Análisis comparativo de la eficacia para el desarrollo de cócteles de fagos contra múltiples serovares de Salmonella y su actividad de control de biopelículas.

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 13054 (2023) Citar este artículo

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Las enfermedades transmitidas por los alimentos son un desafío importante en la industria alimentaria mundial, especialmente aquellas causadas por bacterias multirresistentes (MDR). Las bacterias capaces de formar biopelículas, además de las cepas MDR, reducen la eficacia del tratamiento, lo que representa una amenaza importante para el control bacteriano. Los bacteriófagos, que son virus que infectan y matan bacterias, se consideran una alternativa prometedora para combatir las bacterias MDR, tanto en la medicina humana como en la producción animal. Los cócteles de fagos, que comprenden múltiples fagos, se emplean comúnmente para ampliar el rango de huéspedes y prevenir o retrasar el desarrollo de resistencia a los fagos. Existen numerosas técnicas y protocolos disponibles para evaluar la actividad lítica de los bacteriófagos, siendo los métodos más utilizados los ensayos de prueba puntual, la eficiencia del revestimiento (EOP) y los ensayos de infección en cultivo líquido. Sin embargo, actualmente no existe una estandarización sobre qué análisis deben emplearse y las posibles diferencias entre ellos para determinar con precisión la variedad de fagos hospedadores y la composición de un cóctel. Una selección preliminar utilizando el ensayo Spot Test dio como resultado cuatro fagos para su posterior evaluación frente a un panel de 36 aislados de Salmonella de numerosos serovares. La comparación de los ensayos de EOP y de infección en cultivos líquidos reveló que la EOP podría subestimar la actividad lítica de los fagos, influyendo directamente en el desarrollo del cóctel de fagos. Además, el cóctel de fagos que contiene los cuatro fagos seleccionados fue capaz de controlar o eliminar las biopelículas formadas en el 66% (23/35) de los aislados, incluidos aquellos que exhiben baja susceptibilidad a los fagos, según EOP. Los fagos se caracterizaron genómicamente, revelando la ausencia de genes asociados con la resistencia a los antibióticos, factores de virulencia o integrasas. Según el análisis de microscopía de barrido láser confocal, se encontró que la maduración de la biopelícula de un aislado de Salmonella, que exhibió una alta susceptibilidad a los fagos en cultivo líquido y ensayos de viabilidad de biopelículas en placas de 96 pocillos, pero tenía valores bajos para EOP, fue inhibida y controlada por el fago. cóctel. Estas observaciones indican que los fagos podrían controlar y eliminar las biopelículas de Salmonella durante todo su proceso de crecimiento y maduración, a pesar de sus bajos valores de EOP. Además, el uso de ensayos de infección en cultivos líquidos permite un estudio más preciso de las interacciones de los fagos para el diseño de cócteles de forma rápida y sin esfuerzo. Por lo tanto, la integración de estrategias y técnicas para evaluar de manera integral el rango de huéspedes y la actividad lítica de los bacteriófagos en diferentes condiciones puede demostrar con mayor precisión el potencial antibacteriano de los cócteles de fagos.

Salmonella spp. son un patógeno humano frecuente reconocido mundialmente como una amenaza para la salud pública1. Entre los patógenos transmitidos por los alimentos, Salmonella ocupa el tercer lugar entre las principales causas de muerte y, por tanto, también representa una carga económica importante. El último informe de la Organización Mundial de la Salud sobre la carga mundial de enfermedades transmitidas por alimentos estimó que de 88 millones de casos anuales causados ​​por Salmonella en todo el mundo, 123.000 resultaron en la muerte y un total de 222.000 años de vida se vivieron con discapacidad1.

Una de las principales características de Salmonella spp. lo que permite su supervivencia en ambientes hostiles es la formación de comunidades complejas asociadas a la superficie –biopelículas–, lo que dificulta el control de su proliferación, especialmente en granjas avícolas, ya que más del 50% de las cepas de Salmonella aisladas de pollos sacrificados en Brasil demuestran la capacidad para formar biopelículas2,3,4,5. Las biopelículas aumentan la tolerancia a los biocidas6,7, dada la organización de las células dentro de la matriz polimérica, lo que reduce la penetración del agente biocida y hace que las bacterias persistan en los ambientes de procesamiento de alimentos por largos períodos5,8.

Por lo tanto, es de gran importancia desarrollar estrategias para el control de Salmonella en la producción avícola, con el objetivo de reducir el uso de antibióticos debido al surgimiento de microorganismos multirresistentes9,10. En este escenario, los bacteriófagos están ganando interés como agentes para inhibir o alterar biopelículas11,12,13.

Descubiertos inicialmente por Frederick Twort y Felix D'Herelle, los bacteriófagos (fagos) son virus que infectan específicamente a las bacterias14,15. Como pueden desencadenar la lisis de sus huéspedes al final de la multiplicación, los fagos líticos se han utilizado en la práctica médica en países del Este como Polonia y Georgia desde su descubrimiento, reemplazando a los antibióticos convencionales o en combinación con ellos11,14. Numerosos estudios han documentado los fagos como una herramienta útil para la inactivación y el control de patógenos transmitidos por los alimentos14,16,17,18, lo que permitió que los productos basados ​​en fagos contra Salmonella spp. para ser aprobado como Generalmente Reconocido como Seguro (GRAS) por la Administración de Medicamentos y Alimentos de los EE. UU. (FDA)13,16,19.

Los fagos se pueden aplicar como control biológico ya sea como un solo tipo de fago (monófago) o en un cóctel que comprende varios fagos20,21. Combinando varios fagos, es posible aumentar el espectro de acción hacia el número de cepas que los fagos pueden infectar, así como evitar la resistencia bacteriana a los fagos, que puede ocurrir rápidamente en los casos en que se utiliza un solo fago11,20. Por tanto, es necesario investigar el rango de huéspedes y la virulencia de los fagos que constituyen el cóctel para asegurar su eficacia11,22,23.

Aunque no existen pautas definidas para estandarizar el desarrollo de un cóctel optimizado, se han desarrollado algunas técnicas y protocolos como PhageScore24, Virulence Index11,23 y Breadth and Depth of the cocktail21 para cuantificar la eficiencia de los fagos y determinar el mejor enfoque para el cóctel. diseño. Por lo tanto, este estudio demuestra la caracterización de cuatro fagos, evaluando el potencial de un cóctel propuesto para el control biológico de Salmonella spp. Además, los experimentos propuestos proporcionan datos cuantitativos para evaluar la virulencia de los fagos, su capacidad para alterar biopelículas, así como la seguridad de los fagos en relación con el ciclo lítico, los genes de virulencia bacteriana y los genes de resistencia.

Primero se aislaron un total de 24 fagos para 11 aislados de Salmonella de 50 (Tabla complementaria S1) utilizados para el enriquecimiento. Los fagos se seleccionaron basándose en la morfología de las placas (tamaño de la placa y turbidez), que varían de 0,3 a 1,1 mm de diámetro, y el huésped utilizado para el aislamiento, es decir, placas de distintos huéspedes se consideraron fagos diferentes. Sin embargo, como se analiza más adelante, el mismo fago podría exhibir diferentes morfologías de placa para diferentes aislados bacterianos.

Se seleccionaron cuatro fagos de los 24 primeros fagos aislados para una mayor caracterización, ya que exhibían una amplia gama de huéspedes para 50 aislados de Salmonella que comprenden 16 serotipos distintos (Figura complementaria S1) en el ensayo Streak Spot Test (SST). Según la clasificación filogenética de los fagos, se denominaron Tequintavirus phA11, Tequintavirus phC11, Tequintavirus phB7 y Tequintavirus phC17, y de ahora en adelante se llamarán simplemente phA11, phC11, phB7 y phC17. Los resultados del ensayo SST (Figura complementaria S1) demostraron un amplio rango de huéspedes iniciales para los cuatro fagos seleccionados con porcentajes de actividad lítica, es decir, el porcentaje de bacterias que presentaron una inhibición del crecimiento cuando entraron en contacto con la suspensión de fagos, que van desde el 50%. a phA11, 58% a phC11, 66% a phB7 y 66% a phC17.

Los 36 aislados sensibles en el ensayo SST se utilizaron para la evaluación de la formación de placas mediante el método de eficiencia relativa de siembra (EOP) (Fig. 1) y para evaluar la virulencia de los fagos mediante virulencia local en la multiplicidad de infección (MOI) 1 (v1). ) análisis (Fig. 2). EOP evalúa la capacidad de los fagos para formar placas comparando la cantidad de placas que un fago puede formar en una cepa/aislado bacteriano determinado con el número de placas más alto obtenido para ese fago entre el grupo de bacterias analizadas. Por lo tanto, la cepa/aislado bacteriano con el mayor número de placa formada para un fago específico se usó como referencia para ese fago y, en consecuencia, tenía un valor de EOP de 1,0. Cada fago formó el mayor número de placas en diferentes aislados bacterianos: para phA11, fue el aislado 1075786; para phC11 fue el aislado 1079411; para phB7, fue el aislado SSP13; y para phC17, fue el aislado SA17. Además, los cuatro fagos formaron el mayor número de placas en aislados bacterianos diferentes de aquellos de los que fueron aislados. Respecto a v1, se puede definir como la capacidad del fago para inhibir el crecimiento de una bacteria en cultivo líquido en MOI 1. Hubo diferencia en el rango de hospedadores obtenido en cada método y la clasificación de la virulencia de los fagos y cóctel. En la Tabla 1 se describe la clasificación de los fagos en cada método, destacando el phB7 que, según v1, presentó alta actividad lítica frente al 36,1% de los aislados, mientras que para EOP, el 19,4% de los aislados presentaron alta producción de placas. Para phC11 se observó la misma característica, donde presentó alta actividad lítica en v1 frente al 39,9% de los aislados, mientras que para EOP, solo el 13,9% de los aislados tuvieron alta producción de placas. El fago phC11 tiene un promedio de v1 y EOP de 0,428 y 0,135, respectivamente, mientras que para el fago phB7, el promedio de v1 y EOP es de 0,423 y 0,319, respectivamente. Las diferencias entre los valores de v1 y EOP para phC11 y phC17 se intensificaron en la clasificación “Ineficiente”, con porcentajes de v1 de 19,4% y 38,9% y porcentajes de EOP de 55,6% y 75,0%, respectivamente. Sin embargo, el cóctel no tuvo cepas en la clasificación “Ineficiente”, considerando v1 y alta actividad lítica contra el 50% de todos los aislados analizados. Para algunas bacterias, el cóctel presentó interacciones positivas. La cepa 14344 tratada con los fagos phA11, phC11, phB7 y phC17 presentó puntuaciones v1 de 0,483, 0,456, 0,397 y 0,435, respectivamente (Fig. 2). Por el contrario, la puntuación v1 del cóctel aumentó a 0,999 (Fig. 2). Se observaron patrones análogos para los aislados SSF19 y SSP09 (Fig. 2).

Mapa de calor de la eficiencia relativa del revestimiento para los fagos phA11, phC11, phB7 y phC17 para 36 aislados de Salmonella. Los valores representan el promedio de tres réplicas. El valor de EOP para la combinación fago-bacteria se clasificó como “Alto” ​​para proporciones ≥ 0,5, “Medio” para proporciones ≥ 0,1 y < 0,5, “Bajo” para valores > 0,001 y < 0,1, e “Ineficiente” para proporciones ≤ 0,001 .

Mapa de calor de virulencia local de MOI 1 (v1) para los fagos phA11, phC11, phB7, phC17 y cóctel de fagos para 36 aislados de Salmonella. Los valores representan el promedio de tres réplicas. Las curvas de crecimiento se muestran en la figura complementaria S2. La puntuación de virulencia local se clasificó como "alta" para v1 > 0,5, "media" para 0,2 ≤ v1 ≤ 0,5, "baja" para 0,001 ≤ v1 < 0,2 e "ineficiente" para v1 < 0,001.

Esta diferencia entre los resultados de las dos pruebas se puede ver mejor en la Fig. 3, en la que los resultados se representaron para compararlos entre sí en un diagrama de puntos. La escala de colores representa los valores de EOP y el tamaño de punto representa los valores de v1 para cada combinación de fago-bacteria. Los datos se ordenan según la v1 media más alta de los cuatro fagos hasta los valores más bajos de arriba hacia arriba. Los fagos phA11, phC11 y phC17 demuestran un patrón de puntos similar, aunque phC11 tenía la capacidad de controlar el crecimiento de algunos aislados que phA11 y phC17 no podían. De 36 aislados de Salmonella, solo 5 (14%) demuestran una correlación directa de susceptibilidad a fagos entre EOP y v1 para los fagos phA11 y phC11. Para el fago phC17, esta diferencia es aún mayor, y solo 1 (3%) aislado demuestra la correlación entre las pruebas de susceptibilidad a fagos. Por otro lado, phB7 presenta una buena capacidad para formar placas, lo que puede verse como una correlación general de susceptibilidad entre EOP y v1 una vez que la escala de colores y el tamaño de los puntos se distribuyen de manera más homogénea. Se pueden ver puntos grandes (valores v1 altos) con color púrpura (valores EOP bajos) para todos los fagos excepto phB7, como una demostración de las diferencias en la evaluación de la actividad lítica del fago dependiendo del fago analizado.

Diagrama de puntos para comparar los valores de virulencia local y eficiencia relativa de las placas para los fagos phA11, phC11, phB7 y phC17. El tamaño del punto en la intersección de bacteriófagos/bacterias es proporcional al valor medio de virulencia local. El color de la escala es proporcional a los valores medios de EOP.

Los bacteriófagos se caracterizaron por su máxima producción y resistencia a diferentes condiciones fisicoquímicas.

Los cuatro bacteriófagos seleccionados produjeron la progenie más alta en diferentes multiplicidades de infección (MOI) (Figura complementaria S3), que luego se utilizó en los experimentos posteriores para obtener la máxima producción de fagos. Debido al uso de 108 UFC/mL (> 107 UFC/mL) de cepa huésped, suponemos que el 100% de la adsorción de fagos se ha producido poco después de la adición de fagos25.

La estabilidad de los bacteriófagos se estudió a ocho temperaturas diferentes (-20 °C, 4 °C, 25 °C, 30 °C, 37 °C, 50 °C, 70 °C y 90 °C) y tres tiempos diferentes de incubación (1 h, 24 h y 7 días, excepto 50 °C, 70 °C y 90 °C) (Figura complementaria S4). El almacenamiento a 4 °C se consideró el control de estabilidad ya que es la temperatura utilizada para almacenar el stock de bacteriófagos. Nuestros resultados demuestran que todos los fagos exhiben una buena estabilidad en las temperaturas probadas, excepto 70 °C y 90 °C. El fago phC17 fue menos estable a 30 °C y 37 °C en 24 h y 7 días, disminuyendo alrededor de 0,8 log en comparación con 1 h. Aunque los fagos tuvieron reducciones en los títulos en 7 días de incubación, en general demostraron una buena estabilidad. Tras la exposición a una temperatura de 50 °C durante 1 h, los cuatro fagos exhibieron una estabilidad considerable, sin observarse reducción en las cantidades de fagos. Sin embargo, al extender el período de incubación a 24 h, se hizo evidente una reducción en las concentraciones de fagos. Posteriormente, se probó la resistencia de los fagos a una temperatura superior a 90 °C, tanto durante 1 h como durante 24 h. Los cuatro fagos mostraron una notable susceptibilidad a esta temperatura elevada, ya que sus concentraciones cayeron por debajo del límite de detección, haciéndolos inviables después de la exposición a 90 °C. A una temperatura intermedia de 70 °C, la respuesta de los cuatro fagos varió. Específicamente, el fago phB7 mostró una notable falta de resistencia, mostrando una disminución en la concentración después de 1 h de exposición, así como una ausencia total de placas después de 24 h de incubación. Por el contrario, los otros tres fagos demostraron diversos grados de resistencia a 70 °C, como lo demuestran las reducciones logarítmicas en la concentración de fagos después de 1 h. Posteriormente, tras el período de incubación de 24 h, no se detectaron placas para estos tres fagos, lo que significa que su viabilidad estaba comprometida a esta temperatura.

Además, la estabilidad de los fagos se evaluó en un rango de pH de 2,5 a 12,5 al mismo tiempo de incubación del experimento de estabilidad de la temperatura (Figura complementaria S5). Todos los fagos se inactivaron en todos los momentos a pH 2,5 y la concentración estuvo por debajo del límite de detección. A pH 3,5, todos los fagos permanecieron activos con 1 h de incubación, con una ligera reducción del título. Sin embargo, a las 24 h de incubación, solo phA11 permaneció activo, disminuyendo alrededor de 1 log de fagos viables en comparación con 1 h de incubación. Ninguno de los fagos permaneció activo dentro de los 7 días posteriores a la incubación a pH 3,5. Todos los fagos fueron detectables en todos los puntos de tiempo para los puntos de pH restantes, excepto los fagos phC11 y phB7 a pH 12,5.

Se utilizaron treinta y cinco aislados de Salmonella que comprenden 14 serovares diferentes para evaluar la actividad antibiopelícula del cóctel de fagos. Se utilizó un cóctel de fagos compuesto por cuatro fagos a una concentración final de 5 × 107 PFU/mL de cada fago para tratar durante 24 h las biopelículas. Los resultados demostraron una buena capacidad de control o eliminación de biopelículas (Fig. 4). El cóctel fue capaz de controlar el crecimiento de biopelículas de productores de biopelículas fuertes (Fig. 4a) y moderados/débiles (Fig. 4b), controlando o eliminando la biopelícula de 23 (66%) de 35 aislados probados (p <0,05, dos ANOVA de dos vías y prueba de comparación múltiple post hoc de Tukey). No se detectaron células sésiles después del tratamiento con fagos para los aislados 14339, SK21 y SA17, lo que indica la eliminación completa de la biopelícula. Se puede observar una reducción significativa de los valores de DO de los fagos tratados en comparación con la condición de control de biopelícula de 24 h (p <0,05, ANOVA de dos vías y prueba de comparación múltiple post hoc de Tukey) para los aislados SG, SPJF, 654, 926, SSF16 y SSP13. , lo que indica que aunque las células bacterianas no fueron erradicadas, el cóctel de fagos pudo reducir la biopelícula con 24 h de tratamiento. Para 14 aislados, el cóctel de fagos fue capaz de controlar el crecimiento de la biopelícula, manteniendo la biopelícula durante 24 h al mismo nivel que cuando se aplicó el cóctel o ralentizando el crecimiento de la biopelícula, hecho que se observó con diferencias significativas (p < 0,05, dos ANOVA de dos vías y prueba de comparación múltiple de Tukey post hoc) de la condición tratada con fagos en comparación con el control de biopelícula de 48 h, pero sin diferencia o ligeramente aumento (p <0,05, ANOVA de dos vías y prueba de comparación múltiple de Tukey post hoc) en comparación con la biopelícula de 24 h control. No se observó ningún aumento significativo de biopelículas (p > 0,05, ANOVA de dos vías y prueba de comparación múltiple de Tukey post hoc) para los fagos tratados en comparación con el control de biopelículas de 48 h, lo que indica que los fagos en el cóctel no aumentaron el crecimiento de las biopelículas para ninguno de los aislados analizados. .

Datos del ensayo de biopelículas MTT para cóctel de fagos. (a), aislados de Salmonella clasificados como fuertes productores de biopelículas tratados con cóctel de fagos durante 24 h. (b), aislados de Salmonella clasificados como productores de biopelículas moderados o débiles tratados con cóctel de fagos durante 24 h. Todos los datos se presentan como la DO media (570 nm) normalizada al límite de densidad óptica (ODc) de tres réplicas con barras de desviación estándar para todos los aislados bacterianos. Los puntos de datos individuales se indican con puntos. ***indica una diferencia estadísticamente significativa (p < 0,001, ANOVA de dos factores y prueba de comparación múltiple de Tukey post hoc). Para mejorar la estética de los gráficos, algunas identificaciones de muestras bacterianas se redujeron a los últimos tres números. Por lo tanto, donde dice 786, lea 1075786; 654, léase 1084654; 926, léase 1076926; 484, lea 1081484; 617, léase 1088617; 411, léase 1079411; 225, lea 1080225.

Con base en estos resultados, se seleccionó Salmonella SG para un análisis más detallado de las interacciones de los fagos con la biopelícula, ya que presentó diferencias considerables entre las tres condiciones probadas. Se realizó un análisis comparativo de controles y biopelículas tratadas con fagos mediante microscopía de barrido láser confocal CLSM para comprender mejor los efectos de los fagos en la estructura de la biopelícula. Se tomaron seis imágenes y se eligió una para representar cada condición. Después de 24 h de incubación, el control de biopelícula presentó un espesor de alrededor de 20 µm (Fig. 5a y b). El control de biopelícula de 48 h presentó una biopelícula bien estructurada y un espesor de alrededor de 20 µm pero con mayor densidad celular (Fig. 5c yd) en comparación con el control de 24 h. El espesor de la biopelícula (4 µm) y la densidad celular se redujeron después del tratamiento con cóctel de fagos (Fig. 5e yf) durante 24 h. Para el análisis cuantitativo y la comparación de las imágenes, se cuantificó la intensidad de fluorescencia de DAPI (un marcador de ADN fluorescente) (Fig. 6) y mostró patrones similares a los demostrados en el ensayo de biopelícula MTT, reforzando la actividad de control del crecimiento de la biopelícula del cóctel de fagos contra esta bacteria. aislar. La condición tratada con fagos presentó, en promedio, una reducción significativa (p <0,0001, ANOVA unidireccional y prueba de comparación múltiple post hoc de Tukey) de alrededor de siete veces en la intensidad de la fluorescencia en comparación con el control de biopelícula de 48 h. No se observaron diferencias significativas (p = 0,0565, ANOVA unidireccional y prueba de comparación múltiple de Tukey post hoc) en la intensidad de fluorescencia para la comparación entre los fagos tratados y el control de biopelículas de 24 h, aunque se observó una tendencia a la reducción de la densidad celular tanto en la cuantificación como en los tratamientos con fagos. panel (Fig. 6) y en las imágenes representativas (Fig. 5).

Imágenes CLSM representativas de biopelículas de Salmonella enterica serovar Gallinarum SG teñidas con DAPI de 24 h y 48 h en diferentes condiciones. Las células SG se cultivaron a 37 °C durante 24 h (ayb) y 48 h (cyd) sin adición de cóctel de fagos para el crecimiento de biopelículas. Se añadió un cóctel de fagos (2 x 108 PFU/ml de todos los fagos) a biopelículas de 24 h y se incubó durante 24 h (e y f). Las barras de escala representan 10 µm.

Intensidad de fluorescencia DAPI de imágenes CLSM de biopelículas de Salmonella enterica serovar Gallinarum SG. Los datos se presentan como la media de seis imágenes de diferentes campos con barras de desviación estándar. Los puntos de datos individuales se indican con puntos o triángulos. ****indica una diferencia estadísticamente significativa (p < 0,0001, ANOVA unidireccional y prueba de comparación múltiple de Tukey post hoc) entre los grupos.

La secuenciación se realizó en Illumina MiSeq y las secuencias de pares finales (2 × 250 bases) se ensamblaron con CLC Genomics Workbench (Qiagen). Con Trimmomatic26, las lecturas originales se filtraron para eliminar regiones de baja calidad. Seqtk (https://github.com/lh3/seqtk) creó una submuestra del total de lecturas con 50.000 lecturas (la mitad para R1 y la otra mitad para R2). Este subconjunto de lecturas se utilizó para el ensamblaje con SPAdes27, generando un único contig que contiene todo el genoma del fago. El contig fue seleccionado para el análisis posterior.

El análisis utilizando ABRIcate con la base de datos Resfinder (https://github.com/tseemann/abricate)28 mostró la ausencia de genes de resistencia dentro de los cuatro genomas. Los datos de anotación de RAST29 y PHASTER30 sugirieron que no se encontraron genes de integrasa en los cuatro genomas, y las búsquedas de BLASTN con genes de integrasa de genomas de fagos cercanos como consultas también reafirmaron la ausencia de esos genes.

La comparación circular de genomas de fagos utilizando BRIG31 y las comparaciones intergenómicas con VIRIDIC32 muestran similitud entre los cuatro fagos analizados. La alineación del genoma de phC11 con phA11 demuestra que la principal diferencia genómica entre los fagos ocurre entre 70 y 60 kpb con pequeñas regiones no homólogas en el genoma de phC11 (Fig. 7a). Los fagos phA11 y phC11 demuestran una alta similitud, siendo asignados a la misma especie con un 96,4% de similitud intergenómica33 según el umbral de especie estándar del 95% de VIRIDIC (Fig. 7b). La comparación circular de los genomas de phB7 y phC17 con el genoma de phA11 demuestra menos similitud que phC11, con varias regiones no homólogas en sus genomas cuando se alinean con phA11 (Fig. 7a). Los fagos phB7 y phC17 tienen 76.8% y 86.2% de similitud intergenómica con phA11 (Fig. 7b) como lo demuestra VIRIDIC, respectivamente, demostrando que aunque están clasificados dentro del mismo género (>70%), son de especies diferentes (< 95%). La similitud intergenómica entre phB7 y phC17 es del 86,5%, lo que también los clasifica como especies diferentes dentro de un mismo género (Fig. 7b). Esto lo reafirma el análisis de filogenia realizado por VICTOR34, que agrupó los cuatro fagos dentro de una misma familia y género. Sin embargo, los resultados de VICTOR diferenciaron todos los fagos en diferentes especies, incluidos phA11 y phC11, aunque su distancia filogenética es baja (Fig. 7c). Esta diferencia entre los resultados de VIRIDIC y VICTOR con respecto al nivel de especie se puede explicar por la diferencia en los cálculos y umbrales de especie utilizados para cada uno. Los cuatro fagos se clasificaron en la clase Caudoviricetes, familia Demerecviridae, subfamilia Markadamsvirinae y género Tequintavirus.

Análisis del genoma de los fagos phA11, phC11, phB7 y phC17. (a), Alineamiento genómico múltiple de los cuatro fagos que componen el cóctel. El genoma de phA11 se utiliza como referencia y la alineación es un BLASTn por pares realizado utilizando BRIG. La anotación y descripción de los fagos individuales se muestran en las Figuras complementarias S6, S7, S8 y S9. (b), Mapa de calor de similitudes intergenómicas e indicadores de alineación para los cuatro fagos del cóctel. En la mitad derecha, la intensidad del color se basa en la similitud intergenómica de los genomas de los fagos y los números representan los valores de similitud para cada par. En la mitad izquierda, se representan tres valores indicadores para cada par de genomas, en orden de arriba a abajo: fracción alineada del genoma 1 (para el genoma que se encuentra en la fila), relación de longitud del genoma (para el par de genomas) y fracción alineada. genoma 2 (para el genoma encontrado en la columna)32. (C), árbol del método de filogenia a distancia del genoma filogenómico-BLAST (GBDP) inferido mediante la fórmula D0. Las longitudes de las ramas de los árboles VICTOR resultantes se escalan en términos de la fórmula de distancia respectiva utilizada. La agrupación OPTSIL arrojó 29 grupos de especies, un grupo de género y un grupo de familias34. Las formas y colores resaltan las diferencias y similitudes en la clasificación filogenética de los fagos y en el contenido de G+C. Todos los fagos pertenecen a la misma familia y género ya que todos tienen la misma forma y color (cuadrado verde) en la columna de familia y género. En cuanto a las especies, existe mayor diversidad entre los fagos, donde cada fago se indica como una especie diferente.

Los genes de holina y endolisina se encontraron adyacentes en los cuatro genomas (Figuras complementarias S6, S7, S8 y S9). Los genes de endolisina y holina de los fagos phA11 y phC11 son idénticos. La similitud exacta se puede observar para los fagos phC17 y phB7, lo que demuestra que incluso con genes de holina y endolisina idénticos, existen diferencias en el rango de huéspedes de los fagos. Los genes de holina de los fagos phA11/phC11 y phC17/phB7 mostraron una similitud del 95,74%, aunque los genes de endolisina mostraron una similitud del 72,22%, lo que demuestra regiones más conservadas de los genes de holina que los genes de endolisina para los cuatro fagos. BLASTn de los genes de endolisina de los fagos phA11/phC11 mostró una alta similitud (>90%) con solo cinco fagos diferentes, infectando a Salmonella enterica, Shigella sp. y Escherichia coli. Para los genes de endolisina de los fagos phC17/phB7, BLASTn mostró una alta similitud (> 90%) con setenta y cinco fagos diferentes, infectando Salmonella enterica, Escherichia coli y Klebsiella pneumoniae.

Los resultados del análisis de los genes de las fibras de la cola previstos mostraron que cada fago tenía un número diferente de genes relacionados con ellos. phA11 tenía once genes predichos como "fibra de cola de fago", mientras que phC11 tenía doce genes. Para los fagos phC17 y phB7, el número de genes predichos fue diez y ocho, respectivamente. La alineación de todos estos genes utilizando Geneious versión 2023.1 (Biommaters, Inc., Nueva Zelanda) demostró que las fibras de cola de fago predichas de los fagos phA11 y phC11 comparten el 98,38 % de la identidad, siendo las más idénticas entre los cuatro fagos. Dado que las fibras de la cola del fago están estrechamente relacionadas con la infección por fagos y, en consecuencia, con el rango de huéspedes, esta alta identidad podría estar relacionada con los rangos de huéspedes phA11 y phC11, que son similares (Figs. 1 y 2), especialmente considerando la EOP. phB7 tuvo la identidad más baja entre los cuatro fagos al considerar las fibras de la cola del fago predichas, con 78,08%, 80,80% y 81,07% para los fagos phA11, phC11 y phC17, respectivamente. Además, tiene el número más bajo de genes de fibras de cola de fago predichos, pero el rango de huéspedes más amplio tanto en EOP como en v1. Estas diferencias pueden desempeñar un papel importante en el rango de huéspedes de phB7, que podría considerarse un bacteriófago generalista en lugar de uno especializado, especialmente en el análisis de EOP. Por lo tanto, se deben realizar estudios más detallados sobre el rango de huéspedes y el número e identidad de las fibras de la cola del fago para caracterizar completamente su influencia.

La terapia con fagos se considera una alternativa prometedora a los antibióticos en la lucha contra bacterias patógenas, tanto en la medicina humana como en la producción animal. Los bacteriófagos son extremadamente específicos de determinadas bacterias; por lo tanto, su uso en un cóctel con diferentes fagos aumenta el rango de huéspedes y reduce la probabilidad de resistencia. Existen numerosas técnicas y protocolos para evaluar la actividad lítica de los bacteriófagos, siendo los más utilizados los Spot Test Assays y EOP11,22. A efectos de cribado, el Spot Test es una técnica habitual, aunque sobreestima la actividad lítica de los fagos debido al fenómeno de “lisis desde fuera”11,35, que fue detectado en nuestro estudio al comparar SST con EOP y v1. Por otro lado, EOP indica infección productiva, a la que nos referimos como capacidad de formar placas. Se sabe que un mismo fago podría formar placas diferentes (morfología, tamaño y turbidez) en diferentes cepas bacterianas y que los sistemas de defensa específicos del fago influyen directamente en esto. Varios sistemas de defensa de fagos descubiertos recientemente, como PD-λ-5, PD-λ-2, PD-T7-2, PD-T7-4, retron-Eco8, viperinas y muchos otros, reducen el tamaño de las placas de fagos T7. , T5, T3 y λvir36,37,38. Además, dependiendo del sistema de defensa de fagos presente en la bacteria, hay una reducción en el número de placas de diez veces a placas no visibles, impactando directamente el valor de EOP descrito36,39.

En ensayos de infección en cultivo líquido, como v1, la presencia de sistemas de defensa de fagos, como viperinas, retrasa o previene el colapso del cultivo38, impactando el valor de v1. Los sistemas de infección abortiva como PD-T4-636 y los sistemas de defensa de toxina-antitoxina como la subfamilia toxSAS CapRel40 recientemente descrita impactan directamente el comportamiento de la curva de crecimiento del cultivo líquido bacteriano infectado con fagos, especialmente con MOI bajas. Por otro lado, los sistemas de inmunidad directa no difieren en el comportamiento de la curva de crecimiento de los cultivos líquidos infectados con fagos en comparación con el control no infectado en MOI bajas y altas, una vez que los sistemas de inmunidad directa evitan que los fagos se multipliquen sin un comportamiento suicida altruista demostrado por los sistemas de infección abortivos36. Por lo tanto, los sistemas de defensa de los fagos impactan en las diferencias en la susceptibilidad de las bacterias al mismo fago cuando se analizan mediante diferentes técnicas. Los fagos phA11, phC11 y phC17 exhiben patrones de distribución de datos similares en la Fig. 3, en la que la mayoría de los aislados tienen un tamaño de punto grande (v1 alto) pero un color púrpura (EOP bajo), lo que demuestra que, aunque poseen una buena actividad lítica contra algunos aislados , no son “formadores de placa” adecuados. Se observa un patrón diferente para phB7, que muestra una alta capacidad para formar placas en numerosos aislados, como lo demuestra una distribución más homogénea del tamaño y el color de los puntos. Esta evidencia muestra que los métodos utilizados podrían dar como resultado diferentes clasificaciones de la actividad de los fagos, impactando directamente en la elección de los fagos que compondrán un cóctel. Es de destacar la diferencia entre los fagos phC11 y phB7 con respecto a los patrones de puntos en la Fig. 3, aunque demuestran un promedio v1 similar. Por lo tanto, utilizar únicamente puntuaciones de EOP para clasificar los fagos podría conducir a una subestimación de la actividad lítica y, además, la EOP no puede detectar interacciones de fagos en cócteles. Sin embargo, esta diferencia no se observó para el fago phB7, lo que demuestra que dependiendo del fago analizado, podrían existir diferencias o no en los resultados y que se deben considerar otras cuestiones en cuanto a la elección de los métodos. Otra posibilidad de utilizar ensayos de infección en cultivos líquidos es observar los efectos sinérgicos/antagonistas de la combinación de fagos11 o de combinaciones de fagos y antibióticos, un factor importante en el diseño de cócteles de fagos.

Es importante resaltar que varios factores influyen en la formación de placa. Dependiendo del agente gelificante y su concentración, la presencia de cationes divalentes, el medio de crecimiento utilizado y la fase de crecimiento del huésped, el número y el tamaño de las placas formadas pueden ser diferentes41. Además, como afirman Abedon y Yin41, “el fallo en la formación de placa no equivale necesariamente a la inviabilidad del virión”, por lo que se recomienda aplicar criterios más estrictos que la ausencia de formación de placa antes de declarar que un fago es incapaz de infectar a un determinado aislado bacteriano. . Considerando los valores de EOP de los fagos para Salmonella SG, sólo phB7 tenía una alta capacidad para formar placas. Sin embargo, los cuatro fagos podrían retrasar o controlar el crecimiento de este aislado en cultivo líquido o incluso eliminar la biopelícula durante su formación cuando se combinan, como lo demuestran el ensayo MTT y las imágenes CLSM.

Las bacterias con capacidad de formar biopelículas reducen la eficacia de los tratamientos con antibióticos, lo que supone una grave amenaza para el control bacteriano. Por tanto, es fundamental buscar alternativas a los antimicrobianos capaces de reducir la formación de biopelículas. La inhibición de la biopelícula de Salmonella por parte de bacteriófagos ya ha sido descrita13,42,43. Estos estudios demostraron una capacidad notable para disminuir la cantidad de Salmonella Typhimurium y S. Enteritidis de las estructuras de biopelículas en placas de microtitulación de 96 pocillos utilizando cócteles de fagos a 107 y 108 PFU/ml. Nuestros resultados demostraron que el cóctel de fagos utilizado en este estudio tiene una alta capacidad para controlar o reducir la biopelícula respecto al serovar. Sin embargo, es fundamental señalar que se aplicaron bacteriófagos a biopelículas en formación, lo que demuestra que su uso profiláctico podría ser eficaz contra la formación de biopelículas en la cadena de procesamiento de alimentos44. Además, los fagos en el cóctel no aumentaron significativamente (p > 0,05, ANOVA de dos vías y prueba de comparación múltiple de Tukey post hoc) el crecimiento de la biopelícula para ninguno de los aislados analizados en el análisis, lo que refuerza la alta actividad lítica del fagos seleccionados. Esto es de especial interés ya que fagos específicos modulan varias propiedades de su huésped, incluida la posibilidad de aumentar la producción de biopelículas45. En las imágenes del CLSM se puede ver un análisis más detallado de la interacción de los fagos con la biopelícula de Salmonella. A las 24 h de incubación, la biopelícula no estaba madura, pero se pueden observar cúmulos celulares iniciales con alto espesor. Un cóctel de fagos aplicado en esta etapa podría detener la maduración del biofilm al reducir la densidad celular y evitar la aglomeración celular luego de 24 h adicionales de incubación ya que las células bacterianas no fueron erradicadas sino que se dispersan, lo que se puede inferir como un cierto nivel de Células mutantes resistentes a fagos. La eliminación de bacterias de la estructura de la biopelícula por fagos muestra diferencias en los efectos con respecto al número de fagos (fagos individuales o cóctel de fagos)46,47,48, los serovares de Salmonella, la etapa de maduración de la biopelícula y la composición de la biopelícula (mixta o única). especies) 49. Combinar la terapia con fagos con tratamientos alternativos o antibióticos puede ser una excelente estrategia para eliminar las células mutantes resistentes y erradicar las biopelículas. Un estudio reciente de Duarte et al.50 describió la actividad sinérgica de un solo fago y una proteína lítica derivada de fagos contra biopelículas estafilocócicas, lo que demuestra que la combinación de fagos con proteínas líticas podría ayudar a reducir el desarrollo de resistencia a los fagos. La combinación de fagos con antibióticos también fue eficaz contra las biopelículas, como lo demostraron Dickey y Perrot51, mostrando la prevención de bacterias resistentes a los antibacterianos, principalmente cuando se utilizaron primero los fagos y después los antibióticos. Sin embargo, la combinación antibiótico/fagos debe estudiarse cuidadosamente ya que podría aumentar la distribución de genes de resistencia a los antibióticos o tener un efecto antagónico, especialmente con fármacos que actúan inhibiendo la síntesis de ácidos nucleicos o proteínas52.

Nuestro estudio demostró que dependiendo de los protocolos utilizados para evaluar la variedad de bacteriófagos hospedadores, la eficacia de la inhibición bacteriana podría ser diferente, lo que impacta directamente en la selección de fagos para la composición del cóctel. La aplicación de ensayos de infección en cultivo líquido para la determinación del rango de hospedadores, como v1, permite la evaluación del cóctel de fagos sin esfuerzo y en menos tiempo que el EOP, y por lo tanto, podría aplicarse para el diseño del cóctel de fagos, ya que en los resultados del EOP, los fagos phA11, phC11 , y phC17 no mostró buenos valores de formación de placas para algunos aislados de Salmonella como el SG. Sin embargo, cuando se combinó con phB7, no se detectó crecimiento bacteriano en v1 y se observó control de biopelículas. Basándose únicamente en los valores de EOP, estos fagos no serían adecuados para evaluar la actividad antibiopelícula contra varios aislados de Salmonella, y este cóctel de fagos podría subestimarse. Por lo tanto, la combinación de estrategias y técnicas para una mejor evaluación del rango de huéspedes y la actividad lítica de los bacteriófagos en diferentes condiciones puede demostrar con mayor precisión el potencial antibacteriano de los cócteles de fagos. Esto podría facilitar el uso de métodos y algoritmos de alto rendimiento para optimizar el análisis de datos y la combinación de fagos para la composición del cóctel, acelerando el proceso de desarrollo de la terapia con fagos como una alternativa prometedora a los antibióticos.

Todas las bacterias se cultivaron en medio Miller Lysogeny-Broth (LB) (10 g/L de triptona, 5 g/L de extracto de levadura y 10 g/L de NaCl) o en placas de LB Miller Agar (LBA) (1,5 % de agar)53. Para los ensayos de placas se utilizó LB Miller Soft Agar (LBSA) (agar al 0,7%) suplementado con CaCl2 10 mM. Se utilizó caldo de infusión de cerebro-corazón (BHI) suplementado con 30% (v/v) de glicerol para almacenar aislados bacterianos a -80 °C. Se utilizó tampón de solución salina-magnesio (SM) (Tris-Cl 50 mM, NaCl 100 mM, MgSO4 8 mM) para el almacenamiento y la dilución de los fagos.

En este estudio, se utilizaron 50 aislados de Salmonella enterica subsp enterica (Tabla complementaria S1). La cepa estándar ATCC 13076 se adquirió de la American Type Culture Collection (ATCC, Gaithersburg, MD, Estados Unidos), mientras que las demás se aislaron de granjas avícolas comerciales en el estado de Paraná, Brasil, o formaron parte de la colección del Laboratorio de Estudios Básicos y Bacteriología Aplicada (Universidad Estatal de Londrina, Brasil). Todas las bacterias se almacenaron a -80 °C en BHI suplementado con 30% (v/v) de glicerol. En cada experimento, se prepararon cultivos frescos de 18 a 24 h colocando las bacterias en placas de LBA e inoculando una sola colonia en 5 ml de LB, incubando durante 18 a 24 h a 37 °C con agitación a 120 rpm.

Se recolectaron diferentes muestras ambientales de granjas avícolas y mataderos comerciales en el estado de Paraná, Brasil, incluidas muestras de excrementos de aves y muestras de aguas residuales de mataderos, y se utilizaron para el aislamiento de bacteriófagos como se describió anteriormente con algunas modificaciones54. En resumen, las muestras líquidas se centrifugaron a 5000 × g durante 10 minutos y el sobrenadante se recogió a través de un filtro de membrana de polietersulfona de 0,45 µm (membrana de baja unión a proteínas). Para muestras sólidas, se mezclaron 5 g de cada muestra con 10 ml de tampón de solución salina de magnesio (SM) en tubos de centrífuga de polipropileno estériles de 15 ml y se mezclaron completamente mediante inversión durante 10 minutos. Los tubos se centrifugaron a 5000 x g durante 5 minutos y el sobrenadante se recogió del mismo modo que para las muestras líquidas. Los sobrenadantes se utilizaron para el enriquecimiento de bacteriófagos.

El enriquecimiento de bacteriófagos se realizó como se describió anteriormente con algunas modificaciones54. Inicialmente, se mezclaron 5 ml del sobrenadante con 5 ml de LB de doble potencia suplementados con 20 mM de CaCl2 en tubos de centrífuga de polipropileno de 50 ml y se agregaron 100 µl de cultivo bacteriano en fase logarítmica. Se incubaron tubos de polipropileno con la mezcla durante 24 h a 37°C con agitación a 120 rpm. Luego, se añadió 5% (v/v) de cloroformo a los tubos, se mezcló por inversión durante 5 min y se centrifugó a 5000 xg durante 5 min. El sobrenadante se recogió y almacenó a 4 °C. La actividad de los fagos se detectó colocando 5 µL de cada sobrenadante en una franja de la cepa huésped en placas LBA suplementadas con 10 mM de CaCl2, y los resultados positivos se confirmaron mediante el método de superposición de agar para obtener placas individuales54. Las placas se seleccionaron en función de la turbidez, el diámetro y el tiempo de aparición. Las placas seleccionadas se retiraron del agar usando una punta de pipeta estéril, se inocularon en 1 ml de LB suplementado con CaCl2 10 mM en microtubos de 2 ml y se agregaron 100 µL de cultivo bacteriano en fase logarítmica. Las mezclas se incubaron a 37 °C durante 6 h y, posteriormente, los lisados ​​de fagos se extrajeron utilizando cloroformo al 5% y el procedimiento de centrifugación descrito anteriormente. Cada lisado se tituló utilizando el método de superposición de agar. Este proceso se repitió hasta que se obtuvo un morfotipo de placa para cada lisado.

El rango de huéspedes de los fagos aislados se determinó frente a 50 aislados de Salmonella utilizando el método Streak Spot Test (SST)54, y los sensibles se sometieron al método de Eficiencia relativa de Plating (EOP)22. Se utilizó la prueba Streak Spot para determinar el potencial bactericida de todos los fagos que se aislaron. Se seleccionaron fagos con la gama de huéspedes más amplia para determinar la EOP. Se calculó la EOP para cada fago usando el aislado bacteriano con recuentos máximos de placa frente a los aislados analizados, es decir, la UFP promedio en el aislado analizado dividida por la UFP promedio en el aislado con los recuentos máximos de placa. El valor de EOP para la combinación fago-bacteria se clasificó como “Alto” ​​para proporciones ≥ 0,5, “Medio” para proporciones ≥ 0,1 y < 0,5, “Bajo” para valores > 0,001 y < 0,1, e “Ineficiente” para proporciones ≤ 0,00122 . Se trazó un mapa de calor que compara los valores de EOP utilizando GraphPad Prism v. 9.1.1 (software GraphPad).

La actividad lítica en el ambiente líquido de fagos seleccionados se evaluó frente a los aislados sensibles en el ensayo Streak Spot Test según Haines et al.11 y Storms et al.23 con modificaciones. Inicialmente, se añadieron 100 µl de LB de doble concentración suplementado con CaCl2 10 mM a la placa de 96 pocillos de fondo plano. Posteriormente, los bacteriófagos se diluyeron para obtener 1,5 × 108 PFU/mL y se agregaron 50 µL a cada pocillo para evaluar la actividad lítica dinámica de los fagos, excepto en los controles y blancos positivos (bacterias y caldo LB) y negativos (solo caldo LB). La formulación del cóctel se realizó mezclando cada bacteriófago en una proporción de 1:1:1:1 para alcanzar una concentración final de 1,5 × 108 PFU/mL y proceder a fagos individuales. Los cultivos nocturnos de aislados de Salmonella en LBA se ajustaron a la escala de MacFarland 0,5 (1,5 × 108 UFC/mL) en solución salina (NaCl al 0,85%) y se agregaron 50 µL a cada pocillo, excepto en el control negativo y en blanco. Se añadió tampón SM a los controles positivo y negativo para alcanzar un volumen final de 200 µl. Los blancos tenían el mismo contenido que los controles negativos. Estas concentraciones se utilizaron para alcanzar una multiplicidad de infección (MOI) teórica de 1. La cubierta de la placa se retiró y se selló de forma segura utilizando una película de cloruro de polivinilo (PVC) plastificada permeable a los gases. La placa se incubó en el espectrofotómetro de microplacas Multiskan GO (Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finlandia) y se tomaron lecturas de DO (A595 nm) cada 15 minutos durante 12 h a 37 ° C. Cada prueba se repitió por triplicado para cada cepa de Salmonella y los datos se representaron como una curva de ensayo de destrucción única con la media de los valores utilizando Microsoft Office Excel v. 16.0.

El área debajo de las curvas se calculó utilizando la regla del trapezoide para cada prueba de 0 a 12 h. La virulencia local para MOI 1 (v1) se calculó basándose en los trabajos de Storms et al.23 y Haines et al.11 comparando el área integrada de una curva de prueba de fagos (Ai) con el área integrada de control positivo (libre de fagos). control) (A0), y los resultados se normalizaron entre un mínimo y máximo teórico de 0 y 1, respectivamente, según.

La puntuación de virulencia local se clasificó como "alta" para v1 > 0,5, "media" para 0,2 ≤ v1 ≤ 0,5, "baja" para 0,001 ≤ v1 < 0,2 e "ineficiente" para v1 < 0,001. Se trazó un mapa de calor que compara la puntuación v1 para fagos individuales y el cóctel utilizando GraphPad Prism v. 9.1.1 (software GraphPad). Se utilizó R v. 4.2.2 para trazar la comparación de EOP y v1 en un gráfico de puntos.

Para el ensayo MOI, asumimos que el 100% de la adsorción de fagos se produjo poco después de la adición de fagos a las bacterias25. Las reservas de bacteriófagos se diluyeron con tampón SM en series de diez veces. Los cultivos de hospedadores bacterianos (108 UFC/mL) se mezclaron con alícuotas de cada dilución del fago respectivo, lo que dio como resultado diferentes proporciones (10-7 a 1 UFP/UFC) por triplicado y se incubaron a 37 °C durante 18 h55. Los lisados ​​de fagos se titularon para determinar la producción más alta como la MOI óptima. El ensayo se llevó a cabo en tres momentos independientes.

La estabilidad de los fagos en diferentes pH y temperaturas se evaluó como se describió anteriormente56,57 con modificaciones. Inicialmente, los fagos se diluyeron en tampón SM (Tris-Cl 50 mM, NaCl 100 mM, MgSO4 8 mM) para alcanzar 108 PFU/mL, luego se agregaron 100 μL de cada fago en 900 μL de un tampón de pH universal (KCl 150 mM). , KH2PO4 10 mM, Na3C6H5O7 10 mM, H3BO3 10 mM) con pH ajustado con NaOH o HCl de 2,5 a 12,5. Se realizó un control con tampón SM (pH 7,4). Las suspensiones se incubaron a temperatura ambiente durante 24 h, y luego los fagos se diluyeron y se sembraron en placas utilizando el método de superposición de agar58 para el recuento. Al final de la prueba, la diferencia en la titulación con respecto a los experimentos de control nos permitió evaluar la viabilidad de los fagos.

Para evaluar la estabilidad de los fagos en diferentes rangos de temperatura, se incubaron en tampón SM (107 PFU/mL) y se almacenaron a − 20 °C, 4 °C (como control), 25 °C, 30 °C, 37 °C. C, 50 °C, 70 °C y 90 °C durante 1 h, 24 h y 7 días (excepto 50 °C, 70 °C y 90 °C). Después de la incubación, se recogió, diluyó y se sembró en placas una alícuota de 100 µl de cada fago para su enumeración.

Se utilizó la metodología de precipitación con polietilenglicol (PEG) con algunas modificaciones59 para concentrar y purificar fagos. Se transfirió un cultivo de 5 ml de la bacteria huésped con los fagos en la mejor MOI a 500 ml de medio LB para cultivo a 37 °C durante la noche. Se añadió cloroformo a los 500 ml de cultivo hasta una concentración final de 0,1% y se dejó reposar a temperatura ambiente durante 30 min. Se añadió NaCl al cultivo hasta una concentración final de 1 M, luego se incubó en un baño de agua con hielo durante 1 h. Posteriormente, el cultivo se centrifugó a 11.000 x g durante 10 minutos para eliminar los restos celulares y se añadió polietilenglicol 8000 (PEG8000) al sobrenadante hasta una concentración final del 10% (p/v). Esta suspensión se incubó en un baño de agua con hielo durante 1 h para precipitar las partículas de fagos. La suspensión se centrifugó a 11.000 x g durante 10 min y el sedimento se resuspendió en 5 ml de tampón SM, seguido de la adición de 5 ml de cloroformo y se mezcló completamente mediante inversión durante 5 min y se centrifugó a 5000 x g durante 5 min para separar. los fagos del PEG8000. Luego, se recogió la fase acuosa y se centrifugaron 3 ml de la suspensión concentrada de fagos a 110.000 x g durante 2 h. Se descartó el sobrenadante y el "gránulo vítreo" se resuspendió en tampón SM y se filtró a través de un filtro de membrana de polietersulfona con un tamaño de poro de 0,22 µm (membrana de baja unión a proteínas) y se almacenó a 4 °C.

El cóctel de fagos se probó para evaluar la actividad antibiopelícula contra biopelículas de Salmonella60,61,62. Las muestras de Salmonella que presentaron sensibilidad a los fagos se cultivaron en 5 ml de medio LB a 37 °C durante 18 a 24 h. Las muestras bacterianas se diluyeron 1:100 en medio LB y se añadieron 100 µl de cada una a placas de microtitulación de fondo plano de 96 pocillos por quintuplicado tanto para los controles como para los tratados con cóctel de fagos. Después de 24 h de incubación a 37 °C sin agitación, se eliminó la fase planctónica y cada pocillo se lavó dos veces con 100 µl de PBS precalentado (37 °C) (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 2 mM). Para el control de biopelícula de 24 h, se agregaron a cada pocillo 100 µL de MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio) a 0,25 mg/ml diluido en LB y se incubaron a 37ºC. °C durante 2 h protegido de la luz. Después de 2 h, se eliminó el MTT y se agregaron 100 µl de dimetilsulfóxido (DMSO) a los pocillos, y después de 15 minutos de solubilización, se tomaron lecturas de DO en A570 con el espectrofotómetro de microplacas Multiskan GO (Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finlandia). Para los grupos tratados con fagos, se agregaron a los pocillos 50 µl de cóctel de fagos (5 × 107 UFP de cada fago - 2 × 108 UFP/ml de todos los fagos) más 50 µl de medio LB de doble concentración. Para el control de biopelícula de 48 h, solo se agregaron 100 µL de LB precalentado a los pocillos, seguido de la incubación de la placa de microtitulación a 37 °C sin agitación. Después de 24 h de incubación, se eliminó la fase planctónica, se lavó cada pocillo, como ya se mencionó, y la detección/cuantificación de la biopelícula se realizó de acuerdo con los pasos descritos anteriormente. La producción de biopelículas se clasificó en negativa, débil, moderada y fuerte según el valor de corte, calculado según la siguiente fórmula, utilizando los valores de densidad óptica (DO)44:

ODcutoff (ODc): OD promedio del control negativo + (3 × desviación estándar de las OD del control negativo).

OD ≤ ODc = Biopelícula no productora;

ODc < OD ≤ (2 × ODc) = Productor de biopelícula débil;

(2 × ODc) < OD ≤ (4 × ODc) = Productor moderado de biopelículas;

OD > 4 × ODc = Fuerte productor de biopelículas.

La microscopía láser de barrido confocal se realizó como se describió anteriormente, con algunas modificaciones50. Para el análisis de microscopía confocal, se formaron biopelículas de 24 h y 48 h inoculando 2 ml de una suspensión de células de S. enterica Gallinarum (SG) diluida 1:100 de un cultivo ON en LB en una placa de 24 pocillos que contenía un cubreobjetos de vidrio circular en el fondo. . La placa se incubó en condiciones estáticas a 37 °C. Después de 24 h, se eliminó la fase planctónica de todos los grupos y la biopelícula se lavó dos veces con PBS precalentado (37 °C). Para el grupo de biopelículas de 24 h, se agregaron 400 µL de paraformaldehído y se incubaron durante 30 min a 37 °C con posterior doble lavado con PBS. A continuación, se agregaron 200 µl de diclorhidrato de 4´,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) a los pocillos para teñir y se incubaron durante 1 h a 37 °C. Después del período de incubación, los pocillos se lavaron con PBS y se retiró cuidadosamente el cubreobjetos, se añadió a un portaobjetos de microscopio con una gota de medio de montaje Fluoromount-G™ (Sigma-Aldrich F4680) y se realizaron imágenes de fluorescencia con un TCS. Microscopio láser de barrido confocal SP8 (Leica Microsystems, Mannheim, Alemania) utilizando un objetivo de agua de 60 ×. El microscopio confocal TCS SP8 utilizó el software LAS X (Leica Microsystems, Mannheim, Alemania). Para los grupos tratados con fagos, se agregaron a los pocillos medio LB precalentado (37 °C) y cóctel de fagos (5 × 107 PFU de cada fago − 2 × 108 PFU/mL de todos los fagos) y se incubaron durante más 24 h a 37 ºC. Para el control de biopelícula de 48 h, solo se añadió LB precalentado (37 °C) a los pocillos, seguido de una incubación a 37 °C sin agitación durante 24 h. Luego, se eliminó la fase planctónica, se lavó cada pocillo como ya se mencionó y se realizó la detección/cuantificación del biofilm de acuerdo con los pasos descritos anteriormente.

El ADN del fago se extrajo de una reserva de fagos altamente concentrada y purificada utilizando las metodologías descritas en otro lugar63 con algunas modificaciones. Las partículas de fagos purificadas se trataron con DNasa I (1 μg/mL) (Sigma-Aldrich) durante 15 minutos a temperatura ambiente, y luego la nucleasa se inactivó a 75 °C durante 5 minutos. Luego se agregaron proteinasa K (20 μg/mL) y dodecilsulfato de sodio (SDS) (1%) y la mezcla se incubó a 60 °C durante 1 h. A la fase acuosa se le añadieron 500 µL de cloroformo:alcohol isoamílico (24:1) y se centrifugó durante 5 min a 16.000 x g. La fase acuosa se precipitó con 0,8 veces el volumen de isopropanol y se centrifugó durante 30 minutos a 16.000 x g. El sedimento se lavó dos veces con etanol al 80%, se secó al aire brevemente y luego se usó agua desionizada para disolver el ADN genómico precipitado.

Antes de la secuenciación, la calidad y cantidad del ADN se estimaron utilizando un Qubit (Thermo Fisher Scientific) y mediante visualización después de la electroforesis en gel de agarosa. La biblioteca se construyó con el kit Nextera XT Illumina. La secuenciación se realizó en Illumina MiSeq, utilizando MiSeq Reagent 500V2. Las secuencias de los extremos de los pares (2 x 250 bases) se ensamblaron con CLC Genomics Workbench (Qiagen).

La calidad de todas las lecturas de la secuenciación se verificó utilizando FastQC64⁠ y sus parámetros de recorte de informes se definieron para Trimmomatic26⁠. Las lecturas resultantes de este filtrado se utilizaron para el ensamblaje del genoma con SPAdes27⁠. Se creó un subconjunto de las lecturas originales usando seqtk (https://github.com/lh3/seqtk) y se usó para ensamblar con SPAdes. Se compararon conjuntos con diferentes valores de k-mer utilizando QUAST65. El genoma completo se encontró dentro de un único contig seleccionado para su posterior análisis; Se comprobaron otros contigs con BLASTN para detectar posibles fragmentos.

Se utilizó VIRIDIC32 para calcular las similitudes intergenómicas de los cuatro fagos, con un umbral de especie del 95% y un umbral de género del 70%33. Para la representación circular de los cuatro genomas se utilizó el software BRIG31⁠. Las características que se muestran en las imágenes complementarias se seleccionaron mediante un script utilizando Biopython66⁠, y las características identificadas como "Proteína hipotética" y "Proteína de fago" se descartaron para fines de visualización.⁠

El análisis de filogenia y clasificación se llevó a cabo mediante el servicio web VICTOR (https://victor.dsmz.de), un método para la filogenia y clasificación basada en el genoma de virus procarióticos34. Todas las comparaciones por pares de las secuencias de nucleótidos se realizaron utilizando el método de filogenia a distancia Genome-BLAST (GBDP)67 en la configuración recomendada para virus procarióticos34. Las distancias intergenómicas resultantes se utilizaron para inferir un árbol de evolución mínimo equilibrado con soporte de ramas a través de FASTME, incluido el posprocesamiento SPR68 para cada fórmula D0, D4 y D6, respectivamente. El soporte de sucursales se dedujo de 100 réplicas pseudo-bootstrap cada una. Los árboles fueron enraizados en el punto medio69 y visualizados con ggtree70. Los límites de los taxones a nivel de especie, género y familia se estimaron con el programa OPTSIL71, los umbrales de agrupamiento recomendados34 y un valor F (fracción de enlaces necesarios para la fusión de grupos) de 0,572.

Se utilizó ABRIcate con la base de datos Resfinder para detectar la presencia de genes con resistencia a los antimicrobianos y factores de virulencia en los genomas (https://github.com/tseemann/abricate)28⁠. Para la llamada de genes, se utilizaron RAST29⁠ y PHASTER30⁠. La detección de ARNt se realizó con tRNAscan-SE73. El análisis de los genes de las fibras de la cola del fago previsto se realizó utilizando el software Geneious versión 2023.1 (Biommaters, Inc., Nueva Zelanda) (https://www.geneious.com).

Todos los genomas de fagos se enviaron a GenBank. Los números de acceso para todos los genomas de fagos son OQ680478, OQ680479, OQ680480 y OQ680481 para los fagos phA11, phB7, phC11 y phC17, respectivamente.

Se utilizó GraphPad Prism v.9.1.1 (software GraphPad) para el análisis estadístico de los ensayos de biopelículas. Los resultados se expresaron como media ± desviación estándar después del análisis con ANOVA unidireccional para datos de intensidad de fluorescencia DAPI o ANOVA bidireccional para datos de ensayo de biopelículas MTT con pruebas de comparación múltiple post hoc de Tukey para ambos, y p <0,05 se consideró significativo.

Los conjuntos de datos generados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a solicitud razonable, y la secuencia de ADN de los bacteriófagos está disponible en la base de datos GenBank con los números de acceso OQ680478, OQ680479, OQ680480 y OQ680481.

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Los autores agradecen a la Coordinación de Perfeccionamiento del Personal de Educación Superior (CAPES) por parte del Ph.D. Beca de la JMRWAVJ gracias beca CNPq (#309633/2021-4). Los autores agradecen al CMLP-UEL (Central Multiusuário de Laboratórios de Pesquisa da Universidade Estadual de Londrina) por el acceso gratuito al equipo.

Laboratorio de Bacteriología Básica y Aplicada, Universidad Estatal de Londrina, Londrina, PR, Brasil

Jhonatan Macedo Ribeiro, Giovana Nicolete Pereira, Renata Katsuko Takayama Kobayashi y Gerson Nakazato

Laboratorio de Bioinformática, Universidad Federal de Santa Catarina, Florianópolis, SC, Brasil

Itamar Durli Jr.

Laboratorio de Biotecnología de Microbios, Universidad Estatal de Londrina, Londrina, PR, Brasil

Gustavo Manoel Teixeira

Laboratorio de Dolor, Inflamación, Neuropatía y Cáncer, Universidad Estatal de Londrina, Londrina, PR, Brasil

Mariana Marques Bertozzi & Waldiceu A. Verri Jr

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JMR contribuyó a la concepción y redacción del estudio, diseño y planificación de los experimentos, realizando los experimentos, adquisición de datos, análisis, interpretación y redacción de este artículo. GNP lleva a cabo los experimentos, la adquisición de datos, el análisis y la redacción de este artículo. IDJ obtuvo y proporcionó muestras ambientales para el aislamiento de fagos, llevó a cabo los experimentos de aislamiento de fagos y revisó el artículo. GMT realiza el análisis bioinformático y la revisión de este artículo. MMB lleva a cabo el experimento de microscopía de barrido láser confocal, analiza e interpreta las imágenes y revisa este artículo. WAVJ contribuyó al análisis e interpretación de las imágenes de microscopía de barrido láser confocal y a la revisión de este artículo. RKTK contribuyó a la asistencia y orientación para el análisis e interpretación de datos. GN contribuyó como asesor de este estudio y revisión crítica del artículo.

Correspondencia a Gerson Nakazato.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Ribeiro, JM, Pereira, GN, Durli Junior, I. et al. Análisis comparativo de la eficacia para el desarrollo de cócteles de fagos contra múltiples serovares de Salmonella y su actividad de control de biopelículas. Representante científico 13, 13054 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-40228-z

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Recibido: 28 de marzo de 2023

Aceptado: 07 de agosto de 2023

Publicado: 11 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-40228-z

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