La microbiota intestinal del gusano de seda (Bombyx mori) participa en la desintoxicación metabólica mediante la glucosilación de toxinas vegetales.

Biología de las comunicaciones volumen 6, número de artículo: 790 (2023) Citar este artículo

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Los herbívoros han desarrollado la capacidad de desintoxicar los componentes del alimento a través de diferentes mecanismos. El gusano de seda oligófago se alimenta de hojas de Cudrania tricuspidata (CTL) en lugar de hojas de morera con el fin de producir seda especial y de alta calidad. Sin embargo, se ha descubierto que los gusanos de seda alimentados con CTL tienen cuerpos más pequeños, un crecimiento más lento y una menor producción de seda que los alimentados con hojas de morera. Aquí, mostramos que el alto contenido de isoflavonas preniladas (PIF) que se produjo en los CTL se convierte en derivados glicosilados (GPIF) en las heces de los gusanos de seda a través de la microbiota intestinal del gusano de seda, y esta biotransformación es el proceso clave en la desintoxicación de los PIF porque se ha descubierto que los GPIF ser mucho menos tóxico, como se revela tanto in vitro como in vivo. Además, agregar Bacillus subtilis como probiótico para remodelar la microbiota intestinal podría promover beneficiosamente el crecimiento y desarrollo del gusano de seda. En consecuencia, este estudio proporciona una guía significativa para la producción de seda al mejorar la adaptabilidad de los gusanos de seda alimentados con CTL.

En la naturaleza, las plantas se defienden de los herbívoros produciendo metabolitos tóxicos, mientras que los herbívoros desarrollaron mecanismos para resistir las defensas de las plantas en adaptación para superar la alimentación tóxica1 mediante la desintoxicación metabólica, incluida la destrucción2, la hidrólisis3, la fosforilación y la glicosilación4 de los componentes tóxicos. Los eventos de desintoxicación anteriores fueron iniciados por insectos transportadores de casetes de unión a ATP5, microbios intestinales6,7 o incluso transferencia horizontal de genes8,9. Entre estos factores, la microbiota intestinal juega papeles importantes en la defensa y protección de los insectos7,10. Por ejemplo, el nematodo del pino o el gorgojo del pino son insectos herbívoros criados en bosques de coníferas ricos en terpenoides tóxicos, como el α-pineno y el ácido diterpénico, cuya microbiota intestinal exhibe una gran capacidad para degradar los terpenoides para contribuir a la aptitud de los insectos11,12. Se reveló que las interacciones beneficiosas entre los insectos y su microbiota intestinal logran la desintoxicación de los huéspedes.

El gusano de seda, Bombyx mori, perteneciente a Lepidoptera, Bombycidae, como uno de los insectos económicos más antiguos para la producción de seda, ha sido ampliamente cultivado en la larga historia de la sericultura en China13. Como insecto oligófago, los gusanos de seda se alimentan principalmente de hojas de morera que pertenecen a la familia de plantas Moraceae, pero también pueden alimentarse de hojas de Cudrania tricuspidata (CTL)14 de la misma familia. Está registrado que los gusanos de seda alimentados con CTL tienen una larga historia y se remonta al antiguo léxico chino "Erh-ya". En particular, la seda cultivada producida por gusanos de seda alimentados con CTL, en comparación con la seda de morera o tussah, era mucho más dura, con una estructura estable, mayor resistencia a la tracción y mejor rendimiento; especialmente indicado para la fabricación de cuerdas o cuerdas de arco15,16; ya veces se utilizaba como material especial para fabricar túnicas de dragón en la antigua dinastía mencionada en “La tecnología china en el siglo XVII: T'ien-kung k'ai-wu”. Así, los CTL se han convertido paulatinamente en una alternativa para alimentar a los gusanos de seda en diferentes prácticas de producción.

Sin embargo, los gusanos de seda alimentados con CTL con menos adaptabilidad tenían fácilmente cuerpos más pequeños, un crecimiento más lento17,18 y una menor producción de seda que los alimentados con otras hojas. Se desconocen las causas subyacentes de este fenómeno, aunque se ha informado que la falta de adaptación puede estar relacionada con los metabolitos secundarios en los CTL para la observación de la regulación positiva de la carboxilesterasa, una enzima metabólica desintoxicante cuya actividad está regulada por metabolitos secundarios relacionados19. La actividad carboxilesterasa en gusanos de seda alimentados con CTL fue mayor que en gusanos de seda alimentados con hojas de morera, lo que sugirió que existían metabolitos secundarios tóxicos en los CTL18.

Aquí, mediante una investigación química comparativa de CTL y heces de gusanos de seda (SWF), encontramos que las isoflavonas preniladas (PIF), los principales componentes de los CTL, se convirtieron en derivados glicosilados (GPIF) en los SWF, y la toxicidad de los GPIF se atenuó considerablemente. Esta conversión fue confirmada mediante la prueba de cocultivo de 6,8-diprenylorobol (DPL), el componente principal de los CTL con microbios intestinales de gusanos de seda in vitro. La adición de B. subtilis como probiótico intestinal de gusanos de seda durante la alimentación puede remodelar la microbiota intestinal medida con la secuenciación del amplicón de ADNr 16S, y el crecimiento y desarrollo de los gusanos de seda alimentados con CTL mejoraron significativamente. Nuestra investigación reveló el mecanismo subyacente de las diferencias en el crecimiento de los gusanos de seda con diferentes materiales alimentarios. También proporcionamos una forma útil de mejorar el desarrollo de los gusanos de seda mediante la remodelación de la microbiota intestinal mediante la adición de probióticos durante la alimentación.

Para explorar estos PIF en CTL con una influencia no expuesta en los gusanos de seda, se aislaron y purificaron sistemáticamente los componentes químicos en los SWF producidos por gusanos de seda alimentados con CTL. Primero, obtuvimos un total de 33 compuestos de SWF (Fig. 1), principalmente PIF y GPIF, que constituyeron los componentes principales de los SWF. Además de 10 PIF conocidos, 6,8-diprenylorobol(24)20, lupalbigenina (25)21, isolupalbigenina (26)22, auriculasina (27)23, 4′-O-metileritrinina C (28)24, lupiwighteona (29 )25, erisenegalenseína E (30)26, millewaninas H (31)27, isoerisenegalenseína E (32)28 y millewaninas G (33)27, considerados como los principales metabolitos secundarios en los CTL, también se obtuvieron 23 GPIF (1-23) , incluidos 21 GPIF no descritos antes hasta donde sabemos, las silexcrinas AU (1-21), y dos conocidos, lupiwighteone 7-β-d-glucoside (22)29 y genisteone (23)30, que son O- derivados glicosilados que introducen principalmente una o dos glucosas en 7,3′,4′-hidroxilos en el esqueleto de isoflavonas preniladas. Además, también se obtuvieron e identificaron dos pares triviales de epímeros 13-16 con estéreocentros de carbono 2″R, 2″S, 3″′S y 3'″′R mediante ECD calculado (Fig. 2). La elucidación estructural de los compuestos 1-21 se puede ver en las Notas complementarias 1 y 2, las Tablas complementarias 1 a 8 y las Figs complementarias. 1–214 para más detalles.

Se muestran las estructuras de los compuestos 1-33. Los nuevos compuestos 1-21 se muestran en rojo.

a Picos base de silexcrinas MP (13-16) en condiciones de análisis LC-MS. Se determinó que los tiempos de retención de los compuestos 13-16 eran 15,09, 15,12, 15,34 y 15,35 min mediante LC-MS, respectivamente. b Estructuras de los compuestos 13-16. c ECD experimental correspondiente y ECD calculada de los compuestos 13-16. d Picos de iones moleculares desprotonados correspondientes ([MH]- m/z) de los compuestos 13-16: 13 ([MH]- m/z ∼599,21094), 14 ([MH]- m/z ∼599,21082), 15 ([ MH]-m/z ∼599,21082) y 16 ([MH]-m/z ∼599,21075).

Dado que los componentes característicos de SWF y CTL varían mucho, las principales diferencias en los componentes entre SWF y CTL se limitaron a los picos con tiempos de retención de 19 a 28 minutos en el análisis cualitativo de HPLC (Fig. 3a). Incluía a los GPIF como los principales componentes diferenciales. Los GPIF 1 a 5, 6, 9 y DPL (24) fueron los componentes principales de los fondos soberanos; sin embargo, sólo el DPL (24) fue el componente principal de los CTL. Además, basándose en el análisis de estructuras químicas, no fue sorprendente encontrar una correlación estructural entre 1-5 y 24. Los compuestos 1-5 se formaron mediante glucosilación de la aglicona DPL (24) (Fig. 3b).

un análisis cualitativo por HPLC de los extractos crudos de SWF y CTL. Los picos de diferencia en los SWF correspondieron a los compuestos 1-6 y 9, que eran los principales ingredientes distintos de los CTL, resaltados por el contorno rojo. b La relación estructural de la glicosilación entre los compuestos 1-5 y 24. c Se determinó que los tiempos de retención de las silexcrinas AE (1-5) y DPL (24) fueron 11,65, 12,82, 13,46, 16,17, 16,44 y 17,14 min mediante LC. ‒MS, respectivamente, y los picos de iones moleculares desprotonados fueron 1 ([MH]- m/z ∼745.27228), 2 ([MH]- m/z ∼745.27197), 3 ([MH]- m/z ∼583.21851) , 4 ([MH]-m/z ∼583,21765), 5 ([MH]-m/z ∼583,21832) y 24 ([MH]-m/z ∼421,16562). d, e Resultados del análisis cuantitativo de 1-5 y 24 en SWF y CTL por LC‒MS. Las barras de errores de d,e representan la media ± DE.

Debido a que los GPIF abundan en gran medida en los SWF, planteamos la hipótesis preliminar de que estos GPIF pueden generarse a través del metabolismo intestinal en los gusanos de seda. Combinado con el análisis cuantitativo de seis componentes principales 1-5 y 24 en SWF y CTL por LC‒MS (Fig. 3c-e), los contenidos de GPIF 1, 2, 3, 4 y 5 en SWF fueron 0,88, 2,67, 0,95, 1,17 y 1,61 mg/g, respectivamente, mientras que no se detectaron en los CTL. Sin embargo, el contenido de DPL (24) en los CTL (12,41 mg/g) fue aproximadamente 6 veces mayor que el de los SWF (2,14 mg/g), lo que sugirió que las porciones reducidas de DPL (24) en los SWF sufrieron una transformación metabólica. parcialmente involucrado en la conversión por glicosilación en GPIF 1-5.

Ha demostrado que esos GPIF estaban presentes en los SWF pero no en los CTL. A continuación, estudiamos más a fondo el papel de la microbiota intestinal del gusano de seda en el metabolismo intestinal para la formación de estos GPIF.

Para determinar más a fondo los factores que influyen en la glicosilación en el intestino del gusano de seda, aislamos las bacterias intestinales del gusano de seda y se obtuvieron tres aislados. Enviamos las secuencias de ADNr 16S de estas cepas al NCBI para una comparación BLAST y descubrimos que la homología con B. subtilis SKG9 (Accesión: OQ299533.1), Staphylococcus sciuri CTSP9 (Accesión: EU855191.1) y Enterobacter hormaechei ECC33 (Accesión: CP098486.1) fueron de 99,87%, 99,87% y 99,93%, lo que sugirió que estos aislados endógenos eran la cepa B. subtilis, S. sciuri y E. hormaechei, respectivamente.

También se encontró que existían especies de Bacillus, un grupo probiótico de la flora intestinal con glicosiltransferasas, que desempeñaba un papel importante en la glicosilación31,32,33,34,35. Este tipo de bacteria, como uno de los microbios importantes en el intestino del gusano de seda, podría influir en el crecimiento y desarrollo, la nutrición y el metabolismo del gusano de seda16,36. Para verificar la función de glicosilación de las especies de Bacillus en PIF, se seleccionaron tres especies de Bacillus, Bacillus licheniformis K1-30-2, Bacillus licheniformis K7-30-7 y el aislado endógeno, B. subtilis del intestino del gusano de seda, para demostrar su capacidad de conversión en vitro (Figura 4a). Según los resultados mostrados por LC‒MS (Fig. 4b), los GPIF 1-5 correspondientes pudieron detectarse con éxito en grupos experimentales fermentados con las tres cepas de Bacillus con DPL (24) como sustrato. Por lo tanto, las tres especies de Bacillus pudieron biotransformar 24 en sus productos glicosilados.

a Esquema de biotransformación microbiana de (ii) 5 y (i) 24 por especies de Bacillus in vitro. Se utilizaron Silexcrin E (5) y DPL (24) como sustratos para alimentar con tres especies de Bacillus, cepa B. licheniformis K1-30-2, B. licheniformis K7-30-7 y B. subtilis. Los productos convertidos se detectaron mediante LC-MS. b Productos convertidos de tres especies de Bacillus con DPL (24) como sustrato mediante biotransformación microbiana in vitro detectados por LC-MS: (i) Los compuestos 1-5 producidos por B. licheniformis K1-30-2 se detectaron en 11,62, 12,83, 13,45 , 16,18, 16,40 min, respectivamente. (ii) Los compuestos 1-5 producidos por B. licheniformis K7-30-7 se detectaron a 11,63, 12,80, 13,46, 16,19 y 16,41 min, respectivamente. (iii) Los compuestos 2-5 producidos por la cepa B. subtilis se detectaron a los 11,72, 12,89, 13,45, 16,22 y 16,45 min, respectivamente. c Productos convertidos de tres especies de Bacillus con silexcrina E (5) como sustrato mediante transformación microbiana in vitro detectados por LC‒MS: (i) Los compuestos 2 y 13-16 producidos por B. licheniformis K1-30-2 se detectaron a 12,79 y 15,09-15,35 min, respectivamente; (ii) los productos antes mencionados convertidos por B. licheniformis K7-30-7 se detectaron a los 12,78 y 15,09–15,35 min, respectivamente; y (iii) producido por la cepa B. subtilis se detectó a los 12,81 y 15,09-15,35 min, respectivamente. d Biotransformación microbiana propuesta de GPIF de SWF por especies de Bacillus en el intestino del gusano de seda.

Además, se identificaron dos pares de epímeros 13-16 en los SWF, pero no se encontraron agliconas correspondientes de 13-16 en los CTL, lo que sugiere que los compuestos 13-16 se formaron mediante transformación de la microbiota. Esta conclusión fue confirmada aún más por la formación de 2 y 13-16 (Fig. 4c), que fueron convertidos por las tres especies de Bacillus alimentadas con 5 in vitro y detectadas por LC-MS con los correspondientes tiempos de retención y picos de iones moleculares desprotonados (Suplementario). Figura 215). Aquí, proponemos lógicamente la biotransformación microbiana del componente principal DPL (24) en SWF por especies de Bacillus en el intestino del gusano de seda. Primero, DPL (24) fue glicosilado por especies de Bacillus en el intestino del gusano de seda a 3, 4 y 5, y luego se agregaron azúcares sucesivamente para formar 1 y 2. Además, una porción de 5 participó en la formación de 13-16 por sucesivos Epoxidación y adición nucleofílica SN2 bajo la influencia de bacterias intestinales (Fig. 4d).

Además, también realizamos una transformación microbiana in vitro de DPL (24) mediante otras cepas intestinales de gusanos de seda endógenos, S. sciuri y E. hormaechei. Y S. sciuri podría glicosilar DPL (24) para formar 1, 2 y 5, y E. hormaechei solo convirtió el sustrato 24 en 2, lo que infirió que estos dos aislados solo pudieron convertir parcialmente DPL (24) para producir GPIF correspondientes (Figura complementaria .216). Por lo tanto, se sugirió que estos aislados intestinales de gusanos de seda estaban involucrados en la conversión de PIF, y las especies de Bacillus mostraron una mejor capacidad de transformación de DPL (24) que los otros dos aislados del intestino de gusanos de seda. Lamentablemente, no se investigó ningún otro bacilo endógeno del intestino del gusano de seda, excepto B. subtilis, y tampoco podemos descartar la contribución de otros taxones microbianos en el intestino del gusano de seda en el estudio actual.

Con respecto a la glicosilación asociada con los efectos de desintoxicación, asumimos que los PIF pueden ser tóxicos para los gusanos de seda, pero los GPIF biotransformados habrían atenuado la toxicidad. Primero, analizamos la citotoxicidad de los compuestos 1-33 aislados de SWF en las células epiteliales de la vena umbilical humana normal (HUVEC) (Tabla 1). Estos PIF de CTL generalmente exhibieron actividad citotóxica significativa o moderada en HUVEC. En particular, DPL (24) mostró la citotoxicidad más significativa para las HUVEC a 1,97 ± 0,31 μM, que fue más fuerte que la del fármaco de control azitromicina, mientras que la toxicidad de los cinco GPIF 1-5 correspondientes fue bastante débil o incluso desapareció.

También observamos el crecimiento y la supervivencia de HUVEC en dos grupos tratados con silexcrina B (2) y DPL (24) (Fig. 5a). El estado de crecimiento de las HUVEC tratadas con silexcrina B (2) todavía tenía una morfología celular normal hasta 80 μM, mientras que las células estaban dañadas de manera obvia y dependiente de la dosis en el grupo tratado con DPL (24) a menos de 5 μM. Un estudio adicional encontró que DPL (24) afectó la apoptosis celular y la detención del ciclo cuando las HUVEC se trataron con 24, según lo determinado por citometría de flujo (Fig. 5b-e). Este resultado implicó que DPL (24) promovió de forma dependiente de la dosis la apoptosis de HUVEC y detuvo las HUVEC en la fase G1, lo que puede interpretarse por el efecto tóxico sobre DPL (24).

a Estado de crecimiento de HUVEC inducido por diferentes concentraciones de silexcrina B (2) o DPL (24) in vitro. b La línea HUVEC se trató con DPL 0, 2,5, 5 o 10 μM (24) y la apoptosis celular se detectó mediante análisis de citometría de flujo junto con tinción con anexina V-FITC/PI. c El panel de cuantificación muestra el análisis estadístico de la apoptosis celular de forma dependiente de la dosis. (ANOVA unidireccional, n = 3, P = 0,0687 > 0,05, **P = 0,003 < 0,01, ***P < 0,001 frente al grupo de control. Las barras de error se informan como media ± DE.) d Las células fueron se trataron con DPL 0, 1,25, 2,5 o 5 μM (24), y la detención del ciclo celular también se detectó mediante análisis de citometría de flujo junto con tinción con PI. El panel de cuantificación muestra el análisis estadístico de la detención del ciclo celular. (ANOVA unidireccional, n = 3, *P = 0,0496 < 0,05, **P = 0,0053 < 0,01, ***P < 0,001 frente al grupo de control. Las barras de error se informan como media ± DE). f Prueba de toxicidad de silexcrina (2) y DPL (24) sobre G. mellonella en la curva de supervivencia.

Posteriormente, probamos la toxicidad de la silexcrina B (2) y DPL (24) en G. mellonella (Fig. 5f). El gusano de seda y G. mellonella son insectos de Lepidoptera; por lo tanto, G. mellonella como insecto modelo37,38 se trató con 40 u 80 μg/d de compuestos y se inyectó continuamente durante 7 días. G. mellonella en el grupo tratado con DPL (24) a 80 μg/d comenzó a morir el segundo día y se observó una tasa de supervivencia del 50% el séptimo día; en el grupo tratado con silexcrina B (2) con la misma dosis del medicamento, los insectos comenzaron a morir al quinto día, con una tasa de supervivencia del 75% al séptimo día. Un resultado similar ocurrió cuando la dosis fue de 40 μg/d. Con la misma dosis y duración del tratamiento, el grupo tratado con DPL (24) tuvo una tasa de supervivencia más baja que el grupo tratado con silexcrina B (2), y la tasa de supervivencia disminuyó al aumentar la dosis. La prueba de toxicidad en G. mellonella implicó que los PIF en los CTL tenían una toxicidad relativamente alta para los gusanos de seda, y estos compuestos fueron convertidos en derivados glicosilados con una toxicidad muy atenuada por la microbiota intestinal de los gusanos de seda. Por lo tanto, la glucosilación, como vía de desintoxicación importante, jugó un papel importante en el metabolismo intestinal del gusano de seda cuando los gusanos de seda fueron alimentados con CTL.

Como la composición de la microbiota intestinal se vio afectada por el cambio en la dieta14,39, supusimos que la suplementación con B. subtilis en las dietas de los gusanos de seda tendría algunos efectos beneficiosos sobre los gusanos de seda y los microbios intestinales. Debido a que se utilizó B. subtilis con un trasfondo genético claro como una bacteria diseñada común y un suplemento probiótico40,41,42, se llevó a cabo un ensayo probiótico usando polvo probiótico de B. subtilis en dos razas diferentes de gusanos de seda, incluidos grupos de control alimentados con CTL sin ninguna aplicación. de polvo probiótico, y los grupos experimentales alimentaron CTL con polvo probiótico.

Los contenidos intestinales disecados de gusanos de seda vivos se secuenciaron mediante el método de secuencia del amplicón 16S rDNA43 para comparar los cambios en la composición microbiana intestinal, la abundancia relativa y la diversidad entre diferentes grupos con o sin B. subtilis. Primero, se cambió la composición de la microflora intestinal del gusano de seda a nivel de género e incluso a nivel de filo, lo que estuvo influenciado por la adición de B. subtilis extraño (Fig. 6a, b). Además, también aumentó la abundancia relativa del género Bacillus en el intestino del gusano de seda al agregar B. subtilis, que aumentó del 1,19% al 2,12% en el gusano de seda YSY, y aumentó del 0,72% al 1,26% en el gusano de seda HK2 (Fig. 6c). ). Según el análisis de diversidad alfa, los tres indicadores de Shannon_2, riqueza y Chao1 ilustraron que la riqueza de especies en el intestino del gusano de seda de los grupos experimentales con B. subtilis era mayor que la de los grupos de control sin B. subtilis (Fig. 6d ). Por ejemplo, el valor de Shannon_2 aumentó de 3,12 a 3,98 en el gusano de seda YSY y de 1,42 a 2,44 en el gusano de seda HK2. Además, los indicadores de Simpson, dominancia y equidad también indicaron que la uniformidad de especies en el intestino del gusano de seda fue más uniforme después de agregar B. subtilis (Fig. 6e). Por ejemplo, el valor de Simpson disminuyó de 0,40 a 0,21 en el gusano de seda YSY y de 0,72 a 0,53 en el gusano de seda HK2. Por lo tanto, indicó que B. subtilis podría colonizar el intestino del gusano de seda, cambiar la composición de la microflora intestinal y aumentar la diversidad microbiana intestinal y la uniformidad general. Pero no exploramos un grupo de control de otros ingredientes en el polvo probiótico sin B. subtilis, ni pudimos descartar la influencia de otros ingredientes en el estudio actual.

Abundancias relativas de bacterias intestinales de gusanos de seda en los niveles de filo (a) y género (b) en los cuatro grupos diferentes. Había 5 gusanos de seda en cada grupo en cuatro grupos diferentes. (YSY se refiere al grupo de gusanos de seda YSY; HK2 se refiere al grupo de gusanos de seda HK2; BS significa agregar B. subtilis adicional a los CTL para alimentar a los gusanos de seda). b Abundancia relativa de especies de Bacillus en los cuatro grupos de intestinos medios de gusanos de seda. c Los diagramas de caja de Shannon_2, la riqueza y Chao1 fueron los indicadores de la riqueza de especies en nombre de cuanto mayor es el valor, mayor es la riqueza de especies y el valor de la línea mediana en los diagramas de caja que ilustran la riqueza de especies de los grupos experimentales con B. subtilis mayor que grupos de control sin B. subtilis; d Simpson, la dominancia y la equidad fueron los indicadores de la equidad de especies. Simpson es representativo de que cuanto menor es el valor, mayor es la uniformidad de las especies, y el valor de la línea mediana que ilustra la uniformidad de las especies de los grupos experimentales con B. subtilis fue más uniforme que el de los grupos sin B. subtilis. Para la dominancia y la equidad, cuanto mayor es el valor, más uniforme es la igualdad de especies. Los datos de c – e se informan como la media ± DE.

Además, se observó el crecimiento y desarrollo de los gusanos de seda en el ensayo con probióticos en diferentes grupos, y se registraron los datos de peso de los gusanos de seda en diferentes períodos. Como resultado, encontramos un mejor estado de crecimiento de los gusanos de seda en los grupos experimentales, y el peso promedio de los gusanos de seda alimentados con B. subtilis en diferentes períodos fue mayor que el de los que no fueron alimentados con B. subtilis (Fig. 7a), y los gusanos de seda alimentados con B. .subtilis eran más grandes que aquellos que no fueron alimentados con B. subtilis (Fig. 7b). Para la raza de gusanos de seda YSY, se demostró que los gusanos de seda con suplementación con B. subtilis eran significativamente más pesados que aquellos sin suplementación con B. subtilis (Fig. 7c). Por lo tanto, se indicó, hasta cierto punto, que alimentar a los gusanos de seda con B. subtilis puede promover su crecimiento y desarrollo, aumentando notablemente el peso de los gusanos de seda.

a Cambios de peso promedio de todos los gusanos de seda involucrados en el ensayo con probióticos en cuatro grupos diferentes en diferentes etapas de crecimiento. b Comparación de los tamaños de los cuerpos de gusanos de seda seleccionados al azar de 5 de cada grupo en el ensayo con probióticos. c Comparación del peso de gusanos de seda recogidos 5 al azar en cuatro grupos diferentes (prueba t de Student, de dos colas, n = 5, *p = 0,0143 < 0,05). d Análisis cuantitativo por HPLC de GPIF 1-5 y aglicona 24 detectados en λ = 254 nm. e Resultados del análisis cuantitativo del contenido relativo de 1-5, 24 de SWF en cuatro grupos mediante HPLC en un gráfico de barras. La coordenada vertical se refiere a la proporción del contenido de cada compuesto (1-5 y 24) que representa el contenido total de estos seis compuestos, lo que refleja el contenido relativo de los ingredientes en los SWF. f Comparación de los contenidos relativos de los GPIF 1-5 de los SWF en los cuatro grupos diferentes. Los datos de c, e, f se informan como la media ± DE.

Luego, se realizó el análisis cuantitativo de los componentes principales 1-5 y 24 mediante HPLC (Fig. 7d, e). Según los resultados cuantitativos de HPLC, la relación entre el área de cada pico de 1-5 y 24 con respecto al área total del pico de los seis componentes se utilizó como indicador para medir los cambios en los contenidos relativos de los seis componentes en los SWF para ilustrar la influencia de B. subtilis exógena sobre los cambios en los metabolitos intestinales del gusano de seda. Como se muestra en la Fig. 7e, B. subtilis afectó el contenido de los metabolitos intestinales de los gusanos de seda. Después de agregar B. subtilis, el contenido relativo total de cinco GPIF principales 1-5 en SWF aumentó en los gusanos de seda YSY (Fig. 7f), que fue un 2,0% mayor que el de los gusanos de seda no alimentados con B. subtilis, mientras que el contenido relativo de la aglicona DPL (24) disminuyó. Esta observación puede estar asociada con el aumento en la abundancia relativa de Bacillus en el intestino del gusano de seda YSY. Sin embargo, el contenido relativo total de 1-5 en los SWF de los gusanos de seda HK2 aumentó ligeramente en un 0,2% en comparación con el de los gusanos de seda que no fueron alimentados con B. subtilis. Este resultado sugirió que los gusanos de seda YSY pueden ser más susceptibles a B. subtilis que los gusanos de seda HK2.

El fenómeno de que la suplementación con B. subtilis en gusanos de seda permitió un aumento en el contenido total de GPIF y una disminución en el correspondiente contenido de agliconas tóxicas en los SWF, lo que también puede ser relevante para desintoxicar los PIF tóxicos en los CTL para proteger a los huéspedes de ingredientes adversos.

Descubrimos una serie de GPIF abundantes en los SWF, que son productos oxiglicosilados en uno o dos sitios del 7-, 3′- o 4′-OH del esqueleto de isoflavonas preniladas. Dados los pocos GPIF que se encuentran naturalmente en la naturaleza44, los SWF de los gusanos de seda alimentados con CTL se convierten en una fuente natural abundante de estos compuestos. Además, encontramos que las principales diferencias en los ingredientes entre los SWF y los CTL eran los GPIF. Posteriormente, la evidencia preliminar mediante análisis cuantitativo HPLC‒MS demostró que estos GPIF no estaban presentes en los CTL en sí, sino que eran producidos por el metabolismo intestinal del gusano de seda. Una biotransformación microbiana in vitro de DPL (24) por tres cepas intestinales, B. subtilis, S. sciuri y E. hormaechei aisladas del intestino de gusanos de seda sugirió además que la formación de abundantes GPIF en los SWF estaba estrechamente relacionada con los microbios del gusano de seda.

Se ha informado que algunos microbios, como las especies de Bacillus con GT, tienen una excelente capacidad de transglicosilación con amplia especificidad de sustrato, especialmente componentes fenólicos prenilados con mayor afinidad44,45. En los últimos años, algunos GT de especies de Bacillus se han utilizado ampliamente para glicosilar flavonoides46. Llamando la atención sobre los flavonoides O-glicosilados con proporciones relativamente altas en los glucósidos flavonoides totales naturales, estudios extensos descubrieron que los GT de B. subtilis ATCC 6633 (BsGT110)47, B. subtilis 168 (Bs-YjiC)48, B. licheniformis (Bl -YjiC)49,50 y Bacillus cereus (MgtB, BcGT1 y BcGT-3)51,52,53 fueron capaces de catalizar la reacción de glicosilación, que unía restos glicosilo a grupos hidroxilo de flavonoides para biosintetizar flavonoides-O-glucósidos. Para ejemplificar esto, demostramos que las especies de Bacillus podían convertir DPL (24) en GPIF silexcrinas AE (1-5). Además, mediante biotransformación microbiana se confirmó también la formación de epímeros silexcrinas MP (13-16) con esqueletos de agliconas mutados.

La glicosilación no sólo puede mejorar la estabilidad estructural y la hidrofilicidad de los compuestos químicos, sino que también se considera un proceso de desintoxicación directo o indirecto54,55,56,57. En nuestro trabajo actual, las pruebas de toxicidad de DPL (24) en G. mellonella demostraron que los PIF en CTL tenían efectos tóxicos en los herbívoros, lo que puede afectar el crecimiento y desarrollo de los gusanos de seda. Pruebas adicionales de DPL (24) con HUVEC mostraron que inducía la apoptosis celular, bloqueaba las células para permanecer en la fase G1 y causaba daños celulares graves. Este estudio reveló que la glicosilación era una vía de desintoxicación importante para convertir PIF tóxicos en CTL en GPIF con toxicidad atenuada o nula. Según algunos estudios, los gusanos de seda alimentados con CTL marcan diferencias en el crecimiento y desarrollo, los capullos y la calidad de la seda (Figura complementaria 217) en comparación con los que se alimentan de hojas de morera, lo que puede estar influenciado por los componentes tóxicos de los CTL15,17. 18. Por lo tanto, se confirmó que los PIF, una subclase de fitoquímicos característicos abundantes en los CTL, son ingredientes adversos perjudiciales para el crecimiento de los gusanos de seda, lo que explica por qué los gusanos de seda tienen una adaptabilidad relativamente baja cuando se alimentan con CTL.

Estudios recientes también propusieron una posible estrategia de ensayo con probióticos, que reveló que los microbios intestinales podrían cambiar en consecuencia cuando se utilizaron especies de Corynebacterium y Bacillus como probióticos para verificar las interacciones microbianas en el intestino de la rana arbórea58. Aquí, encontramos que B. subtilis, como probiótico agregado al intestino del gusano de seda, jugó un papel importante en el cambio de la composición de la microbiota intestinal, aumentando la riqueza y uniformidad de las bacterias intestinales y manifestando una estrategia de desintoxicación metabólica no expuesta a través de la glicosilación fitoquímica en los gusanos de seda. Es importante destacar que también se observó una influencia de promoción beneficiosa sobre el crecimiento y desarrollo del gusano de seda. Dado que el probiótico B. subtilis se utilizó para promover el crecimiento y desarrollo de los animales e incluso demostró ser beneficioso para la prevención y el tratamiento de enfermedades humanas34,59,60,61,62, también se espera que se desarrollen especies de probióticos Bacillus. en preparaciones probióticas intestinales para gusanos de seda.

Sin embargo, las limitaciones del presente estudio son que aquí no se investigó más microbiota intestinal endógena que tres aislados, B. subtilis, S. sciuri y E. hormaechei del intestino del gusano de seda. Como se informa que las diferencias en la dieta podrían afectar la composición de la microbiota intestinal de los insectos14,39, no pudimos aclarar si otros ingredientes del polvo probiótico también podrían influir en la composición del microbioma intestinal de los gusanos de seda.

Aquí, vale la pena señalar que revelamos que la microbiota intestinal del gusano de seda desarrolló la capacidad de desintoxicar los ingredientes alimentarios convirtiéndolos en derivados glicosilados (Fig. 8). Sienta una base para futuras investigaciones relacionadas con el fin de mejorar la adaptabilidad de los gusanos de seda alimentados con CTL y proporciona una dirección potencial para un mayor desarrollo de probióticos aplicados en preparaciones microbianas adecuadas para los gusanos de seda.

Cuando el gusano de seda se alimenta de CTL, el componente tóxico DPL (24) en los CTL ingresaría al intestino del gusano de seda y se convertiría en GPIF, como la silexcrina B (2), con una toxicidad muy atenuada bajo la influencia de la microbiota intestinal del gusano de seda.

Se recolectaron CTL y SWF de gusanos de seda alimentados con CTL en Linyi, Shandong, China. Se adquirió una preparación probiótica en polvo seco de B. subtilis de Shandong Yihao Biotechnology Co., Ltd. (China). Los reactivos para el análisis HPLC o LC-MS eran de calidad cromatográfica y otros reactivos eran de calidad analítica.

Los SWF secados al aire (1,8 kg) se extrajeron poniéndolos a reflujo con alcohol etílico al 95% tres veces durante 3 h cada vez. El extracto crudo evaporado suspendido en H2O se extrajo sucesivamente con éter de petróleo, acetato de etilo y alcohol n-butílico. Brevemente, el extracto de acetato de etilo se repartió secuencialmente con un gradiente de MeOH-H2O (3:7 a 1:0), CH2Cl2-MeOH (200:1 a 0:1), MeOH (100%) y una elución de MeOH-H2O. sistema a través de una columna de gel MCI, una columna de gel de sílice (malla 100-200), una cromatografía Sephadex LH-20 y una HPLC semipreparativa (SHIMADZU LC-20AT, detector DAD, Shim-pack GIS-C18 (5 μm, 10 × 250 milímetros)). Se purificaron treinta y tres GPIF y en los materiales complementarios se muestra la elucidación de las silexcrinas AU (1-21), así como los datos de RMN, HRESIMS, ECD, UV e IR.

Los espectros de RMN se adquirieron con los espectrómetros Avance DRX-400 y 600 (Bruker, Alemania, dimetilsulfóxido-d6 con un estándar interno de TMS al 0,3% como disolvente). Los espectros UV se obtuvieron a través del espectrofotómetro UV-2550 (Shimadzu, Japón) y los espectros IR se obtuvieron con el espectrómetro de microinfrarrojos Nicolet iN10 (Thermo Fisher Scientific, Estados Unidos). Se utilizó el espectrómetro de dicroísmo circular Chirascan (Applied Photophysics, Reino Unido) para obtener los compuestos de los espectros ECD. Las rotaciones ópticas se midieron con el polarímetro circular modular MCP 200 (Anton Parr, Austria, MeOH como disolvente, 20 °C). Los espectros de masas de alta resolución se obtuvieron mediante el espectrómetro de masas Thermo Fisher Q-Exactive Orbitrap (Thermo Fisher Scientific, América).

El análisis cuantitativo de los cambios en el contenido de los componentes químicos característicos silexcrinas AE (1-5) y DPL (24) de SWF y CTL se llevó a cabo por separado mediante LC-MS con las siguientes condiciones analíticas: instrumento, Thermo Fisher Q-Exactive Orbitrap, UtiMate 3000, Dim. (100 x 2,1 mm); detector, DAD-3000; fuente de ionización, ESI; caudal, 0,3 ml/min; y volumen de inyección, 2,0 µL. La elución en gradiente se realizó para el sistema de elución MeOH-H2O: 25:75 de 0,0 a 1,0 min, 25:75 a 95:5 de 1,0 a 20,0 min, 95:5 de 20,0 a 24,0 min, 95:5 a 25:75 de 24.0-25.0 min, y 25:75 de 25.0-28.0 min. Las seis silexcrinas AE (1-5) y DPL (24) se mezclaron para preparar una solución estándar de cada compuesto a una concentración de 1 µg/ml. La solución estándar mixta se diluyó en serie hasta concentraciones de 1000, 500, 250, 100, 50, 25, 10, 5 y 2,5 ng/ml para cada compuesto en cada solución mixta. Estas nueve soluciones de mezcla estándar se aplicaron para preparar las curvas estándar de los seis componentes (Figura complementaria 218). Los extractos ultrasónicos de metanol de SWF y CTL se prepararon por separado a una concentración de 200 μg/ml mediante LC-MS en las condiciones anteriores. Cada grupo fue analizado por triplicado. Los datos obtenidos del análisis se utilizaron para detectar el contenido de seis compuestos en SWF y CTL mediante el software Thermo Scientific Xcalibur.

El análisis cualitativo de diferentes constituyentes de los extractos crudos de SWF y CTL se realizó mediante HPLC en las mismas condiciones cromatográficas (Agilent 1260, detector DAD, columna Eclipse XDB-C18 (5 μm, 4,6 × 250 mm), elución en gradiente de la Sistema de elución MeOH-H2O, 30:70 a 100:0 en 30 min). El análisis cuantitativo de los cambios de contenido en silexcrinas AE (1-5) y DPL (24) en SWF frescos se llevó a cabo por separado mediante HPLC con las condiciones cromatográficas anteriores. Hubo cuatro grupos de SWF (YSY, YSY-BS, HK2, HK2-BS) producidos por dos razas de gusanos de seda con o sin B. subtilis, todos los cuales se prepararon a 50 mg/ml. Además, las silexcrinas AE (1-5) y DPL (24) disueltas en metanol de calidad cromatográfica se analizaron cualitativamente para confirmar el tiempo de retención en las condiciones cromatográficas anteriores. Las seis áreas de pico cromatográfico obtenidas se procesaron para comparar los contenidos relativos de los seis compuestos en los cuatro excrementos diferentes. Todos los SWF frescos después de la liofilización, además del agua, se trituraron hasta convertirlos en polvo.

Detalles de teoría y cálculo63: Los cálculos se realizaron mediante el paquete de programa Gaussian 09. La superficie de energía potencial escaneada se utilizó mediante el método AM1 semiempírico y un enfoque DFT B3LYP/6-31 G (d), y las geometrías de todas las conformaciones del estado fundamental se optimizaron aún más a 298,15 K. Luego, estos mínimos y cálculos de Las energías libres a temperatura ambiente se confirmaron mediante cálculos de su análisis de frecuencia armónica. Las energías de excitación electrónica y las fuerzas de rotación en la fase gaseosa para los primeros 60 estados se calcularon mediante la teoría funcional de la densidad dependiente del tiempo. Después de sumar las fuerzas rotatorias y ponderarlas energéticamente según las estadísticas de Boltzmann, los espectros ECD finales se obtuvieron mediante la siguiente Ecuación 1:

σ es el ancho de la banda a 1/e de altura (σ = 0,1 eV). ΔEi son las energías de excitación. Ri son fuerzas rotatorias para la transición.

B. licheniformis K1-30-2 y B. licheniformis K7-30-7, utilizados para la biotransformación microbiana in vitro, fueron seleccionados previamente en nuestro laboratorio. La cepa B. subtilis se aisló del gusano de seda en nuestro trabajo. Se utilizaron DPL (24) y silexcrin E (5) como sustratos para alimentarse de tres especies de Bacillus. Se formaron los grupos experimentales con sustrato y los grupos de control sin sustrato, y cada grupo se probó por triplicado. Se activaron tres especies de Bacillus mediante cultivo en placas de agar y los aislados activados se subcultivaron en solución de Luria-Bertani (LB) con 5 ml en tubos Eppendorf como medio de cultivo para proporcionar la fuente de glucosa en una mesa de agitación a temperatura constante de 37 °C durante 24 horas. h. Después de incubar la solución bacteriana, se añadió DPL (24) o silexcrina E (5) (1 mg disuelto en DMSO al 0,5%) como sustrato a los grupos experimentales y se coincubó continuamente durante otras 24 h a 37 °C. Luego, las bacterias en solución se trituraron mediante ultrasonido y se extrajeron con acetato de etilo tres veces. Los lisados se analizaron mediante LC-MS (en las mismas condiciones mencionadas anteriormente) para detectar los productos de biotransformación microbiana de las tres especies de Bacillus in vitro.

Dos de las razas de gusanos de seda, el gusano de seda YeSanYuan (YSY-gusano de seda) y el gusano de seda HuaKang 2 (HK2-gusano de seda), elegidas en nuestro estudio, fueron proporcionadas por el Instituto Runfa de Cudrania tricuspidata, Linyi (Shandong, China). Los grupos de control (YSY, HK2) en la prueba de probióticos fueron alimentados con CTL sin ninguna aplicación de polvo probiótico de B. subtilis, y los grupos experimentales (YSY-BS, HK2-BS) fueron alimentados con CTL con polvo de probiótico de B. subtilis. En el experimento participaron un total de 400 gusanos de seda, 100 en cada grupo. Fueron alimentados con CTL a partir de la etapa de eclosión del gusano de seda. A partir del tercer estadio, los gusanos de seda de los grupos experimentales fueron alimentados con CTL suplementados con preparaciones de B. subtilis mediante pulverización. La preparación en polvo seco de B. subtilis se diluyó en agua a 1:1000 g/ml, que se añadió moderadamente a los CTL alimentados a gusanos de seda en grupos experimentales tres veces al día. Al mismo tiempo, se registraron los cambios en el peso corporal de los gusanos de seda. Debido a la mayor población bacteriana registrada en el tracto digestivo de los gusanos de seda en el quinto estadio64, se seleccionaron al azar cinco gusanos de seda vivos en cada grupo de dos razas. Después de la esterilización superficial de los cuerpos de los gusanos de seda con alcohol etílico al 75%, se diseccionaron en el intestino medio del gusano de seda. El contenido del intestino medio se extrajo con jeringas estériles y se almacenó a -80 °C.

Las muestras del contenido del intestino medio del gusano de seda se derivaron de gusano de seda YSY y gusano de seda HK2, cuatro grupos denominados YSY, YSY-BS, HK2, HK2-BS, cada grupo con cinco individuos paralelos y un total de 20 muestras. Los siguientes pasos fueron realizados por Luojie (Jinan) Biological Medicine Co., Ltd. (Shandong, China). El ácido nucleico de las muestras extraídas se analizó utilizando el kit DNeasy PowerSoil Pro (Qiagen, Cat No. 47016). Después de determinar la integridad y la concentración de los ácidos nucleicos, las muestras de ADN se amplificaron utilizando enzimas de alta fidelidad y se utilizó un fluorímetro Invitrogen Qubit 4.0 para la cuantificación de la concentración. La biblioteca se construyó con el kit KAPA Hyper Prep y se secuenció con Illumina NovaSeq para obtener datos sin procesar. Se construyeron unidades taxonómicas operativas (ZOTU) de radio cero mediante etiquetas efectivas obtenidas después de una serie de separación de datos, eliminación de cebadores, empalme de lectura de PE, etiquetas con calidad y longitud, filtrado e interceptación, y eliminación de quimerismo. Los análisis de diversidad alfa y beta bacteriana se obtuvieron de ZOTU. Se utilizó la secuenciación del amplicón 16 S rDNA65 para analizar la diferencia en los microbios intestinales entre los grupos experimentales y los grupos de control, así como los cambios en la composición de los microbios intestinales en nuestro experimento.

Extracción del ADN del genoma: El ADN del genoma total de las bacterias intestinales del gusano de seda se extrajo mediante el kit DNeasy PowerSoil Pro (Qiagen, Cat No. 47016) de acuerdo con el proceso de extracción de la siguiente manera: se agrega tampón de lisis a la muestra en tubos de perlas de circonio mixto y se baten las perlas. se realiza mediante un vórtice de mesa con adaptador de tubo de perlas para homogeneizar. El lisado bruto se somete a eliminación del inhibidor para su limpieza y el lisado purificado se mezcla con un volumen igual de solución de unión a ADN. El sistema mixto pasó a través de una membrana de filtro giratorio de sílice que se lava con un régimen de lavado de dos pasos. Luego se utiliza un tampón de elución Tris 10 mM para eluir el ADN unido a sílice.

Sistema de reacción de PCR y procedimientos de ciclo: se amplificaron genes de ARNr 16S de distintas regiones (16S V3-V4), se utilizó un cebador específico (341 F (5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′) y 806 R (5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′) con el código de barras. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo con 15 μL de Phusion® High-Fidelity PCR Master Mix (New England Biolabs); 0,2 μM de cebadores directos e inversos y aproximadamente 10 ng de ADN molde. El ciclado térmico consistió en una desnaturalización inicial a 98 °C por 1 min, seguido de 30 ciclos de desnaturalización a 98 °C por 10 s, recocido a 50 °C por 30 s y elongación a 72 °C por 30 s, finalmente 72 °C por 5 min.

Aislamos las bacterias intestinales del gusano de seda según el método informado36 con modificaciones. Brevemente, se seleccionaron cinco gusanos de seda que murieron de hambre durante 24 h. Después de esterilizar con alcohol al 75% la superficie del cuerpo del gusano de seda, diseccionamos los gusanos de seda y obtuvimos el contenido intestinal de los gusanos de seda. Se añadió a un tubo EP de 10 ml que contenía 5 ml de agua estéril en funcionamiento aséptico. El líquido intestinal se diluyó a 10-1, 10-2 y 10-3 mediante un método de dilución de 10 veces. El líquido intestinal en cada concentración de 100 μl se recubrió uniformemente sobre una placa de medio NA y se cultivó a 37 °C durante 12 h. Se seleccionaron colonias con diferente morfología para una mayor estriación y purificación hasta que se detectaron como una única cepa mediante microscopía y se enviaron a Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. para la secuenciación y el análisis del ADNr 16S.

Extracción del ADN del genoma: El ADN genómico de las cepas de gusanos de seda se extrajo mediante el kit de purificación de ADN genómico de bacterias en columna Ezup (Sangon Biotech, n.º de catálogo SK8255) de acuerdo con el proceso de extracción de la siguiente manera: la solución bacteriana cultivada durante la noche (1 ml) se añadió a 1,5 Tubo de centrífuga de ml, centrifugado a temperatura ambiente a 8000 rmp para descartar el sobrenadante y recoger las bacterias. A la solución de bacterias grampositivas se le añaden 180 l de solución de lisozima (20 mg/ml), se resuspende y se baña a 37 °C durante 30-60 min. A la solución de bacterias gramnegativas se le añaden 180 µL de tampón de digestión. Se añade una solución de proteinasa K (20 μl) a las bacterias recogidas, se mezcla bien y se baña en agua a 56 °C durante 1 h hasta que las células se lisan por completo. Posteriormente, se añaden secuencialmente tampón BD (200 μl) y etanol anhidro (200 μl) al lisado y se mezclan completamente. La mezcla se cargó en la columna de adsorción durante 2 min, luego se centrifugó a temperatura ambiente a 12.000 rpm durante 1 min y se vació el líquido residual en el tubo de recolección. Agregue solución PW (500 l) y centrifugue a 10.000 rpm durante 30 s para drenar el filtrado. A continuación, agregue la solución de lavado (500 μL), centrifugue y retire el filtrado. La columna de adsorción se colocó en un tubo de centrífuga de 1,5 ml, se le añadió tampón CE (50–100 μl) y se dejó durante 3 minutos, se centrifugó a 12.000 rpm durante 2 minutos a temperatura ambiente y se recogió la solución de ADN.

Sistema de reacción de PCR y procedimientos de ciclo: El ADN genómico bacteriano extraído se utilizó como plantilla. La amplificación por PCR se realizó utilizando los cebadores universales 27 F (5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3') y 1492 R (5′-GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3') del gen bacteriano 16 S rRNA. 0,5 μL de plantilla de ADN genómico (20-50 ng/μL), 0,5 μL de cebadores directos e inversos (10 μM), 5 μL de tampón de PCR 10 × (Mg2+ plus), 4 μL de mezcla de dNTP (2,5 mM L-1) y TaqDNA polimerasa (5 U μL-1) 0,2 μL, lleno de agua ultrapura esterilizada hasta 25 μL. Predenaturación a 94 °C durante 4 min, desnaturalización a 94 °C durante 45 s, recocido a 55 °C durante 45 s, extensión a 72 °C durante 1 min, 30 ciclos y extensión de reparación a 72 °C durante 10 min. ; luego almacenar a 4 °C. Los productos amplificados se purificaron mediante electroforesis en gel de AGAR al 1 % (BBI, n.º de catálogo AB0014) y se recuperaron mediante el kit de recuperación de gel DNAJ de columna SanPrep (Sangon Biotech, n.º de catálogo SK8131).

Para aprovechar la influencia de la glicosilación de las isoflavonas preniladas, se llevó a cabo una prueba de toxicidad con G. mellonella. Se utilizó G. mellonella como modelo de insecto para probar la toxicidad de la silexcrina B (2) y DPL (24) in vivo según una metodología descrita38 con modificaciones. Brevemente, antes del experimento se seleccionaron un total de cuarenta larvas de G. mellonella, que pesaban entre 0,28 y 0,35 g, y se dividieron aleatoriamente en cinco grupos, cada grupo de 8, incluido el control de vehículo (con disolvente como control), silexcrina B ( 2) (40 μg/d para cada larva), silexcrina B (2) (80 μg/d para cada larva), DPL (24) (40 μg/d para cada larva) y DPL (24) (80 μg/d para cada larva). d para cada larva). Silexcrin B (2) y DPL (24) se disolvieron en 10 μL de solución con 5% de DMSO, 45% de PEG y 50% de solución salina normal. A las larvas del grupo de control o de los cuatro grupos tratados se les inyectó a través de la última pierna derecha 10 µl de la solución del fármaco preparada y se les inyectó de forma continua durante 7 días. Luego se incubaron a 35 °C en oscuridad. La supervivencia de los gusanos de seda se controló diariamente durante 7 días. La curva de supervivencia se dibujó con GraphPad Prism 7 y se utilizó el modelo de análisis de supervivencia de rango logarítmico (Mantel‒Cox).

Los HUVEC se obtuvieron del Instituto de Ciencias Biológicas de Shanghai (SIBS) de la Academia de Ciencias de China (China). Según un método previamente informado66, las condiciones de cultivo de HUVEC fueron medio RPMI-1640 (HyClone) que consistía en 10 % de FBS (Sijiqing Company Ltd.), 100 unidades/ml de penicilina G y 100 μg/ml de estreptomicina en un ambiente con 5 % CO2 a 37°C. Primero se sembraron células de la línea HUVEC en placas de 96 pocillos a 3-5 x 103 células/pocillo y se dejaron adherir durante la noche. Luego, se agregaron diferentes concentraciones de 33 compuestos y el fármaco control adriamicina para continuar la incubación durante el tiempo indicado. Se añadió una solución de MTT (5,0 mg/mL) con 12 μL, seguido de una incubación durante otras 4 h a 37 °C. Luego, se eliminó MTT del medio con DMSO antes de agregar 150 μl/pocillo a los cristales de formazán de color púrpura. La densidad óptica se detectó mediante un lector de microplacas (Bio-Rad 680) a 570 nm y se calculó en valores de CI50 utilizando GraphPad Prism 7 para evaluar la viabilidad celular. Todos los experimentos fueron realizados por triplicado.

Mediante comparación con el control del vehículo, la relación inhibidora de la viabilidad celular se calculó mediante la siguiente Ecuación 2:

La apoptosis celular y la detención del ciclo celular se analizaron mediante citometría de flujo de acuerdo con la literatura66,67,68 con las modificaciones menores que se detallan a continuación. Brevemente, después de una incubación durante la noche, las células se expusieron a un medio sérico al 5% con concentraciones de DPL de 0, 2,5, 5 y 10 μM (24) durante 24 h y luego se recogieron y se lavaron con PBS. Después de que se eliminó el sobrenadante mediante centrifugación, las células se resuspendieron en 400 µL de tampón de unión y se incubaron a temperatura ambiente en la oscuridad durante 15 minutos con 5 µL de Anexina V-FITC, seguido de 5 µL de PI (50 mg/L). por otros 5 min. La proporción de apoptosis se analizó mediante citometría de flujo (Becton Dickinson, EE. UU.) utilizando el software WinMDI 2.9. Las HUVEC se trataron con DPL 0, 1,25, 2,5 o 5 μM (24) durante 24 h, y la detención del ciclo celular se detectó mediante análisis de citometría de flujo junto con tinción con PI.

Cada experimento se realizó con al menos tres muestras biológicamente independientes para estadística y reproducibilidad (n ≥ 3). Los resultados se utilizaron para el análisis de varianza y las diferencias entre medias se evaluaron mediante la prueba t de Student entre dos grupos y ANOVA unidireccional entre múltiples grupos. P <0,05 se consideró estadísticamente significativo. Todos los datos se informan como media ± desviación estándar (DE).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Todos los conjuntos de datos que respaldan los hallazgos de este estudio se pueden encontrar en las figuras, tablas y archivos de información complementaria. Los datos de fuente numérica utilizados para generar los gráficos están disponibles en Datos complementarios 1. Los datos sin procesar generales del microbioma intestinal 16S rRNA-seq se depositan en Sequence Read Archive con el código de acceso PRJNA985806. Los datos de secuencia sin procesar de las secuencias de ADNr 16S se han puesto a disposición del público en GenBank con el código de acceso OR125545 (cepa B. subtilis), OR125546 (S. sciuri) y OR125547 (E. hormaechei). La elucidación estructural de los compuestos 1-21 se puede ver en las Notas complementarias 1 para obtener más detalles, y las propiedades fisicoquímicas de los compuestos 1-21 se pueden ver en la Nota complementaria 2. Todos los datos están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable.

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Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 82173703, 81874293), el Programa Nacional Clave de I+D de China (No. 2019YFA0905700), el Programa Principal de Investigación Básica de la Fundación Provincial de Ciencias Naturales de Shandong (No. ZR2019ZD26) y la Fundación para grupos de investigación innovadores del laboratorio estatal clave de tecnología microbiana (No. WZCX2021-03). Agradecemos al personal del Centro de Pruebas y Análisis de la Universidad de Shandong por recopilar los datos espectroscópicos.

Departamento de Química de Productos Naturales, Laboratorio Clave de Biología Química del Ministerio de Educación, Facultad de Ciencias Farmacéuticas, Universidad de Shandong, Jinan, 250012, República Popular China

Shuangzhi Yuan, Yong Sun, Wenqiang Chang, Jiaozhen Zhang, Minghui Song, Yanan Qiao, Chunyang Zhang, Mingzhu Zhu y Hongxiang Lou

Universidad de Linyi, Yishui, Linyi, 276400, República Popular China

Jifa Sang y Jiachun Zhao

Laboratorio Estatal Clave de Tecnología Microbiana, Universidad de Shandong, Qingdao, 266237, República Popular China

Yajie Tang

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SY y HL diseñaron el estudio. SY, YS, JS, JZ y MS llevaron a cabo los experimentos. SY, HL, YS, WC, JZ, YQ, CZ, YT y MZ analizaron los datos; SY y HL prepararon el manuscrito.

Correspondencia a Hongxiang Lou.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a Michael Wink y Magdalena Calusinska por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editor principal: George Inglis. Un archivo de revisión por pares está disponible.

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Yuan, S., Sun, Y., Chang, W. et al. La microbiota intestinal del gusano de seda (Bombyx mori) participa en la desintoxicación metabólica mediante la glucosilación de toxinas vegetales. Común Biol 6, 790 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-05150-0

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Recibido: 06 de diciembre de 2022

Aceptado: 17 de julio de 2023

Publicado: 29 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-05150-0

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