sustancias nocivas y alérgenos mediante la producción de moco regulada por IgE y eosinófilos3. A través de este mecanismo, la conjuntiva contribuye al privilegiado sistema inmunológico de la superficie ocular. Influencias adversas como las fluctuaciones de la humedad, la enfermedad del ojo seco, los alérgenos, las infecciones y las reacciones autoinmunes, por ejemplo, el síndrome de Stevens-Johnson o el penfigoide de las membranas mucosas, pueden provocar destrucción de la conjuntiva y, finalmente, ceguera4,5.

Intercaladas en el epitelio no queratinizado de 2 a 9 capas de células escamosas y columnares estratificadas se encuentran células caliciformes altamente especializadas. Sus mucinas secretadas contribuyen a la película lagrimal para asegurar una superficie ocular suave. Un alto porcentaje de la parte interna de las células caliciformes está llena de vesículas que contienen moco, mientras que los núcleos de las células se ubican en su cara basal6. En general, las mucinas dependen de los tejidos y se dividen en dos clases: mucinas asociadas a membranas y mucinas secretadas. En el contexto del epitelio conjuntival, se han identificado las mucinas MUC1, MUC4 y MUC16 asociadas a la membrana, así como la mucina formadora de gel secretada MUC5AC y la MUC7 soluble secretada1,7. Las células caliciformes conjuntivales expresan principalmente MUC5AC y en menor medida MUC161,8,9. En los últimos años se han desarrollado sistemas de prueba conjuntival in vitro que utilizan cultivos 2D y 3D para abordar la conjuntivitis, el ojo seco, la migración de fibroblastos del pterigión, la fibrosis y la administración de fármacos10,11,12,13. Diferentes autores han desarrollado complejos modelos 3D que comprenden toda la estructura conjuntival, en los que se utilizó un equivalente de tejido conectivo como soporte para el cultivo de células epiteliales en la parte superior. En estos estudios, se utilizaron andamios hechos de colágeno I, fibrina o conjuntiva descelularizada, mientras que las matrices de colágeno I y fibrina incluían células estromales14,15,16. Estos modelos pudieron abordar cuestiones específicas de la investigación conjuntival, incluida la diferenciación, los estudios de inflamación y los fines clínicos. Si bien se puede detectar moco en estos modelos mediante tinciones ELISA y Alcianblue/PAS, los cultivos de explantes son difíciles de estandarizar y los modelos de conjuntiva generados in vitro muestran algunas características, pero no todas. Por lo tanto, todavía existe la necesidad de un modelo que combine un epitelio estratificado de múltiples capas con células caliciformes y tinción específica con MUC5AC dentro de sus estructuras en forma de copa. Además, el cultivo de estas células caliciformes especializadas sigue siendo un desafío importante debido a factores clave faltantes o desconocidos en su desarrollo6.

Por lo tanto, todavía se utilizan pruebas con animales para investigar las vías de diferenciación de las células caliciformes y la fisiopatología de las enfermedades relacionadas con la mucina en general. Los modelos animales de la conjuntiva comprenden una amplia variedad de especies como ratones, ratas, cobayas, gatos, conejos, caninos e incluso primates no humanos. La elección de los animales depende de las propiedades fisiológicas y bioquímicas, así como del tamaño de los ojos17,18. Generalmente se prefieren características bioquímicas, película lagrimal y tamaño de ojos similares al tejido humano. Sin embargo, persisten diferencias bien conocidas entre los humanos y otras especies, por ejemplo, diferentes lipidomas de Meibomio y composiciones de lágrimas18,19,20,21,22,23. Es necesario seguir desarrollando soluciones in vitro con características clave, como la formación de células caliciformes, para modelar enfermedades y probar fármacos en modelos altamente predictivos. Cuando estén completamente desarrollados, esos modelos in vitro pueden mejorar enormemente el desarrollo de fármacos para diversas enfermedades, especialmente en el contexto de tratamientos personalizados mediante el uso de células derivadas de pacientes. Al final, estos tejidos in vitro pueden ser el trampolín para los implantes fabricados mediante ingeniería tisular.

En el desarrollo de modelos conjuntivales in vitro, la diferenciación de las células caliciformes de las células epiteliales y la detección de mucinas son los desafíos más importantes y difíciles. Los mecanismos detrás de esta diferenciación no se comprenden completamente. Las respuestas inmunes que aumentan los niveles de IL-4, IL-13 e IgE se asocian con un aumento de la expresión de MUC5AC en las células epiteliales conjuntivales, lo que sugiere un papel en el proceso de diferenciación a células caliciformes24,25,26. Tian et al. demostraron que influir en la señalización de Notch a través de inhibidores de la gamma-secretasa puede conducir a la diferenciación de células caliciformes en un modelo de conjuntiva in vitro27. Nomi et al. describieron que la adición de factores de crecimiento, como el factor de crecimiento de queratinocitos (KGF) y el factor de crecimiento epidérmico (EGF) es crucial para los procesos de diferenciación de las células epiteliales conjuntivales derivadas de iPSC28. De manera más general, Tsai et al. demostraron que los fibroblastos conjuntivales están involucrados en la diferenciación de las células caliciformes15. Hasta el momento, no se ha logrado recrear in vitro un modelo de conjuntiva complejo con suficiente morfología de células caliciformes y expresión de marcadores en un epitelio multicapa altamente estratificado. El equivalente de la conjuntiva mostrado en este estudio muestra una amplia diferenciación de células caliciformes y expresión de marcadores, lo que abre nuevos enfoques para descifrar los factores implicados en el desarrollo de las células caliciformes conjuntivales. También ofrece un nuevo modelo in vitro para la investigación de la enfermedad del ojo seco, que afecta al número de células caliciformes conjuntivales29.

Todos los protocolos experimentales fueron aprobados por el comité de ética local (Ethik-Kommission der Universität Würzburg, número de aprobación 280/18sc). Todos los experimentos se llevaron a cabo de conformidad con las normas para la investigación en seres humanos, tal como se definen en la Declaración de Helsinki. Las biopsias de conjuntival humana se obtuvieron con el consentimiento informado de pacientes del Hospital Universitario de Würzburg, Alemania. Estas biopsias fueron de individuos adultos sometidos a cirugía de drenaje por glaucoma o cirugía de indentación escleral por desprendimiento de retina, sin otra patología ocular. Específicamente, la conjuntiva no padecía afecciones como pterigión, neoplasia, penfigoide o inflamación significativa. Para este estudio se utilizaron un total de 9 biopsias de diferentes donantes.

Las células conjuntivales primarias se aislaron de muestras individuales de tejido humano y no se agruparon. Las biopsias se incubaron en una solución de dispasa (2 U/mL) durante 1 h a 37 °C o durante la noche a 4 °C. Después de la digestión en dispasa, las biopsias se transfirieron a PBS (sin cloruro de calcio ni cloruro de magnesio) para su lavado. Las capas epiteliales se rasparon suavemente con unas pinzas curvas y se transfirieron a una placa de Petri que contenía medio basal de células epiteliales corneales (A1: medio basal de células epiteliales corneales + kit de crecimiento de células epiteliales corneales, colección americana de cultivos tipo, ATCC + penicilina/estreptomicina al 1 % (Sigma Aldrich, Darmstadt, Alemania)). El tejido restante se tripsinó durante 2 minutos a temperatura ambiente (RT). Las células epiteliales en medio A1 se centrifugaron a 300 xg durante 5 minutos a temperatura ambiente y se eliminó el sobrenadante. El tejido tripsinado restante también se centrifugó a 300 xg durante 5 minutos a temperatura ambiente y se eliminó el sobrenadante. Ambas muestras se resuspendieron en 1 ml de medio A1. Antes del aislamiento celular, se incubaron a 37 °C dos matraces de cultivo de células T25 separados con 2 ml de medio condicionado de fibroblastos conjuntivales. Luego se transfirieron células epiteliales conjuntivales humanas procedentes del raspado y la tripsinación a un matraz T25 con un volumen total de 3 ml.

Para el aislamiento de fibroblastos conjuntivales humanos primarios, el tejido restante se digirió en una solución de colagenasa A (5 U/ml) a 37 °C durante 1 h mientras se agitaba el tubo cada 15 minutos después del aislamiento de las células epiteliales. Después de la digestión, el tubo se centrifugó a 300 xg durante 5 min a temperatura ambiente y se resuspendió en 2 ml de DMEM (Thermo Fisher, Waltham, EE. UU.) + FCS al 10 % (Bio&SELL GmbH, Feucht, Alemania) + penicilina/estreptomicina al 1 % (Sigma Aldrich). , Darmstadt, Alemania), luego se sembró en un matraz de cultivo T25.

Para ambos, el medio de células epiteliales aisladas y fibroblastos se cambió cada 2 a 3 días. Las células epiteliales recibieron 3,5 ml de medio A1 y los fibroblastos recibieron 3,5 ml de DMEM.

Las células se sembraron en una concentración de 4.500 células/cm2 en un matraz de cultivo, se cultivaron durante cuatro días, se separaron con Accutase (Thermo Fisher, Waltham, EE. UU.) y se contaron. Posteriormente, las células se sembraron en un matraz nuevo en la misma concentración. Los tiempos de duplicación se calcularon mediante la siguiente fórmula30:

Se cultivaron fibroblastos conjuntivales en un matraz de cultivo en DMEM. El medio se cambió cada 2 a 3 días. Después de alcanzar la confluencia, se cambió el medio cada 24 h y se recogió el medio. Este procedimiento se repitió durante 4 días. El medio recogido se centrifugó dos veces a 300 xg durante 5 minutos a temperatura ambiente y se filtró de forma estéril. El medio condicionado se almacenó a -20 °C.

Para la generación de rhConE, se sembraron ~ 70% de células epiteliales confluentes en insertos Brand de 24 pocillos (BRAND Insert 2in1, para 24 pocillos, Bio-CERT CELL CULTURE STERILE, Brand, Wertheim, Alemania) en una concentración de 3 × 105 células (5 × 105 células/cm2) un volumen de 300 µL de medio de crecimiento de queratinocitos PromoCell 2 + mezcla suplementaria + solución de CaCl2 1,5 mM (PromoCell, Heidelberg, Alemania) (medio Pro2). Las células se cultivaron en 2D hasta el paso 2 (p2), por lo que se cultivaron en p3 en modelos 3D. Después de 2 h de tiempo de adhesión, se agregaron al pocillo 1,4 ml de medio Pro2. Después de 24 h se estableció una interfaz aire-líquido (puente aéreo). El puente aéreo se consideró como el día 1 del tiempo de cultivo modelo en el que rhConE recibió medio Pro2 + 73 µg/mL de ácido ascórbico-2-fosfato (AA2P) + 10 ng/mL de KGF (medio Pro3) o medio Pro3 + 10% de medio FibroLife (+ 2% FCS, sin suplemento LifeFactor, EGF-/TGF-β, Gentamicina y Anfotericina, Lifeline Cell Technology, San Diego, EE. UU.).

Para FTConM, se utilizaron insertos Snapwell™ de 12 mm con membrana de policarbonato de poro de 0,4 μm (Corning Incorporated, Corning, EE. UU.). Como equivalente de tejido conectivo, utilizamos 700 µl de un hidrogel comprimido de colágeno I purificado que se aisló de colas de rata y lo combinamos con 4,5 × 104 fibroblastos (6,43 × 104 células/mL), según un estudio de Reuters et al. 31. Para un cultivo sumergido, los equivalentes de tejido conectivo recibieron 250 µl de DMEM apicalmente y 5 ml de DMEM basolateralmente. Después de 4 días de cultivo sumergido, se extrajo todo el medio y se sembraron 5,0 x 105 células epiteliales encima del equivalente de tejido conectivo en 250 µl de medio Pro2. Después de 2 h de tiempo de adhesión, se agregaron al pocillo 2,5 ml de medio Pro2. Se estableció un puente aéreo después de 24 h y el medio se cambió a medio Pro10. El medio se cambió cada 48 a 72 h.

En sus respectivos días de cultivo (días 10, 15 y 20), se realizó un ensayo de viabilidad en rhConE junto con análisis histológicos. El MTT (bromuro de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5 difenil tetrazolio) se convierte en cristales de formazán por las células vivas, lo que es impulsado por la actividad mitocondrial32. La cantidad de células vivas se correlaciona con el cambio de color de amarillo a azul violeta durante la incubación con el reactivo. Los insertos de marca se incubaron basolateralmente con 200 µl de solución de MTT precalentada. Después de 3 h de incubación a 37 °C, los insertos se transfirieron a un pocillo nuevo. Se agregaron 500 μL de isopropanol basolateral y apicalmente. La placa se colocó en una plataforma agitadora durante 1,5 a 2 h hasta que se extrajo todo el tinte del modelo. Posteriormente, se utilizó 1 ml de isopropanol para enjuagar aún más los modelos. Luego, en una placa de 96 pocillos, se analizaron 200 µL mediante medición colorimétrica de la extinción a 570 nm (lector de placas Tecan M Infinite nano, Männedorf, Suiza).

Para los análisis histológicos en portaobjetos de parafina, rhConE y FTConM se fijaron en Rotifix® (Carl Roth, Alemania) durante 2 a 3 h a temperatura ambiente. Posteriormente, los insertos se cortaron, se lavaron en dH2O y se deshidrataron mediante una serie de etanol/isopropanol (50%, 70%, 80%, 96%, isopronanol I, isopropanol II). El alcohol restante se eliminó mediante xileno antes de incluir las sondas en parafina.

Utilizando un micrótomo (HistoCore AutoCut, Leica, Wetzlar (Alemania)), se cortaron secciones de 3,5 µm de espesor de bloques de tejido de parafina y se transfirieron a portaobjetos de microscopio SuperFrost (ThermoFisher Scientific, Waltham, EE. UU.). Para una tinción adicional, las secciones se desparafinaron a 60 °C y se transfirieron inmediatamente a xileno para su rehidratación, seguido de una serie descendente de etanol y dH2O (96 %, 96 %, 70 %, 50 %, dH2O). Después de teñir las secciones con hematoxilina y eosina (Morphisto, Offenbach am Main, Alemania) o con un kit Alcianblue-PAS (adaptación: hematoxilina de Mayer en lugar de GILL III, Morphisto, Offenbach am Main, Alemania), se deshidrataron mediante un proceso de etanol ascendente. /isopronanol y transferidos a xileno (70%, 96%, isopronanol I, isopronanol II, xileno I, xileno II). Luego se montaron los portaobjetos con Entellan (Merck, Darmstadt, Alemania) y cubreobjetos de vidrio.

Para la evaluación de los marcadores epiteliales expresados ​​por rhConE y FTConM, se realizó inmunofluorescencia en secciones de parafina y montajes completos. Se prepararon secciones de parafina como se indicó anteriormente, utilizando portaobjetos de microscopio de adhesión Polysine™ (epredia, Portsmouth, NH, EE. UU.). Para tinciones de montaje completo, se cortaron FTConM de los insertos y se fijaron con fijación de Carnoy hasta que se cubrieron durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los portaobjetos de parafina se bloquearon en suero al 5% (de burro) durante 20 min. Se aplicaron anticuerpos primarios y se incubaron a 4 °C durante la noche. Al día siguiente, los portaobjetos se lavaron tres veces durante 5 minutos con tampón de lavado. Se aplicaron anticuerpos secundarios y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 h. Los portaobjetos se lavaron nuevamente tres veces y se montaron con FluoroMount (Fluoromount-G con DAPI, Thermo Fisher, Waltham (EE. UU.)).

Para tinciones de montaje completo, se cortaron modelos de sus inserciones y se fijaron en una placa de 24 pocillos. Después de la fijación, los modelos se trataron con Triton al 0,2% durante 30 min. Posteriormente, las sondas se lavaron durante 5 min con tampón de lavado. Se aplicó una solución de bloqueo al 5% durante 30 minutos a temperatura ambiente. La tinción con anticuerpos primarios y secundarios se realizó de manera similar a los portaobjetos de parafina. En lugar de montarlos, los modelos se transfirieron a portaobjetos de cámara y se cubrieron con FluoroMount. Anticuerpos primarios: citoqueratina 1 (Abcam, ab185628, dilución 1:600), citoqueratina 13 (Abcam, ab92551, dilución 1:200), citoqueratina 14 (Sigma-Aldrich, HPA023040, dilución 1:1000), citoqueratina 19 (Abcam, ab7754 , dilución 1:100), MUC5AC (Invitrogen, MA5-12178, dilución 1:100), Vimentin (Abcam, ab92547, dilución 1:2000), E-Cadherin (BD Biosciences, 610181, dilución 1:100). Anticuerpos secundarios: AlexaFluor® 488, 555, 647 (dilución 1:400, LifeTechnologies, Carlsbad, CA, EE. UU.). Se tomaron imágenes de áreas representativas para análisis histológicos.

Mediante espectroscopia de impedancia, se midió la resistencia eléctrica transepitelial (TEER) a una frecuencia de 1000 Hz para evaluar la calidad de la barrera y la integridad de los modelos de tejido. Para la evaluación de la barrera, definimos valores TEER1000 Hz para brindar información más precisa sobre la integridad de un epitelio multicapa33. Los modelos de tejido se transfirieron a una placa Brand de 24 pocillos y recibieron 600 µl de su respectivo medio de medición de impedancia basolateral y apicalmente. Se utilizó una placa de medición de TiN de 24 pocillos para analizar la amplitud y la fase de los modelos mediante el analizador de impedancia LCR HiTESTER 3522-50 (HIOKI EE Corporation, Nagano (JP)). Los resultados se mostraron utilizando el software LabVIEW. Después de la medición, se extrajo medio de los modelos que luego se transfirieron nuevamente a sus placas de pocillos anteriores.

Los armazones sembrados con células se lisaron en tampón TRK suplementado con β-mercaptoetanol, se homogeneizaron con un Tissue Lyser (Qiagen) y el ARN total se extrajo utilizando el kit peqGOLD MicroSpin Total RNA (VWR) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se transcribió inversamente 1 µg de ARN total a ADNc utilizando el kit Supermix de transcripción inversa i-Script (Bio-Rad). La PCR cuantitativa en tiempo real se realizó con 1 µl de ADNc utilizando SsoFAST™ EvaGreen® Supermix (Bio-Rad) y el ciclador de PCR en tiempo real CFX 96 Touch™ (Bio-Rad). Todas las ejecuciones se realizaron a una temperatura de recocido de 60 ° C y la expresión génica se estableció en relación con GAPDH (F-5'-GAAGGGCT CATGACCACAGT y R-5'-GGATGCAGGGATGATGTTCT) como gen de referencia. Las secuencias de cebadores (Eurofins, Alemania) utilizadas fueron MUC5AC (F-5ʹ-GTTTGACGGGAAGCAATACA y R-5ʹ-CGATGATGAAGAAGGTTGAGG) y MUC16 (F-5ʹ-GCCTCTACCTTAACGGTT ACAATGAA y R-5ʹ-GGTACCCCATGGCTGTT GTG). El cambio en la expresión génica se evaluó según el método ΔΔCT.

La importancia estadística de los ensayos MTT, la espectroscopia de impedancia y la qRT-PCR se analizó mediante pruebas ANOVA de dos vías. Se consideraron significativos valores de p < 0,05. Se utilizó el software GraphPad Prism 8 para las pruebas estadísticas (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, EE. UU.).

Para la generación de modelos conjuntivales, primero se caracterizaron células epiteliales aisladas en un entorno 2D, en cuanto a su morfología y crecimiento. Se capturaron imágenes de campo claro de células epiteliales cultivadas en medio Pro1 en los pasajes (p) 1 a 5. Las células epiteliales conservaron la morfología de adoquines hasta p4, mientras que las células mostraron una morfología más diferenciada en p5, caracterizada por perder su morfología de adoquines y demostrar formas celulares más grandes y estiradas (Fig. 1A). El tiempo de duplicación de las células epiteliales se probó en tres medios diferentes: Pro1, E1 (medio EpiLife™ (E) + suplemento de crecimiento de queratinocitos humanos (HKGS) + penicilina/estreptomicina al 1 %) y A1. En los pases 2 y 3 anteriores, las células epiteliales mostraron el tiempo de duplicación más bajo cuando se cultivaron en medio A1, mientras que las células en Pro1 y E1 mostraron un tiempo de duplicación más bajo en los pases 4 y 5 en comparación con A1 (Fig. 1C).

Las células epiteliales conjuntivales primarias humanas conservan marcadores específicos y crecen in vitro. Caracterización microscópica de células epiteliales conjuntivales primarias humanas aisladas y su tiempo de duplicación en tres medios diferentes. (A) Imágenes microscópicas ópticas de células epiteliales de los pasajes (p) 2 a 5. Barra de escala = 100 µm. (B) Inmunofluorescencia (IF) de citoqueratina (CK) 13 y CK19 realizada en células epiteliales cultivadas en cubreobjetos de vidrio después de 6 días y 10 días. Azul = DAPI, verde = citoqueratina respectiva. Barra de escala = 100 µm. (C) Gráfico del tiempo de duplicación celular de células epiteliales en tres medios diferentes (Pro1, E1, A1) evaluados de p2 a p5 (media y desviación estándar, n = 3).

Las citoqueratinas (CK) 13 y 19 específicas de la conjuntiva se tiñeron positivamente mediante inmunofluorescencia después de 6 días y 10 días de cultivo 2D, mientras que más células fueron positivas para CK19 que para CK13 (Fig. 1B).

Se investigaron células epiteliales conjuntivales cultivadas en condiciones 3D con respecto a su desarrollo de epitelios multicapa y diferenciación celular. Las condiciones del medio utilizadas para el ensayo de crecimiento también se probaron en cultivo 3D de células epiteliales con la suplementación respectiva para el cultivo 3D (+ CaCl2, + KGF, AA2P, ver métodos). Después de establecer una interfaz aire-líquido, se evaluó rhConE después de 11 días, 15 días y 20 días mediante histología y ensayos MTT. Las tinciones H&E mostraron que la rhConE cultivada en las tres formulaciones de medio desarrolló un epitelio multicapa con células estratificadas en cada momento, junto con capas queratinizadas (Fig. 2A). Los ensayos de MTT se normalizaron al medio Pro3 y no mostraron diferencias significativas en la viabilidad entre los diferentes medios en cada momento del cultivo (Fig. 2C). Se realizó espectroscopia de impedancia no invasiva en modelos cultivados durante varios días durante el tiempo de cultivo, lo que demuestra la creciente integridad de la barrera de los modelos. Los análisis mostraron un aumento de barrera en los modelos de todas las condiciones probadas durante el tiempo de cultivo, mientras que TEER1000 Hz fue más alto cuando se cultivó en medio A3. Este efecto fue especialmente observable a partir de los 11 días (A3 = 1074 ± 424 Ω cm2, Pro3 = 291 ± 291 Ω cm2, E3 = 335 ± 186 Ω cm2), hasta que alcanzó un máximo significativo a los 18 días (A3 = 2992 ± 1259 Ω cm2, Pro3 = 1233 ± 874 Ω cm2, E3 = 1344 ± 442 Ω cm2) (Fig. 2D). Después de 20 días de cultivo, las barreras modelo de todas las condiciones mostraron valores TEER comparables.

Las células conjuntivales maduran en la interfaz aire-líquido y forman un epitelio multicapa. Evaluación de diferentes medios sobre epitelio conjuntival humano reconstruido (rhConE). (A) Análisis histológico mediante tinciones con hematoxilina y eosina (HE) de rhConE cultivada en medio Pro3, E3 o A3 después de 11 días, 15 días y 20 días. Barra de escala = 100 µm. (B) IF de CK1, CK13, CK14, CK19 realizado en rhConE cultivada en Pro3, E3 o A3 después de 15 días de cultivo. Azul = DAPI, verde = citoqueratina respectiva. Barra de escala = 100 µm. (C) Ensayo MTT de rhConE cultivada en medio E3 o A3 normalizado a modelos cultivados en Pro3 (n = 3). (D) Medición de la resistencia eléctrica transepitelial (TEER) 1000 Hz de rhConE cultivada en Pro3, E3 o A3 desde 6 días hasta 20 días de cultivo (n = 3). *p<0,05, ***p<0,001.

Para una evaluación adicional, IF investigó CK13, CK19 específicos de la conjuntiva, así como los marcadores epiteliales generales CK1 y CK14 después de 15 días en cultivo (Fig. 2B). Los marcadores epiteliales generales CK1 y CK14 fueron positivos para todas las formulaciones de medio y puntos temporales analizados. Si bien se detectó CK13 específica de la conjuntiva en todos los modelos, CK19 solo pudo detectarse en células individuales para todos los medios probados (Fig. 2B). En conjunto, los modelos epiteliales desarrollaron un epitelio multicapa apretado junto con una expresión de marcadores específicos. Sin embargo, en estos modelos se pudo observar queratinización patológica y no diferenciación de células caliciformes.

Para recrear el entorno conjuntival y alcanzar condiciones fisiológicas, generamos un equivalente de tejido conectivo combinando fibroblastos incrustados en colágeno tipo I con células epiteliales. Este cocultivo condujo a un epitelio multicapa estratificado de 7 a 9 capas de células, similar al modelo epitelial solo, pero sin queratinización. Además, las células epiteliales conjuntivales iniciaron una diferenciación generalizada de células caliciformes, a través de la cual generamos los principales tipos de células del epitelio conjuntival. Las células caliciformes se caracterizan porque su núcleo está ubicado en un polo de la célula, mientras que la mayor parte del volumen está lleno de gránulos de moco34. Esta caracterización morfológica se pudo observar dentro de FTConM, mientras que las tinciones con azul alciano y ácido periódico de Schiff (PAS) revelaron moco en las células caliciformes que se secretan en la parte superior del epitelio. Ambas tinciones comprenden la combinación óptima de PAS en la que los mucopolisacáridos neutros se tiñen de color púrpura mientras que el azul alcián tiñe las sustancias mucosas ácidas de color azul claro. Se observó una distribución uniforme de fibroblastos en la matriz de colágeno. A partir del día 10 de cultivo, se observaron claras diferencias morfológicas que indicaban diferenciación de células caliciformes, mientras que Alcianblue y PAS revelaron secreción de moco. Después de 15 días en cultivo, las células epiteliales se diferenciaron completamente hacia células caliciformes, formando vesículas llenas de moco (Fig. 3). En resumen, la introducción de un equivalente de tejido conectivo indujo la diferenciación de las células caliciformes y condujo a 7 a 9 capas de células en el epitelio FTConM en comparación con las 4 a 6 en rhConE.

La combinación de células epiteliales y equivalentes de tejido conectivo recreó la anatomía in vivo. Análisis histológico del modelo conjuntival de espesor total (FTConM). Las tinciones con H&E, Alcianblue y PAS se realizaron en modelos después de 10 días, 15 días y 20 días y en tejido conjuntival nativo. Barra de escala = 100 µm.

A continuación, se evaluó la expresión del marcador epitelial de FTConM mediante inmunofluorescencia. Las capas epiteliales se tiñeron para los marcadores de queratina CK1, CK13, CK14 y CK19. Todos los marcadores probados mostraron una señal positiva en cada momento del cultivo probado. Con la maduración del modelo, CK1 y CK14 se expresaron principalmente en células basales (día 20), lo que se asemeja a la expresión del tejido nativo. Se detectaron señales de los marcadores específicos de la conjuntiva CK13 y CK19 en todas las capas epiteliales y se pudieron comparar con las del tejido nativo (Fig. 2 frente a Fig. 4). La tinción de inmunofluorescencia de CK13 y especialmente de CK19 mostró otra influencia importante del equivalente de tejido conectivo. Mientras que rhConE mostró expresión de CK19 solo en células individuales (Fig. 2B), las células epiteliales en FTConM mostraron una alta expresión de CK19 en cada momento analizado (Fig. 4). Las uniones celulares se tiñeron con E-Cadherina, lo que indica una barrera celular. Además, el marcador vimentina específico de fibroblastos se tiñó positivamente para cada tiempo de maduración y también pudo compararse con el tejido nativo (Fig. 4).

Los modelos conjuntivales de espesor total (FTConM) mostraron expresión de marcadores in vivo. Tinción de inmunofluorescencia de CK1, CK13, CK14, CK19, Vimentina y E-Cadherina realizada en FTConM después de 10 días, 15 días y 20 días de cultivo. Azul = DAPI, verde = citoqueratina/vimentina respectiva, rojo = E-Cadherina. Barra de escala = 100 µm.

Si bien CK13 y CK19 son marcadores comunes para las células epiteliales conjuntivales, el marcador más común para las células caliciformes conjuntivales es MUC5AC, una mucina formadora de gel que contribuye a suavizar la superficie ocular, que investigamos mediante tinciones de inmunofluorescencia de montaje completo y análisis de expresión génica. La microscopía confocal de tinciones de montaje completo mostró una señal de MUC5AC alrededor de los núcleos y vesículas de células caliciformes llenas de MUC5AC (Fig. 5A, Datos complementarios S1). Además, mediante la tinción específica del epitelio de CK13 y MUC5AC, se podría mostrar dónde termina la capa basal y comienza el tejido conectivo (Fig. 5B, Datos complementarios S1), ya que esos marcadores se expresan únicamente en el epitelio conjuntival y no en el sustancia propia.

Los modelos conjuntivales de espesor total (FTConM) indujeron la formación de células caliciformes y la producción de moco. (A) Formación de células caliciformes en FTConM. Tinción de inmunofluorescencia de FTConM después de 20 días de cultivo. Azul = DAPI, verde = CK13, rojo = MUC5AC. Barra de escala = 50 µm. Primer plano de la barra de escala = 25 µm. (B) Imagen 3D de FTConM después de 20 días. Azul = DAPI, verde = CK13, rojo = MUC5AC. Flecha = celda caliciforme. Barra de escala = 100 µm. (C) Análisis cuantitativo por PCR en tiempo real de MUC5AC y MUC16 en comparación con el tejido conjuntival nativo. Diferencia significativa de la expresión de MUC16 entre los 15 días y el tejido nativo (n = 3, *p < 0,05). No hubo diferencias significativas entre 20 días y tejido nativo (n = 3, p = 0,491).

El análisis de la expresión génica de FTConM mostró expresión de MUC5AC en todos los puntos temporales de cultivo probados, mientras que el tejido nativo mostró una expresión significativamente mayor que el modelo (Fig. 5C).

MUC16 es una de las principales mucinas asociadas a la membrana de la superficie ocular y fue demostrada por Gipson et al. expresarse en células caliciformes conjuntivales9. El análisis cuantitativo mostró una diferencia significativa entre la expresión del modelo el día 15 y la del tejido nativo (p < 0,05). Sin embargo, se observó una tendencia al aumento de la expresión de MUC16 después de 20 días de cultivo en FTConM, sin mostrar diferencias significativas en los niveles de expresión en comparación con el tejido nativo (p = 0,491). En conjunto, pudimos demostrar que FTConM expresaba el marcador de células caliciformes conjuntivales MUC5AC y MUC16 a nivel de genes y proteínas.

Para demostrar qué factores son responsables de la inducción de la diferenciación de las células caliciformes en FTConM, se analizaron tres variables en comparación con rhConE: medios, colágeno y presencia de fibroblastos. Para excluir la influencia del medio, rhConE recibió medio Pro10 como FTConM. En comparación con el cultivo Pro3, rhConE mostró un aumento en las células basales en medio Pro10. Además de un aumento de 1 a 3 capas de células, la queratinización aumentó notablemente en los modelos cultivados con Pro10. Además, los modelos de rhConE cultivados en medio Pro10 mostraron células positivas para Alcianblue y PAS en todas las capas epiteliales, mientras que los modelos cultivados en medio Pro3 demostraron una tinción de PAS menos intensa (Fig. 6A). La inmunofluorescencia mostró señales positivas para CK1 y CK13 en todas las capas epiteliales, mientras que se detectó CK14 en las células basales. Cuando se cultivó en medio Pro10, rhConE mostró una mayor expresión de CK19 en todas las capas en comparación con las cultivadas en medio Pro3 (Fig. 6B frente a Fig. 2B). Los ensayos MTT confirmaron células viables en todos los modelos probados. En ambas condiciones probadas no se observó ningún impacto significativo en la viabilidad celular (Fig. 6C). A lo largo del tiempo de cultivo, la medición de TEER1000 Hz mostró un desarrollo de barrera independiente del medio empleado (Fig. 6D). Si bien los valores de TEER1000 Hz no mostraron diferencias significativas a lo largo del tiempo de cultivo, los modelos cultivados en Pro10 tendieron a una mayor impedancia el día 15 (Pro3 = 329 ± 208 Ω cm2 vs. Pro10 = 669 ± 170 Ω cm2) mientras que los modelos cultivados en Pro3 mostraron una mayor impedancia después 20 días (Pro3 = 1145 ± 208 Ω cm2 vs. Pro10 = 555 ± 156 Ω cm2). Estos resultados socavan la diferencia entre rhConE cultivada con Pro3 y Pro10 en puntos de tiempo de cultivo tardíos, como se observa en la evaluación histológica (Fig. 6A). A pesar de la mayor intensidad de tinción con PAS, la diferenciación de células caliciformes no se logró mediante el cultivo de modelos epiteliales en medio Pro10, lo que muestra la importancia del equivalente de tejido conectivo.

La suplementación con medio de rhConE no induce la diferenciación de células caliciformes. Prueba de medios de Pro3 frente a Pro10 en rhConE. (A) Análisis histológico de rhConE cultivada en Pro3 o Pro10 mediante H&E (dos columnas de la izquierda) y AB/P (dos columnas de la derecha) después de 10 días, 15 días y 20 días de cultivo. (B) Inmunofluorescencia de CK1, CK13, CK14 y CK19 realizada en rhConE cultivada en Pro10 después de 15 días. Azul = DAPI, verde = citoqueratina respectiva. Barra de escala = 100 µm. (C) Ensayo MTT de rhConE cultivada con Pro3 frente a Pro10 medida mediante densidad óptica de extinción de 570 nm (n = 3). (D) Medición TEER1000 Hz de rhConE cultivada en medio Pro3 o Pro10 durante el tiempo de cultivo desde 6 días hasta 20 días (n = 3).

En este estudio, desarrollamos un modelo de conjuntiva in vitro de espesor total que incluye un epitelio multicapa y células caliciformes secretoras de moco. Utilizamos células epiteliales primarias aisladas de biopsias conjuntivales humanas. Las células epiteliales retuvieron los marcadores epiteliales conjuntivales CK13 y CK19 y se propagaron hasta el pase 5 en cultivo 2D, lo que permitió un suministro suficiente de material celular para la generación del modelo. Los diferentes medios probados solo mostraron una influencia menor en las células, lo que demuestra que HKGS (Medio E), Extracto de pituitaria bovina (Medio Pro y A) y Factor de crecimiento epitelial corneal (Medio A) no cambian enormemente el tiempo de duplicación en Células epiteliales conjuntivales 2D. Esos factores tampoco contribuyeron a la diferenciación de las células caliciformes en rhConE 3D.

Las células epiteliales desarrollaron un epitelio multicapa diferenciado, como lo indica una función de barrera creciente durante el cultivo y la expresión de proteínas de los marcadores CK13 y CK19. Las tinciones H&E revelaron que rhConE formaba hasta seis capas de células, mientras que las capas superiores se queratinizaban. En general, la queratinización del tejido conjuntival in vivo es causada por eventos patológicos, por ejemplo, por deficiencia de vitamina A o síndrome de Sjögren35,36. En nuestros modelos in vitro, es más probable que condiciones de cultivo subóptimas condujeran a la queratinización. Los diferentes medios no mejoraron estas características no fisiológicas, lo que sugiere que faltan otras señales que impiden el desarrollo del tejido modelo natural. Por lo tanto, se incluyeron en el modelo factores de apoyo como la matriz extracelular (MEC) y los fibroblastos, ya que se sabe que la diferenciación y el desarrollo tisular pueden verse afectados por ellos37,38.

Para generar un equivalente de tejido conectivo reproducible, utilizamos un hidrogel de colágeno I comprimido con fibroblastos conjuntivales incrustados en combinación con células epiteliales. En FTConM, se observó un epitelio multicapa, que demuestra células caliciformes llenas de moco y liberadoras de moco. Al mismo tiempo ya no se observó queratinización, lo que indica condiciones de cultivo óptimas para la maduración del tejido. La diferenciación de las células caliciformes se demostró mediante morfología, tinciones con azul alcián y PAS y detección de MUC5AC, el marcador más común de células caliciformes conjuntivales que se expresan y secretan1. Además de una evaluación cualitativa de las células caliciformes, se analizaron MUC5AC y MUC16 mediante RT-qPCR. Ambos marcadores se expresaron en el modelo en todos los puntos temporales de cultivo probados. Para una comparación adicional entre rhConE y el tejido nativo, se investigó la expresión de citoqueratina de CK1, CK13, CK14 y CK19 en FTConM. Mientras que CK1 y CK14 se expresaron principalmente en células basales con la maduración del modelo, CK13 y CK19 se expresaron en todas las capas epiteliales. En comparación con rhConE, las señales detectadas de CK19 fueron claramente más fuertes en FTConM, lo que indica que FTConM proporciona un entorno que permite un desarrollo más natural del tejido.

La comparación entre rhConE y FTConM demuestra la importancia de un equivalente de tejido conectivo, que permitió la diferenciación de las células caliciformes y, por lo tanto, mejoró de manera crucial nuestro modelo conjuntival. Los factores que influyen en la diferenciación de las células caliciformes se pueden reducir a tres componentes principales. Nuestro equivalente de tejido conectivo incluía colágeno I y fibroblastos conjuntivales junto con suplementos medios adicionales. Mientras que rhConE recibió medio Pro3, FTConM recibió medio Pro10, que además incluye factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGF2) y pequeñas cantidades de suero de ternera fetal (FCS). En un estudio de 2020, Yokoo et al. demostraron que FGF2 puede participar en la diferenciación de las células caliciformes conjuntivales39. En rhConE, la suplementación con FGF2 en medio Pro10 no indujo la diferenciación de células caliciformes. Por otro lado, con el tiempo de cultivo continuo, se observó un aumento en las células basales en rhConE cultivada con Pro10. Las capas queratinizadas de Pro10 rhConE comenzaron a aflojarse y flotar después de 15 a 20 días de cultivo, mientras que las células eran positivas para AB/P. Estos resultados sugieren que la suplementación con medios tuvo un efecto sobre rhConE pero no desplazó completamente las células epiteliales hacia la diferenciación de células caliciformes.

En un estudio reciente, Nomi et al. Demostró que el factor de crecimiento de queratinocitos (KGF) es crucial para el desarrollo de iPSC humanas a células epiteliales conjuntivales, especialmente células caliciformes28. En nuestro modelo rhConE, la suplementación con KGF por sí sola no indujo este efecto, lo que indica que se necesitan factores adicionales para las células primarias. Los fibroblastos cocultivados también podrían tener un impacto importante en la diferenciación. Tsai et al. demostró que el uso de fibroblastos conjuntivales en un gel de colágeno I condujo a células Alcianblue y PAS positivas, incluida una morfología similar a la de células caliciformes, mientras que un cocultivo con células 3T3 condujo a un epitelio de capa superior, pero no a Alcianblue y PAS positivo. células15. Estos resultados sugieren que los fibroblastos conjuntivales expresan factores que inducen la diferenciación de las células caliciformes. El efecto positivo de los fibroblastos cocultivados en un hidrogel de colágeno también podría demostrarse en nuestro FTConM. Estos hallazgos sugieren que una combinación de factores de crecimiento suplementarios y secretados por fibroblastos y ECM es importante para recapitular el desarrollo natural del tejido conjuntival. En nuestro modelo logramos un entorno que permite dicho desarrollo natural. Por lo tanto, los factores clave de la diferenciación de las células caliciformes se pueden descifrar aún más. Además, nuestro modelo puede proporcionar una herramienta para nuevas oportunidades para la reducción de las pruebas con animales de enfermedades conjuntivales.

La combinación de un epitelio multicapa que incluye células caliciformes con estructuras en forma de copa y expresión de MUC5AC enfatiza la homeostasis fisiológica y la diferencia de los otros modelos conjuntivales in vitro. Los modelos conjuntivales in vitro actuales muestran la expresión de marcadores específicos como CK19 y MUC5AC. Sin embargo, la falta de estructuras en forma de copa llenas de moco y la tinción específica de MUC5AC o la visualización de un epitelio multicapa después de la diferenciación implican la falta de señales de su fisiología natural14,27,40. La combinación de todos los factores fisiológicos similares en un modelo in vitro es un desafío. Witt et al. pudieron lograrlos en un modelo de explante de conjuntiva humana in vitro en conjuntiva porcina decelularizada16. Usando el explante, se observaron células caliciformes positivas para AB/P, aunque MUC5AC solo pudo teñirse en puntos individuales del modelo. Estos resultados no fueron reproducibles, ya que se utilizaron células epiteliales aisladas en el armazón en lugar de un explante16. No obstante, el modelo de explante es prometedor para sus propósitos clínicos que abordan métodos regenerativos para la cicatrización conjuntival. Sin embargo, para la investigación de enfermedades conjuntivales in vitro, un modelo sin explante sería más adecuado debido a la mejor reproducibilidad y obtención del equivalente de tejido conectivo, basado en un hidrogel de colágeno definido. Una vez que se hayan descifrado todos los factores clave que transforman las células epiteliales conjuntivales en el cultivo 3D en una diferenciación de células caliciformes, esas condiciones de cultivo se pueden adoptar en diversos campos de investigación del cultivo conjuntival in vitro y acercar los modelos 3D a un paso crucial hacia la semejanza fisiológica y, por lo tanto, a mayor predictibilidad de las pruebas de drogas y modelos de enfermedades. Además, se están desarrollando e investigando modelos para la investigación de la fibrosis conjuntival después de la cirugía de glaucoma. Más recientemente, Kozdon et al desarrollaron un modelo de interfaz cápsula de espiga/conjuntiva bulbar que contiene macrófagos. y fue probado sobre sus propiedades mecánicas41. En combinación con nuestro modelo, dichos experimentos podrían desarrollarse aún más con un epitelio completamente funcional para analizar la interacción de la fibrosis con las células epiteliales en un modelo 3D in vitro.

En nuestro estudio pudimos combinar todos los factores específicos de la conjuntiva, incluidos los epitelios multicapa estratificados que contienen células caliciformes. La expresión de marcadores específicos de la diferenciación de células epiteliales conjuntivales se confirmó a nivel de proteína (inmunofluroescencia) y ARNm (RT-qPCR). Pudimos mostrar vasos llenos de células caliciformes con MUC5AC mediante microscopía confocal. Debido al uso de un equivalente estromal, nuestro modelo aumenta la reproducibilidad y aplicabilidad de los estudios conjuntivales in vitro. En el futuro, este modelo podría emplearse para la investigación de diferentes causas de enfermedades conjuntivales con el fin de proporcionar una base derivada de humanos altamente predictiva para estudios clínicos con el beneficio adicional de reducir los experimentos con animales.

Los conjuntos de datos generados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a solicitud razonable.

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Centro traslacional de terapias regenerativas (TLC-RT), Instituto Fraunhofer de Investigación sobre Silicatos (ISC), Würzburg, Alemania

Julian Schwebler, Christina Fey y Christian Lotz

Cátedra de Ingeniería de Tejidos y Medicina Regenerativa (TERM), Hospital Universitario de Würzburg, Würzburg, Alemania

cristian lotz

Departamento de Oftalmología, Hospital Universitario de Würzburg, Würzburg, Alemania

Julian Schwebler y Daniel Kampik

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JS escribió el manuscrito principal y realizó todos los experimentos, parcialmente junto con otros autores. CF llevó a cabo el experimento 5 y creó cifras afiliadas y datos complementarios. DK proporcionó material biológico y supervisó los experimentos. CL proporcionó material para todos los experimentos y supervisó los experimentos. Todos los autores contribuyeron a la redacción y revisión del manuscrito.

Correspondencia a Christian Lotz.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Schwebler, J., Fey, C., Kampik, D. y col. El modelo de conjuntiva in vitro 3D de espesor completo permite la diferenciación de células caliciformes. Informe científico 13, 12261 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-38927-8

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Recibido: 25 de abril de 2023

Aceptado: 17 de julio de 2023

Publicado: 28 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-38927-8

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