NVS

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 11795 (2023) Citar este artículo

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NVS-ZP7-4 fue identificado como un nuevo reactivo químico dirigido a la proteína de entrada de zinc ZIP7, que explica el aumento de zinc desde el aparato hasta el citoplasma. Dado que la desregulación del zinc está relacionada con múltiples enfermedades, en este estudio nuestro objetivo fue identificar los efectos antitumorales de NVS-ZP7-4 y explorar los mecanismos moleculares de NVS-ZP7-4 en la progresión del carcinoma hepatocelular (CHC). Descubrimos que NVS-ZP7-4 inhibía la viabilidad celular, provocaba la detención del ciclo celular, inducía la apoptosis e inhibía la proliferación, migración e invasión de células HCCLM3 y Huh7. Investigamos más a fondo que la activación inhibida de la vía fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) / Akt estaba involucrada en el efecto antitumoral de NVS-ZP7-4 en el CHC. Además, NVS-ZP7-4 inhibió el crecimiento del tumor HCC in vivo. El presente estudio demostró que NVS-ZP7-4 es un objetivo terapéutico prometedor para el CHC al regular la señalización PI3K/AKT.

ZIP7 es una proteína de entrada de zinc anclada en el aparato de Golgi/ER y representa el aumento de zinc desde el aparato al citoplasma. NVS-ZP7-4 ha sido identificado como un reactivo químico novedoso que se dirige a ZIP7, lo que resulta en la acumulación de zinc en el ER1,2,3,4. Es importante destacar que el zinc es conocido como coefector de más de 300 enzimas y desempeña un papel vital en la regulación de la función celular. La desregulación del zinc se asocia con múltiples enfermedades, incluidas la inmunodeficiencia y los tumores5,6. Estudios recientes también han demostrado una expresión y activación aberrantemente mayor de ZIP7 en algunos tumores malignos, incluido el cáncer de mama resistente al tamoxifeno, el cáncer de esófago, el cáncer de pulmón, el cáncer de próstata, el cáncer gástrico y el carcinoma hepatocelular (CHC)7,8,9. Por lo tanto, NVS-ZP7-4 podría mejorar la eficiencia del tratamiento al bloquear ZIP7 y detener el aumento de zinc. Sin embargo, los estudios sobre la eficacia terapéutica y los mecanismos subyacentes de NVS-ZP7-4 en tumores son raros.

El CHC sigue siendo un desafío de salud importante en todo el mundo y es crucial desarrollar estrategias de tratamiento efectivas para el CHC10,11. La apoptosis desregulada es un impulsor fundamental del desarrollo del CHC. Por ejemplo, los ratones con ablación del receptor nuclear TAK1 y serina/treonina-proteína quinasa 3 que interactúan con el receptor en células parenquimatosas del hígado desarrollaron pasividad a la apoptosis, lo que demostró ser una transversión esencial hacia la malignidad12,13. Por lo tanto, apuntar a la apoptosis es una estrategia farmacológica alternativa y factible para el tratamiento del CHC14,15,16. La apoptosis inducida por sorafenib se ha identificado en múltiples tumores y tiene funciones terapéuticas en el CHC17,18. Es importante destacar que un estudio previo confirmó que la desactivación del gen ZIP7 aumentaba significativamente la apoptosis celular, como en el caso de las células de cáncer colorrectal y de cáncer de cuello uterino19,20. Por lo tanto, es esencial explorar la eficiencia y los mecanismos moleculares del inhibidor de ZIP7 NVS-ZP7-4 en el crecimiento y la progresión del CHC para identificar nuevas terapias.

La vía de señalización fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K)/AKT está genéticamente alterada y activada en cánceres humanos, y participa en el metabolismo, la proliferación y la supervivencia acelerados del cáncer21,22,23,24,25,26. Los investigadores han demostrado que la activación de AKT es fundamental para el desarrollo de CHC en modelos de ratón27,28. Es de destacar que el zinc ha sido identificado como un segundo mensajero esencial en la biofunción celular29, y la acumulación de zinc citoplasmático inhibe las fosfatasas, previene la desfosforilación de los receptores de tirosina quinasa29,30 y da como resultado la activación de la vía PI3K31. Con base en este conocimiento, la inhibición del aumento de zinc en el citoplasma por NVS-ZP7-4 podría proporcionar una nueva estrategia de tratamiento dirigida a la señalización de PI3K/AKT en el CHC.

Hasta donde sabemos, la eficacia del tratamiento y los mecanismos subyacentes de NVS-ZP7-4 no se han explorado en el campo del CHC; por lo tanto, nuestro objetivo fue revelar las funciones antitumorales de NVS-ZP7-4 y sus mecanismos subyacentes en el tratamiento del CHC por primera vez y proporcionar un tratamiento novedoso y prometedor para el CHC.

Todos los métodos se realizaron de acuerdo con las directrices y regulaciones pertinentes.

NVS-ZP7-4 purificado (98,68%) (Cat: HY-114395) y el activador PI3K 740 YP (HY-P0175) se adquirieron de MedChemExpress (Nueva Jersey, EE. UU.). Los anticuerpos para la transferencia Western utilizados en el presente estudio fueron PARP1 (1:1000, Abclone, China), BCL2 (1:2000, Proteintech, China), caspasa-3 (1:1000, Abclone), caspasa-3 escindida (1: 200, Sigma, EE. UU.), α-tubulina (1:10.000, Proteintech), BAX (1:10.000, Proteintech), AKT (1:1.000, Proteintech), p-AKT (1:1.000, Proteintech), ciclina D1 ( 1:1.000, Proteintech) y p-ZIP7 (1:1.000, Sigma), ZIP7 total (1:1.000, Proteintech).

Para este estudio se utilizaron células Huh7 (carcinoma hepatocelular adulto), HCCLM3 (carcinoma hepatocelular adulto) y se compraron en la Academia China de Ciencias (Shanghai, China). Las células se incubaron con medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; Gibco, EE. UU.), suero bovino fetal al 10 % (FBS; Gibco, EE. UU.) y solución de penicilina-estreptomicina al 10 % a 37 °C, 5 % de CO2 y humedad estándar. Los hepatocitos primarios de ratón se aislaron utilizando hígado de ratón desnudo BALB/c según un protocolo informado32. En primer lugar, el hígado se perfundió utilizando una solución salina equilibrada de Hanks sin Ca2+ y Mg2+ (HBSS, Sigma) a través de la vena porta. En segundo lugar, el hígado se perfundió con una solución de colagenasa I al 0,1 % (Sigma) en HBSS que contenía Ca2+ y Mg2+. Al cabo de unos minutos, se extirpó el hígado y se dispersó en HBSS frío. La suspensión celular se generó y se filtró a través de un filtro celular de nailon con un tamaño de poro de 70 μm (Sigma). El sobrenadante celular se centrifugó y los sedimentos se resuspendieron en DMEM con FBS al 10%. Las células se cultivaron para experimentos adicionales.

Para determinar la viabilidad celular después del tratamiento con NVS-ZP7-4, se utilizó el kit de recuento celular-8 (CCK-8) para medir la viabilidad de las células Huh7, HCCLM3 y los hepatocitos primarios de ratón después de diferentes tratamientos. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos (5 x 103/pocillo) y se trataron con NVS-ZP7-4 o DMSO durante 24 h. Luego se añadió solución de CCK-8 a cada pocillo (10 μl/100 μl) y se incubó durante 2 h a 37 °C. La absorbancia se midió a una longitud de onda de 450 nm. Viabilidad celular (%) = [Absorber(fármaco) − Absorber(blanco)]/[Absorber(control) − Absorber(blanco)].

Para la proliferación celular, las células se sembraron en placas de 96 pocillos (5 x 103/pocillo) y se trataron con diferentes reactivos. Después de 0 h, 24 h, 48 h, 72 h, a las células se les añadió solución CCK-8 (10 μL/100 μL) y se incubaron durante 2 h a 37 °C. La absorbancia se midió a una longitud de onda de 450 nm.

Las células se trataron con NVS-ZP7-4 o DMSO durante 24 h antes de la detección de la apoptosis. Las suspensiones celulares se recogieron y se tiñeron con anexina V y yoduro de propidio (PI) en la oscuridad durante 15 minutos, y luego las células se analizaron con un citómetro de flujo.

Las células se sembraron en placas de 6 pocillos y se trataron con diversas concentraciones de NVS-ZP7-4 o DMSO durante 24 h. Se recogieron suspensiones celulares, se tiñeron con PI y se analizaron mediante citometría de flujo celular.

Las células se sembraron a razón de 1.000 células/pocillo en placas de seis pocillos para el ensayo de formación de colonias. Después de aproximadamente 2 semanas de cultivo, las células se fijaron con paraformaldehído al 4% y se tiñeron con cristal violeta al 0,1%. Se fotografiaron y contaron las colonias visibles (diámetro > 0,1 mm).

Se realizó un ensayo de 5-etinil-2′-desoxiuridina (EdU) (RIB-BIO) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, las células se inocularon en una placa de 96 pocillos, se incubaron con reactivo EdU-A 50 nM durante 2 h y luego se fijaron y teñiron con solución Apollo y solución Hoechst3342. Para la fotografía se utilizó un microscopio de fluorescencia AXIO Vert A1 (Carl Zeiss AG).

Sólo para los ensayos de invasión de Transwell, las cámaras superiores se recubrieron con una película Matrigel (Corning, EE. UU.) a 37 °C durante la noche antes de su uso. Tanto para los ensayos de migración como de invasión de Transwell, las células se trataron previamente con NVS-ZP7-4 o DMSO durante 24 h y se resuspendieron en DMEM. Se volvieron a sembrar suspensiones (200 μl) en la cámara superior y se agregaron a cada pocillo 750 μl de DMEM con 10% de FBS. Las células se fijaron con paraformaldehído al 4% después de 48 h. Las células que cruzaron la membrana se registraron utilizando un EVOS XL Core Instrument (AMEX1000, Thermo Fisher Scientific, EE. UU.) con aumentos de 100 × y 200 ×.

Las células se inocularon en placas de 6 pocillos y se trataron con diferentes reactivos durante 24 h. Luego, las células se recogieron y se lisaron durante 30 minutos con tampón RIPA (Beyotime, Shanghai, China). El sobrenadante se recogió después de centrifugación a 1,5 x 104 rpm durante 20 min. La concentración de proteína se detectó utilizando un kit BCA (Beyotime) y se hirvió con tampón de carga (Beyotime) durante 5 minutos. Se utilizaron geles SDS-PAGE (12% o 10%) para la electroforesis de proteínas y las proteínas se transfirieron a membranas de PVDF (Millipore, MA, EE. UU.). Las membranas se bloquearon y se incubaron con anticuerpos, y se utilizó Super Signal West Atto (Thermo Scientific, MA, EE. UU.) para la detección de señales.

Se criaron ratones desnudos BALB/c machos de cinco semanas de edad (SJA Laboratory Animal Co. Ltd., Hunan, China) en condiciones estándar de temperatura, luz y libre acceso a agua y alimentos. A los ratones se les inyectaron por vía subcutánea 100 μl de células Huh7 (2 x 106 células) para establecer un modelo de ratón con CHC subcutáneo. Los ratones se dividieron aleatoriamente en dos grupos (n = 5): el grupo de control recibió inyecciones intraperitoneales de DMSO (0,1% en PBS, 2 ml/kg) tres veces por semana, y el grupo NVS-ZP7-4 recibió NVS-ZP7. -4 (1 mg/kg) tres veces por semana. Los ratones fueron anestesiados con pentobarbital y sacrificados 2 semanas después. Se registraron los pesos corporales y de los tumores y se recogieron tejidos tumorales para análisis inmunohistoquímicos adicionales. El estudio fue aprobado por los Comités Institucionales de Ética de Investigación del Hospital de Tumores Afiliado de la Universidad Médica de Xinjiang (K-2021024). Los ratones fueron sacrificados mediante dislocación cervical. El estudio se informó de acuerdo con las pautas de ARRIVE.

Se recogieron tejidos tumorales de ratones HCC tratados con NVS-ZP7-4 o DMSO para detectar la expresión de AKT (1:200), p-AKT (1:200), antígeno nuclear de células proliferantes (PCNA) (1:500), y caspasa-3 escindida (1:20). Las secciones de parafina se desparafinaron y se hirvieron en una solución de citrato para la reparación del antígeno. Luego, se añadió peróxido de hidrógeno al 0,3% y los anticuerpos se incubaron durante la noche. Luego, las secciones se incubaron con anticuerpos secundarios, se tiñeron con kits de tinción DAB (ZSGB-BIO, Beijing, China), se tiñeron con hematoxilina y finalmente se sellaron con bálsamo neutro (Proteintech, China).

Las secciones de parafina se desparafinaron, se tiñeron sucesivamente con hematoxilina y solución de eosina al 0,5%, se deshidrataron y se sellaron con bálsamo neutro.

Para los exámenes in vitro e in vivo, los datos se presentan como media ± desviación estándar, con al menos tres repeticiones. Se utilizó ANOVA para medir las diferencias entre grupos, con un valor de p significativo de <0,05. Todos los análisis se realizaron con GraphPad Prism 8 (GraphPad Software, San Diego, CA, EE. UU.).

El estudio fue aprobado por los Comités Institucionales de Ética de Investigación del Hospital de Tumores Afiliado de la Universidad Médica de Xinjiang (K-2021024).

Las células Huh7 se trataron con NVS-ZP7-4 (estructura química que se muestra en la Fig. 1A) de diferentes concentraciones (0, 0,0625, 0,125, 0,25, 0,5, 1 μM). Con una concentración de 0,5 y 1 μM, NVS-ZP7-4 mostró los mejores efectos para inhibir la proliferación de células Huh7 en la proliferación celular (Fig. 1B). Se utilizaron células HCCLM3, Huh7 y hepatocitos primarios de ratón para detectar el efecto de NVS-ZP7-4 sobre la viabilidad celular. Los resultados para las líneas celulares cancerosas se muestran en la Fig. 1. Las Figuras 1C y D muestran que las células HCCLM3 y Huh7 mostraron una viabilidad celular disminuida después del tratamiento con NVS-ZP7-4 de una manera dependiente de la dosis. Curiosamente, el análisis de citotoxicidad mostró que NVS-ZP7-4 era relativamente menos citotóxico para los hepatocitos primarios de ratón, lo que sugiere la hipotoxicidad de NVS-ZP7-4 para las células hepáticas normales (Fig. 1E). Para experimentos adicionales, utilizamos concentraciones de 0,5 y 1 μM en células HCCLM3 y Huh7, y utilizamos DMSO al 0,08% como control. El efecto de NVS-ZP7-4 sobre la proliferación de células HCCLM3 y Huh7 se detectó mediante ensayos de formación de colonias y EdU. El número de colonias y el número de células EdU positivas se inhibieron significativamente de manera dependiente de la dosis (Fig. 2), lo que sugiere que NVS-ZP7-4 inhibió significativamente el crecimiento de células HCC.

El efecto de NVS-ZP7-4 sobre la actividad inhibidora del crecimiento en células HCCLM3, Huh7 y hepatocitos primarios de ratón. (A) La estructura química de NVS-ZP7-4. Las células Huh7 (B) se trataron con NVS-ZP7-4 (0, 0,0625, 0,125, 0,25, 0,5, 1 μM), el valor de DO se analizó mediante CCK-8. Las células HCCLM3 (C) Huh7 (D) y los hepatocitos primarios de ratón (E) se trataron con NVS-ZP7-4 (0, 0,5, 1 μM) durante 24 h. ns = sin significancia, **p < 0,01, ***p < 0,001 versus Control.

El efecto de NVS-ZP7-4 sobre la proliferación de células HCC. Imágenes representativas de colonias celulares (A) y cuantificación (B) de células HCCLM3 y Huh7. Imágenes representativas de EdU (C) y cuantificación (D) de células HCCLM3 y Huh7. Las células HCCLM3 y Huh7 se trataron con NVS-ZP7-4 (0, 0,5, 1 μM) durante 24 h. **p < 0,01; ***p < 0,001 frente al control.

La vía PI3K/AKT puede prevenir la muerte programada de las células tumorales e inhibir la apoptosis, promoviendo así la supervivencia de las células tumorales. En primer lugar, las células positivas para apoptosis se indujeron significativamente de una manera dependiente de la dosis, como se muestra en las figuras 3A y B. En segundo lugar, p-ZIP7 se reprimió significativamente después del tratamiento con NVS-ZP7-4 en células HCCLM3 y Huh7, pero no logró regular la expresión de ZIP7 en las celdas. Y luego examinamos el efecto de NVS-ZP7-4 sobre la escisión de PARP1, que forma parte de la cascada apoptótica. Las proteínas antiapoptóticas dentro de las células, como BCL2, deben ser superadas y se debe activar BAX para inducir la apoptosis. Consistentemente, como se muestra en la Fig. 3C, las células D HCCLM3 y Huh7 tratadas con NVS-ZP7-4 tuvieron niveles significativamente reducidos de proteína PARP1, caspasa-3 y BCL2, así como niveles mejorados de caspasa-3 escindida y proteína BAX. expresión. Estos datos indican que NVS-ZP7-4 activa la apoptosis dependiente de caspasa en células HCCLM3 y Huh7. Además, el tratamiento con NVS-ZP7-4 in vivo indujo la expresión de caspasa-3 escindida en un modelo de ratón desnudo con xenoinjerto (Fig. 7D).

NVS-ZP7-4 indujo apoptosis en células HCC. La apoptosis se evaluó (A) y se cuantificó (B) mediante citometría de flujo. Las proteínas centrales en la apoptosis se detectaron mediante transferencia Western. Bandas representativas (C) y cuantificación (D) para la expresión de proteínas ZIP7, p-ZIP7, BAX, BCL2, caspasa-3, caspasa-3 escindida y PARP1 mediante análisis de transferencia Western. Las células HCCLM3 y Huh7 se trataron con NVS-ZP7-4 (0, 0,5, 1 μM) durante 24 h. ns = sin significancia, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 versus Control.

Para determinar los mecanismos subyacentes a la inhibición de NVS-ZP7-4 en la proliferación celular, se utilizó citometría de flujo para analizar el contenido de ADN para el análisis del ciclo celular. Como se muestra en la Fig. 4, en las líneas celulares HCCLM3 y Huh7, NVS-ZP7-4 indujo un aumento en la proporción de células en la fase G1 y una disminución en las de la fase G2, S. Estos resultados revelaron que NVS-ZP7-4 indujo la detención del ciclo celular en la fase G1 y tuvo un efecto antiproliferativo en las líneas celulares HCCLM3 y Huh7.

El efecto de NVS-ZP7-4 sobre el ciclo celular de las células HCC. (A) El tratamiento con NVS-ZP7-4 indujo una disminución dependiente de la dosis en la proporción de células en las fases G2 y S en comparación con el control. **p < 0,01, ***p < 0,001 frente al control.

La señalización PI3K/AKT también participa en las metástasis relacionadas con el cáncer; por lo tanto, para determinar el efecto de NVS-ZP7-4 sobre la migración e invasión de células HCC, realizamos ensayos de migración e invasión en células HCCLM3 y Huh7. Como se esperaba, NVS-ZP7-4 inhibió significativamente la migración e invasión de células HCCLM3 y Huh7 de una manera dependiente de la concentración (Fig. 5).

El efecto de NVS-ZP7-4 sobre la migración e invasión de células HCC. Imágenes representativas (A) y cuantificación (B) del ensayo de invasión y migración de Transwell. Las células HCCLM3 y Huh7 se trataron con NVS-ZP7-4 (0, 0,5, 1 μM) durante 24 h. Barras de escala: 100 μm. ***p < 0,001 frente al control.

Se ha identificado que la señalización PI3K/AKT desempeña un papel central en la proliferación de células tumorales y la viabilidad celular; por lo tanto, para dilucidar los mecanismos subyacentes del efecto antitumoral de NVS-ZP7-4, investigamos más a fondo los efectos de NVS-ZP7-4 en la vía PI3K/AKT en células HCCLM3 y Huh7 mediante transferencia Western. Las células HCCLM3 y Huh7 se trataron con DMSO, NVS-ZP7-4 1 μM, activador PI3K 740 YP o una combinación de NVS-ZP7-4 1 μM y 740 YP. Como se muestra en la Fig. 6A, B, nuestros resultados indicaron que NVS-ZP7-4 podría suprimir significativamente la expresión de p-AKT y p-ZIP7 en células HCCLM3 y Huh7; sin embargo, la expresión de AKT y ZIP7 no mostró un cambio significativo. Además, se utilizó el activador PI3K para evaluar el efecto regulador de NVS-ZP7-4 en la vía PI3K/AKT. El bloqueo de NVS-ZP7-4 en PI3K/AKT fue atenuado por el activador de PI3K, mostrando una expresión elevada de p-AKT. Además, se utilizaron células Huh7 para experimentos adicionales. Como se muestra en la Fig. 6, NVS-ZP7-4 podría inducir significativamente la apoptosis de las células Huh7, disminuir la proporción de células en la fase G2, S y reprimir la proliferación celular, y esa regulación fue atenuada por el activador PI3K, mostrando una disminución de la apoptosis, aumento de la proliferación celular. proliferación y proporción de células en fase G2, S. Además, el tratamiento con NVS-ZP7-4 in vivo inhibió la expresión de p-AKT en un modelo de ratón desnudo con xenoinjerto (Fig. 7D). En conclusión, estos resultados sugieren que NVS-ZP7-4 inhibe significativamente la activación de la señalización PI3K/AKT y regula el destino celular (Figuras complementarias).

NVS-ZP7-4 inhibió la vía PI3K/AKT en células HCC. Las células HCCLM3 y Huh7 se trataron con DMSO, NVS-ZP7-4 1 μM, activador PI3K 740 YP o una combinación de NVS-ZP7-4 1 μM y 740 YP. (A,B) Análisis de transferencia Western de los genes dirigidos a las vías p-ZIP7, ZIP7 y PI3K/AKT p-AKT, AKT en células HCCLM3 y Huh7 después de un tratamiento diferente. (C,D) La apoptosis se evaluó (C) y se cuantificó (D) mediante citometría de flujo. (E) El ciclo celular se evaluó y cuantificó mediante citometría de flujo. (F) La proliferación celular se detectó mediante CKK-8 a las 0 h, 24 h, 48 h, 72 h. ns = sin significancia, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 versus Control. #p < 0,05, ##p < 0,01; ###p <0,001 frente al NVS-ZP7-4 de 1 μM.

NVS-ZP7-4 inhibió el HCC in vivo. (A, B) Formación de tumores subcutáneos en tumores de xenoinjerto Huh7 en ratones inyectados intraperitonealmente con NVS-ZP7-4 o DMSO durante 2 semanas. (C) Se mostró la cuantificación del peso del tumor. (D) Tinción HE representativa, p-AKT y el marcador de proliferación PCNA, el marcador de apoptosis escindió la caspasa-3 de xenoinjertos tratados con NVS-ZP7-4 y DMSO. Barras de escala: 100 μm. *p < 0,05 frente al control.

Se establecieron ratones desnudos BALB/c para imitar la eficacia terapéutica de NVS-ZP7-4 en el CHC. Los resultados in vivo mostraron que el tratamiento con NVS-ZP7-4 inhibió significativamente el peso del tumor Huh7 (Fig. 7A-C). La expresión de PCNA está fuertemente relacionada con la síntesis de ADN como cofactor de la ADN polimerasa δ, por lo que se correlaciona notablemente con el estado de proliferación celular. En nuestro estudio, también se detectó una disminución de la expresión de PCNA en tejidos tumorales de xenoinjerto en el modelo de xenoinjerto tratado con NVS-ZP7-4, lo que sugiere que NVS-ZP7-4 inhibió significativamente la proliferación in vivo (Fig. 7D). Estos resultados implicaron que NVS-ZP7-4 es un agente terapéutico potencial para el tratamiento del CHC.

El CHC es la causa de muerte relacionada con el cáncer de más rápido crecimiento en los EE. UU., con la mayor mortalidad e incidencia en el este de Asia y África; por lo tanto, es crucial desarrollar una estrategia de tratamiento válida para el CHC10,11. Se descubrió por primera vez que NVS-ZP7-4 inhibía ZIP7 en la leucemia linfoblástica aguda de células T y se investigó más a fondo como un tratamiento novedoso para tumores malignos3. Nuestros datos demostraron que NVS-ZP7-4 inhibe el crecimiento del CHC tanto in vitro como in vivo, y puede ser un objetivo terapéutico prometedor para el CHC. La proliferación continua, la replicación permanente y la invasión y metástasis activadas son características esenciales del cáncer, que dotan a las células de malignidad33. El CHC también comparte las características vitales de una rápida proliferación y un alto grado de metástasis relacionadas con el cáncer10. En nuestro estudio, revelamos que NVS-ZP7-4 inhibía la proliferación, invasión y migración celular de células Huh7 y HCCLM3, lo que respalda la eficacia terapéutica de NVS-ZP7-4. También demostramos que NVS-ZP7-4 provoca la detención de la fase G1 e induce la apoptosis, lo que podría contribuir a la inhibición del crecimiento.

La resistencia del cáncer a la apoptosis es esencial en la tumorigénesis; por lo tanto, centrarse en el proceso de apoptosis podría proporcionar varias terapias novedosas en oncología33. Por ejemplo, la combinación del oligonucleótido antisentido inhibidor de la apoptosis ligado al cromosoma X (AEG35156) con el fármaco dirigido de primera línea sorafenib dio lugar a un aumento moderado de la supervivencia libre de progresión y de la supervivencia general en comparación con el tratamiento con sorafenib solo34. Sin embargo, aunque los mecanismos de las vías de apoptosis tanto intrínsecas como extrínsecas se han elaborado recientemente, todavía es difícil identificar y seleccionar proteínas apoptóticas centrales para terapias dirigidas eficientes35,36; por lo tanto, se deben investigar nuevos tratamientos para una mayor detección clínica y preclínica. En nuestro estudio, confirmamos la inducción de apoptosis después del tratamiento con NVS-ZP7-4, lo que fue consistente con un estudio previo en células de cáncer colorrectal humano con eliminación de la proteína objetivo ZIP719,20. La apoptosis mejorada debido a NVS-ZP7-4 podría estar relacionada con el elevado estrés del ER, ya que los estudios en múltiples enfermedades también identificaron un estrés desencadenado en el ER después de la eliminación de ZIP7 mediante eliminación genética37,38,39, que finalmente sobrecargó el ER, desencadenando la apoptosis38.

La red de señalización PI3K/AKT participa en numerosos circuitos de retroalimentación, contrarresta diversas señales y brinda amplias oportunidades para eludir los efectos de la quimioterapia. Por lo tanto, la combinación de fármacos dirigidos a la vía PI3K/AKT es importante para abordar la resistencia a la quimioterapia y establecer nuevos tratamientos tumorales40. Significativamente, se demostró que la activación de la señalización PI3K/AKT es un evento importante en la hepatocarcinogénesis41,42,43. En nuestro estudio, confirmamos que el tratamiento con NVS-ZP7-4 funcionó mediante la inhibición de la vía PI3K/AKT. Teniendo en cuenta el importante papel del zinc como segundo mensajero, la inhibición de la señalización de PI3K/AKT podría atribuirse a la disminución del zinc en el citoplasma después del uso de NVS-ZP7-431. De manera similar, la sobreexpresión de la proteína ZIP7 dirigida a NVS-ZP7-4 provocó la activación de la vía de señalización AKT en el cáncer gástrico y de mama31,44,45.

Las moléculas pequeñas que se dirigen a la vía PI3K/AKT, incluidas PI3K/mTOR, pan-PI3K y los inhibidores de PI3K selectivos de isoformas, se han sometido a una gran cantidad de ensayos clínicos y preclínicos para investigar su eficacia y seguridad40. Por ejemplo, un inhibidor de PI3K suprimió la proliferación celular e indujo la apoptosis en modelos de osteosarcoma (OS) resistentes a anlotinib y respalda el inhibidor de PI3K clínicamente utilizado en el tratamiento del OS refractario a anlotinib46. Aunque múltiples ensayos clínicos previos no proporcionaron evidencia prometedora para la aplicación clínica en el CHC y actualmente solo algunos inhibidores de PI3K están aprobados para el tratamiento clínico de cánceres humanos42,47, la vía PI3K/AKT todavía ofrece opciones terapéuticas atractivas para los tratamientos del CHC. Por lo tanto, probar nuevos agentes basados ​​en ciencia básica y ensayos clínicos brindaría más oportunidades para futuras investigaciones sobre el CHC.

El tratamiento del CHC se decide según el estadio del tumor según el sistema de estadificación del Cáncer de Hígado de la Clínica Barcelona48. Sin embargo, como la mayoría de los pacientes con CHC son diagnosticados en la etapa avanzada de la enfermedad, las opciones de tratamiento son limitadas y conducen a un mal pronóstico. La quimioterapia es una herramienta importante, pero también tiene una alta tasa de resistencia a los medicamentos49. La única terapia de primera línea aprobada con sorafenib ha mostrado beneficios de supervivencia limitados y mala tolerabilidad10. En particular, nuestros experimentos in vivo identificaron que el tratamiento con NVS-ZP7-4 del CHC en ratones desnudos disminuyó el peso del tumor, lo que implica aún más su potencial terapéutico al reprimir la vía PI3K/AKT en el CHC. Hasta donde sabemos, este es el primer estudio que confirma el papel terapéutico de NVS-ZP7-4 en el CHC e identifica que NVS-ZP7-4 actúa como un inhibidor dirigido a PI3K/AKT. Por lo tanto, nuestro estudio ofrece perspectivas potenciales para el tratamiento independiente o combinado del CHC con NVS-ZP7-4. Sin embargo, notamos que existen algunas limitaciones en nuestro estudio. En primer lugar, no hemos demostrado los mecanismos directos subyacentes al NVS-ZP7-4, por lo que se necesitan más experimentos en el futuro para verificar su eficacia. En segundo lugar, deberíamos explorar la heterogeneidad del tratamiento del CHC con NVS-ZP7-4 basado en diferentes líneas celulares y proporcionar más información para la aplicación clínica.

En conclusión, nuestro estudio verificó los efectos de NVS-ZP7-4 sobre la proliferación, migración, invasión, apoptosis y progresión del ciclo celular de las células HCC. Además, NVS-ZP7-4 inhibió la activación de la señalización PI3K/AKT, e in vivo, el tratamiento con NVS-ZP7-4 de CHC en ratones desnudos dio como resultado una disminución del peso del tumor y la expresión de PCAN, p-AKT y un aumento de caspasa escindida. 3. Por lo tanto, nuestro estudio proporciona un tratamiento novedoso para el CHC además de la terapia dirigida, la quimioterapia y otras estrategias de tratamiento y proporciona una base de investigación para dilucidar los mecanismos subyacentes de NVS-ZP7-4 en el CHC.

Este manuscrito no ha sido publicado anteriormente y no está siendo considerado por otra revista. Los autores declaran que no tienen intereses en competencia. Los datos generados o analizados durante este estudio están disponibles del autor correspondiente a solicitud razonable.

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Agradecemos el proyecto abierto del laboratorio clave del Departamento de Ciencia y Tecnología de la Región Autónoma Uygur de Xinjiang (2023D04030). Agradecemos a la Fundación de Ciencias Naturales de la Región Autónoma Uygur de Xinjiang (2022D01C290 y 2020D01C216) por su apoyo financiero. Agradecemos a Helixlife por el pulido profesional del idioma inglés.

Estos autores contribuyeron igualmente: Qing Tong y Dong Yan.

Departamento de Cirugía Hepatopancreatobiliar, Hospital Oncológico Afiliado de la Universidad Médica de Xinjiang, Urumqi, Xinjiang, China

Qing Tong, Dong Yan, Yan Cao, Xiaogang Dong, Yimamumaimaitijiang Abula, Huan Yang, Panpan Kong y Mingyu Yi

Departamento de Anestesiología, Tercer Hospital Xiangya de la Universidad Central Sur, No. 138, Tongzipo Road, ciudad de Changsha, 410000, Hunan, China

Mingyu Yi

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QT y DY han contribuido igualmente a este trabajo y comparten la primera autoría. QT: Redacción/edición de manuscritos DY: Análisis de datos; YC: software; XGD: Análisis formal; YA: Validación; HY: Administración de proyectos; PPK: Recopilación de datos; MYY: Desarrollo de Proyecto/Protocolo. Todos los autores leyeron, editaron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Mingyu Yi.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Tong, Q., Yan, D., Cao, Y. et al. NVS-ZP7-4 inhibe la tumorigénesis del carcinoma hepatocelular y promueve la apoptosis mediante la señalización PI3K/AKT. Informe científico 13, 11795 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-38596-7

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Recibido: 05 de abril de 2023

Aceptado: 11 de julio de 2023

Publicado: 21 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-38596-7

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