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Parásitos y vectores volumen 16, número de artículo: 269 (2023) Citar este artículo

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Las infecciones por Plasmodium ovale están ampliamente distribuidas, pero rara vez se investigan y la carga de enfermedad resultante se ha subestimado. La región II del dominio de la proteína de unión a Duffy de Plasmodium ovale curtisi (PocDBP-RII) es un ligando esencial para el reconocimiento de reticulocitos y la invasión de la célula huésped por parte de P. ovale curtisi. Sin embargo, la variación genómica, la antigenicidad y la inmunogenicidad de PocDBP-RII siguen siendo importantes lagunas en el conocimiento.

Se recogieron un total de 93 muestras de P. ovale curtisi de trabajadores migrantes que regresaron a China desde 17 países de África entre 2012 y 2016. El polimorfismo genético, la selección natural y la variación del número de copias (CNV) se investigaron mediante secuenciación y PCR en tiempo real. . Se examinaron más a fondo la antigenicidad y la inmunogenicidad de la proteína PocDBP-RII recombinante (rPocDBP-RII) y se evaluaron las respuestas humorales y celulares de los ratones inmunizados mediante micromatrices de proteínas y citometría de flujo.

La rPocDBP-RII (39 kDa) expresada y purificada de manera eficiente se utilizó con éxito como antígeno para la inmunización en ratones. La diversidad de haplotipos (Hd) del gen PocDBP-RII fue de 0,105 y el índice de diversidad de nucleótidos (π) fue de 0,00011. No se encontró un mayor número de copias entre los aislados recolectados de P. ovale curtisi. Además, rPocDBP-RII indujo una producción persistente de anticuerpos específicos de antígeno con un título de anticuerpos IgG en suero de 1:16.000. Las células T productoras de IFN-γ, en lugar de las células productoras de IL-10, se activaron en respuesta a la estimulación de rPocDBP-RII. En comparación con los ratones inmunizados con PBS (control negativo), hubo un mayor porcentaje de células T CD4+CD44highCD62L- (células T de memoria efectoras) y células T CD8+CD44highCD62L+ (células T de memoria central) en ratones inmunizados con rPocDBP-RII.

Las secuencias de PocDBP-RII estaban altamente conservadas en aislados clínicos de P. ovale curtisi. La proteína rPocDBP-RII podría mediar la inmunidad protectora en etapa sanguínea a través de células T CD4+ y CD8+ productoras de IFN-γ y células T de memoria, además de inducir anticuerpos específicos. Nuestros resultados sugirieron que la proteína rPocDBP-RII tiene potencial como vacuna candidata para proporcionar evaluación y orientación para las actividades de control y eliminación de la malaria.

La malaria es una enfermedad causada por especies de Plasmodium y se estima que en 2021 hubo 247 millones de casos de malaria en todo el mundo, y la mayor parte del aumento de casos en los últimos cinco años se produjo en la Región de África de la OMS [1]. Entre las cinco especies de parásitos de la malaria que infectan a los humanos, Plasmodium ovale a menudo se pasa por alto debido a los síntomas benignos de la malaria que causa. Se ha demostrado que Plasmodium ovale se divide en dos subespecies genéticamente distintas llamadas P. ovale curtisi y P. ovale wallikeri [2]; la primera causa una mayor proporción de casos importados, un período de incubación más largo y mayores recuentos de plaquetas y leucocitos totales que malaria causada por este último [3, 4]. Sin embargo, las características morfológicas, el síndrome clínico, la respuesta al tratamiento y las características recurrentes de P. ovale son similares a las de Plasmodium vivax [5], lo que hace que sea fácil confundirlo con P. vivax en el diagnóstico de rutina y, por lo tanto, subestimar la prevalencia mundial de P. ovale [3, 6]. Por ejemplo, un estudio descriptivo mostró que P. ovale importado de África representó una gran proporción del total de casos de malaria en la provincia de Henan, China, incluso más que el de P. vivax [7]. Por lo tanto, los programas de eliminación de la malaria en África deben incluir estrategias para controlar estos parásitos de la malaria hasta ahora ignorados.

La proteína de unión a Duffy (DBP) se considera una candidata prometedora a vacuna en etapa sanguínea [8] que participa en la invasión de los reticulocitos del huésped por merozoitos de Plasmodium vivax y P. knowlesi a través de la interacción con los receptores del antígeno Duffy de la quimiocina del huésped (DARC) [ 9, 10]. Los dominios funcionales de unión al receptor de PvDBP se han rastreado hasta la región II N-terminal rica en cisteína (DBP-RII), que también se conoce como dominio similar a la unión a Duffy (DBL) [11]. Sin embargo, bajo presión inmune selectiva, la diversidad alélica puede conducir a la pérdida de reactividad e inmunogenicidad funcional de PvDBP-RII, lo que representa un desafío potencial para el desarrollo de vacunas [12, 13]. Otro tipo importante de variación genómica en Plasmodium es la variación del número de copias (CNV) [14]. De hecho, se han identificado polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) [15] y CNV [16] en PvDBP-RII, que podrían promover la evasión de P. vivax contra la inmunidad humoral de PvDBP, limitando la eficacia de la vacuna. Específicamente, los anticuerpos funcionales contra DBP muestran epítopos de prioridad objetivo [17], pero las variantes alélicas de DBPII pueden alterar la reactividad de anticuerpos específicos de cepa distintos de los anticuerpos derivados de MBC [18]. Además, los datos de modelos murinos de infección por malaria sugieren que las células T CD4+ y CD8+ pueden controlar la producción de citoquinas como IFN-γ e IL-10 [19], y luego las células T de memoria median la inmunidad protectora en etapa sanguínea [20, 21]. ].

Un estudio anterior informó que la región II del dominio de la proteína de unión a Duffy de P. ovale curtisi (PocDBP-RII) puede actuar como un ligando importante en el proceso de invasión de los reticulocitos por P. ovale curtisi [22]. Sin embargo, no se han dedicado estudios previos a descubrir la diversidad genética y la amplificación genética de PocDBP-RII. En este estudio, seleccionamos 93 aislamientos de P. ovale curtisi de áreas endémicas de malaria en África durante 2012-2016 para investigar el polimorfismo genético, la selección natural y las CNV de PocDBP-RII. Además, para investigar nueva información sobre la idoneidad de rPocDBP-RII como nueva vacuna candidata para P. ovale curtisi, se midieron la antigenicidad y la inmunogenicidad de rPocDBP-RII mediante micromatrices de proteínas y análisis de citometría de flujo.

Se obtuvieron un total de 93 muestras de sangre de pacientes importados con malaria con P. ovale identificados mediante investigación microscópica y epidemiológica en un laboratorio de referencia para el diagnóstico de malaria en la provincia de Jiangsu, China, de 2012 a 2016. El ADN genómico de Plasmodium (ADNg) de 200 µl de sangre Las muestras se extrajeron utilizando el kit QIAamp™ DNA Blood Midi (QIAGEN, Inc., Valencia, CA), según las instrucciones del fabricante. Las subespecies de P. ovale curtisi se determinaron además mediante un ensayo de PCR anidado y PCR TaqMan en tiempo real, como se informó en una publicación anterior [23]. Los productos de la PCR fueron secuenciados por Tanlen-bio Scientific (Wuxi, China). Los cebadores utilizados para la secuenciación se muestran en la Tabla 1. Las secuencias de ADN adquiridas se alinearon con secuencias de genes de referencia tomadas de PocDBP (PlasmoDB, PocGH01_00129200) en la base de datos Plasmodium Genome Resource.

La secuencia PocDBP (PlasmoDB, PocGH01_00129200) se utilizó como plantilla para evaluar la diversidad de nucleótidos. Las múltiples alineaciones de secuencia de 93 aislados que contienen la secuencia de referencia salvaje de PocDBP-RII se obtuvieron utilizando MUSCLE en el programa MEGA v7.0.18 [24]. Se calculó el número de sitios de polimorfismo de un solo nucleótido (SNP), haplotipos (H), diversidad de haplotipos (Hd) y diversidad de nucleótidos (π) para evaluar la diversidad genética utilizando el programa DNASP v5.10.01. Se realizaron pruebas intraespecies para evidencia de neutralidad (prueba D de Tajima, pruebas D* de Fu y Li y pruebas F* de Fu y Li) para determinar la presencia de selección direccional o de equilibrio [25, 26]. Un valor positivo significativo de D de Tajima o D* de Fu y Li y F* de Fu y Li representa una contracción de la población debido a la selección, mientras que los valores negativos representan una expansión de la población y un exceso de ejemplares únicos. P <0,05 se consideró significativo.

El número de copias del gen PocDBP-RII (CN) se estimó mediante un ensayo cuantitativo de PCR SYBR Green (qPCR) en tiempo real [23, 27]. Las secuencias de cebadores utilizadas para la construcción de plásmidos de referencia con una o dos copias de PocDBP-RII se presentan en la Tabla 1. Debido a la ausencia de aislamientos de P. ovale curtisi con copias conocidas de los genes estudiados como calibradores, los plásmidos de referencia con una copia de PocDBP-RII (pREF1) y dos copias de PocDBP-RII (pREF2) se construyeron mediante la inserción de fragmentos de PocDBP-RII (nt, 48–545) y PocFBPA (nt, 1–619) en una proporción de 1:1 o 2:1 en el vector pMD18-T (n.º de catálogo 6011, TAKARA) utilizando el kit de clonación TA Cloning and Seamless (n.º de catálogo D7010S, Beyotime, Shanghai, China). En resumen, las reacciones de PCR se realizaron en un sistema de PCR en tiempo real Applied Biosystems 7500 (Applied Biosystems, EE. UU.). Cada reacción consistió en 1 × ChamQ SYBR qPCR Master Mix (n.º de catálogo Q311-02, Vazyme, Jiangsu, China), 150 nM de cada cebador directo e inverso, 1 × ROX Reference Dye 2, 1,2 μl de gDNA o 2 μl diluidos ADN plasmídico y agua hasta 20 µl. Las condiciones de reacción fueron 95 °C durante 30 s, luego 40 ciclos de 95 °C durante 10 s y 60 °C durante 34 s. Al final del ciclo de amplificación, se realizó un análisis de la curva de fusión para confirmar que los productos sintetizados eran correctos. Para excluir el efecto del ADNg humano extraído de sangre completa, se utilizó ADNg de individuos sanos como control negativo. En cada experimento, cada muestra individual se procesó en dos pocillos y todas las muestras se repitieron si la desviación estándar (SD) de los valores del ciclo de dos umbrales (Ct) era > 0,5 o el valor de ΔCt entre la muestra de prueba y el control negativo era < 3. Los informes de texto que contienen los valores de Ct para cada pocillo se exportaron a Excel (Microsoft) y se analizaron mediante el método de cuantificación relativa 2−∆∆Ct para estimar el número de copias. Si el número de copias N veces estaba entre estos valores (0,7 < N veces < 1,3), se consideraba que la muestra de prueba portaba una copia del gen objetivo. La muestra de prueba que contenía dos CN se repitió N veces > 1,3 para garantizar la fiabilidad de los resultados de la amplificación.

La proteína rPocDBP-RII se expresó como se describe en un estudio anterior [22]. Brevemente, la amplificación por PCR de PocDBP-RII se realizó con ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion (n.º de catálogo F530S, Thermo Scientific, Suecia) utilizando cebadores directos e inversos (Tabla 1) y se clonó en el vector pET28a mediante el kit de clonación Seamless. Luego, la cepa Rosetta (DE3) de Escherichia coli (n.º de catálogo CB108, TIANGEN, Beijing, China) se transformó con el plásmido recombinante en una placa de agar LB (que contenía 20 µg/ml de kanamicina) y se incubó durante la noche a 37 °C. Se recogió una sola colonia y se inoculó en un tubo cónico de 50 ml que contenía 20 ml de medio LB (complementado con 20 µg/ml de kanamicina) a 37 °C durante la noche con agitación a 200 rpm. El cultivo iniciador se inoculó en un matraz que contenía 1000 ml de medio LB con kanamicina a 37 °C hasta que la densidad óptica alcanzó 0,6 a 600 nm (OD600). La expresión se indujo con isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) 0,5 mM (n.º de catálogo I8070, Solarbio, Beijing, China) a 30 °C. Seis horas más tarde, las células se recogieron mediante centrifugación a 5000 xg durante 10 minutos a 4 °C. El sedimento se almacenó inmediatamente a -20 °C durante la noche.

Las células se descongelaron y se resuspendieron en tampón de lisis: Na2HPO4 100 mM, Tris-HCl 10 mM, urea 8 M, pH 8,0. El aislamiento de los cuerpos de inclusión se realizó mediante ultrasonido y centrifugación a baja temperatura. Los cuerpos de inclusión lavados se solubilizaron con tampón de lisis que contenía urea 8 M con rotación recíproca durante la noche a 4 °C. La proteína rPocDBP-RII se purificó utilizando una resina de ácido nitrilotriacético (Ni-NTA) cargada con níquel de alta afinidad (n.º de catálogo L00250, GenScript, Jiangsu, China). Para la diálisis gradual, se utilizó urea 6 M, 4 M y 2 M por separado para eliminar lentamente la urea y promover el replegamiento. Cada vez la muestra se incubó durante > 12 h a 4 °C con agitación. Se utilizó el método de ultrafiltración para lograr el efecto de concentración después del último tiempo de diálisis. La proteína rPocDBP-RII purificada y concentrada se trató con 2 tintes de carga con y sin ditiotreitol (DTT, condición reductora) y luego se analizó mediante SDS-PAGE al 12 % con tinción con Coomassie Brilliant Blue R-250 PAGE, transferencia Western y proteína Pierce BCA. Kit de ensayo. Además, la prueba de endotoxinas mostró que la cantidad de endotoxina en rPocDBP-RII era < 1 UE/ml.

Se obtuvieron ratones BALB/c (hembras, 6 semanas de edad) del Centro Experimental de Animales de la Universidad de Yangzhou (Yangzhou, China). A cada ratón se le inyectó por vía subcutánea la emulsión que contenía 50 μg de rPocDBP-RII (n = 5) o solución salina tamponada con fosfato (PBS; n = 3) mezclada con adyuvante completo de Freund (n.º de catálogo F5881, Sigma) como inmunización primaria. 28, 29]. Los refuerzos posteriores se realizaron con la misma cantidad de antígeno o PBS por animal emulsionado en adyuvante incompleto de Freund (n.º de catálogo F5506, Sigma-Aldrich) en los días 14 y 28 después de la inyección inicial. Se recogieron muestras de suero de ratón separadas de la sangre y se almacenaron a -80 °C los días 0, 14, 28, 42 y 70 para su uso posterior.

La reacción del suero contra proteínas recombinantes purificadas se determinó utilizando matrices de aminas de tipo pozo como se describió anteriormente [30, 31]. Para los ensayos, se pegaron cintas de teflón con orificios en portaobjetos de microscopio de adhesión (CITOTEST Scientific, Jiangsu, China) como micromatrices de proteínas; Se aplicó 1 μl de rPocDBP-RII (50 μg/μl) en cada pocillo de las matrices y se incubó durante 2 h a 37 °C. Los portaobjetos se bloquearon con BSA al 5% en PBST a 37 °C durante 1 h. Se agregaron al chip muestras de suero diluidas a 1:250 de cada uno de los cuatro períodos de recolección de sangre o un conjunto de diluciones en serie 1:2 de 1:250 a 1:32,000 extraídas de los períodos de recolección de sangre tercero y cuarto durante 1 h a 37 ºC. El suero preinmune y el suero de ratones inmunizados solo con adyuvante sirvieron como controles negativos. Finalmente, los anticuerpos unidos se visualizaron usando IgG anti-ratón de burro (H + L) marcada con Alexa Fluor 555 (dilución 1:100; número de catálogo A0460, Beyotime, Shanghai, China), escaneados con un escáner de microarrays LuxScanTM de 10 KB (número de catálogo .100020, CapitalBio); Se utilizó el enfoque de círculo fijo para cuantificar la intensidad media de fluorescencia (MFI).

Se obtuvieron bazos de ratón enteros y frescos y se picaron en trozos pequeños con una tijera estéril en una placa de Petri con 10 ml de RPMI 1640 preenfriado (n.º de catálogo 31800, Solarbio, Beijing, China) bajo una cabina de bioseguridad estéril. Los trozos de tejido del bazo se trituraron suavemente a través del colador de 70 µm utilizando un movimiento circular con el extremo plano del émbolo de una jeringa hasta que el resto del tejido del bazo se volvió blanco. La suspensión celular se filtró nuevamente y se lavó con exceso de RPMI 1640 centrifugando a 1000 rpm durante 5 min a 4 °C. Luego, el sedimento se resuspendió en 3 ml de tampón de lisis de RBC frío durante 5 minutos en hielo. Después de la incubación, se detuvo la reacción de lisis añadiendo medio RPMI completo hasta un volumen final de 10 ml. Después de lavar dos veces, las células se contaron y se resuspendieron hasta la concentración celular deseada con medio RPMI completo.

La proliferación de linfocitos se determinó mediante el ensayo CCK8, como se informó anteriormente [30, 32]. Los linfocitos de ratones inmunizados con rPocDBP-RII y PBS (5 x 104 células/pocillo) se trataron con concanavalina A (Con A: 2 µg/ml) o rPocDBP-RII (10 µg/ml) en una microtitulación de fondo plano de 96 pocillos. platos. Se utilizaron el medio RPMI 1640 completo y Con A como control blanco y positivo, respectivamente. Luego, las placas se incubaron durante 72 h a 37 °C con 5% de CO2. La proliferación celular se realizó utilizando el ensayo Cell Counting Kit-8 y el índice de estimulación (SI) se calculó mediante la siguiente fórmula: SI = [(OD450 de células estimuladas-OD450 de células no estimuladas)/OD450 de células no estimuladas] × 100 %.

Para evaluar la respuesta de las células T productoras de citocinas IFN-γ / IL-10 y las células T de memoria tras la estimulación con rPocDBP-RII, los fenotipos celulares se analizaron mediante citometría de flujo (Cytoflex S, Beckman Coulter, CA, EE. UU.). Los anticuerpos utilizados en este estudio se adquirieron de Biolegend (San Diego, CA, EE. UU.) o BD (BD Biosciences, Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE. UU.). La evaluación de la respuesta de las células productoras de citoquinas IFN-γ/IL-10 se realizó utilizando protocolos establecidos [33,34,35]. Brevemente, las células se resuspendieron en RPMI 1640 completo que contenía proteínas de rPocDBP-RII (10 µg/ml) y se sembraron en placas de 5 x 106 células/pocillo en placas de 12 pocillos. Después de 18 h, se transfirieron 2 x 106 células a tubos Eppendorf de 1,5 ml y se incubaron en presencia de PMA (50 ng/ml), ionomicina (5 µg/ml) y Brefeldin A (10 µg/ml) durante 4 h a 37 °C con 5% de CO2 para estimular los linfocitos T y bloquear la secreción de citoquinas. Luego, las células se lavaron una vez en PBS y se tiñeron con CD3 (FITC), CD4 (APC) y CD8a (PE-Cy7) durante 30 minutos a 4 °C. Las células de cada tubo se lavaron nuevamente y se fijaron en 200 µl de solución de paraformaldehído al 4% durante 20 minutos a 4 °C. Para la estimulación con rPocDBP-RII durante 24 h, los marcadores de la superficie celular para las células T de memoria [CD3 (APC-Cy7), CD4 (PE), CD8a (APC), CD44 (FITC), CD62L (PE-Cy7)] se tiñeron en de la misma manera. Para la tinción de citocinas intracelulares, las células se permeabilizaron con un kit de permeabilización celular (eBioscience) según las instrucciones del fabricante y se tiñeron con IFN-γ (PE) e IL-10 (PE) en la oscuridad durante 30 minutos a 4 °C. respectivamente. Finalmente, las células se lavaron y resuspendieron en tampón de tinción de citometría de flujo antes del análisis de citometría de flujo. Los datos se analizaron con FlowJo v10 (TreeStar, LaJolla).

Para los análisis estadísticos y los gráficos se utilizaron GraphPad Prism (versión 8.4.2; GraphPad Software, San Diego, CA, EE. UU.) y SigmaPlot (Systat Software Inc., San José, CA, EE. UU.). Se utilizó una prueba t de Student de dos colas no apareada para comparar los valores medios entre muestras; P <0,05 se consideró significativo.

El diagrama esquemático de todo el proceso experimental se muestra en la Fig. 1.

Ilustración esquemática del proceso experimental. El ADN genómico se extrajo de muestras de sangre de pacientes infectados con Plasmodium ovale curtisi. Se investigaron los polimorfismos genéticos y la selección natural del gen PocDBP-RII mediante secuenciación y pruebas neutras. La variación del número de copias del gen PocDBP-RII se estudió mediante qPCR. La proliferación de linfocitos en ratones inmunizados con rPocDBP-RII se determinó mediante el ensayo CCK8. Los niveles de respuesta de anticuerpos anti-rPocDBP-RII en suero y células T productoras de IFN-γ/IL-10 en bazos de ratones inmunizados se evaluaron mediante micromatrices de proteínas y citometría de flujo, respectivamente.

Para determinar el alcance de la variación genética en PocDBP-RII, se secuenciaron 93 muestras de P. ovale curtisi para PocDBP-RII, incluidas Angola (n = 11), Camerún (n = 6), Chad (n = 1), República Democrática. del Congo (n = 8), Guinea Ecuatorial (n = 36), Gabón (n = 1), Ghana (n = 1), Guinea (n = 1), Liberia (n = 2), Malawi (n = 1 ), Mozambique (n = 1), Níger (n = 1), Nigeria (n = 14), República del Congo (n = 6), Sierra Leona (n = 1), Sudáfrica (n = 1) y Zambia ( norte = 1) (Figura 2A, B). Todas las secuencias se alinearon y cortaron a 1143 pb (nt, 526–1668) mediante MEGA7.0. Hubo cinco haplotipos (H) y cuatro SNP, incluidos tres sitios variables únicos y un sitio informativo de parsimonia. La diversidad de haplotipos (Hd) del gen PocDBP-RII fue de 0,105 y el índice de diversidad de nucleótidos (π) fue de 0,00011 (Tabla 2). El valor de π que oscilaba entre 0 y 0,00106 se evaluó mediante una ventana deslizante de 100 pb con un incremento de 25 pb (Fig. 2C), revelando que todos los sitios polimórficos estaban concentrados en la región N-terminal de PocDBP-RII (nt, 601 –850).

Distribución geográfica de las fuentes de las muestras clínicas de Plasmodium ovale curtisi utilizadas en este estudio y análisis de gráficos de ventana deslizante. Mapa AA de África que muestra los países de origen de los aislamientos de P. ovale curtisi. B El número total de muestras genotipadas (n = 93) y porcentaje de muestras por región. Análisis de gráficos de ventana deslizante que muestran la diversidad de nucleótidos (π) C y los valores D de Tajima D de PocDBP-RII

Se realizó una prueba neutral para identificar las causas del fenotipo específico de la especie. Estos cinco aislados con mutación de base mostraron mutaciones no sinónimas, que contienen un polimorfismo A/C en el nucleótido 629 (K210T), dos polimorfismos T/A en el nucleótido 751 (F251I), un polimorfismo TT/AA en el nucleótido 752-753 (F251N ) y un polimorfismo C/G en el nucleótido 813 (N271K) (Tabla 3). Sin embargo, ni la relación entre sustituciones no sinónimos y sinónimas (dN/dS o ω) ni un valor dN-dS pueden usarse para detectar una selección darwiniana positiva, porque las diferencias en un conjunto de secuencias conespecíficas muestreadas de una sola población simplemente representan polimorfismos segregantes en lugar de sustituciones fijas [36]. La D de Tajima fue negativa (Fig. 2D) pero el valor de P no fue significativo (D de Tajima = − 1.6812, 0.05 < P <0.1), lo que muestra que las mutaciones en PocDBP-RII en este estudio estaban de acuerdo con el modelo de evolución neutral. Sin embargo, las pruebas D* y F* de Fu y Li rechazaron un modelo de ocurrencia de polimorfismo neutro (D* de Fu y Li = − 2.63945, P < 0.05, y F* de Fu y Li = − 2.74087, P < 0.05) (Tabla 2). Dado que las pruebas D* y F* de Fu y Li son muy sensibles a las expansiones poblacionales recientes, hay casos en los que los valores estadísticos D* y F* de Fu y Li son negativos y significativos y el D de Tajima es cercano a cero. Entre las pruebas intraespecies, la secuenciación parcial del ADN y los análisis revelaron una diversidad genética limitada de PocDBP-RII y evidencia débil de selección natural.

Para detectar CNV en el gen PocDBP-RII, se adaptó el método 2-∆∆Ct de cuantificación relativa utilizando PCR cuantitativa en tiempo real con detección SYBR Green para calcular el número de copias de PocDBP-RII [37]. Se seleccionó como referencia el gen de mantenimiento PocFBPA (PlasmoDB, PocGH01_12070000), que es homólogo a la aldolasa de P. vivax [8] (PlasmoDB, PVX_118255). Para asegurar la validez del cálculo de ∆∆Ct [∆∆Ct = (Ct DBP-Ct FBPA) muestras—(Ct DBP-Ct FBPA) pREF1], se probó la eficiencia de amplificación de qPCR. Se generó una curva estándar utilizando una serie de muestras de ADN plasmídico diluidas cinco veces como plantilla (Fig. 3A), donde las eficiencias de qPCR [Eficiencia = (10−1/pendiente–1) × 100%] del gen de referencia y el gen diana fueron similares ( m < 0,1) y > 90%, cumpliendo con los requisitos de eficiencia de amplificación recomendada [38]. Además, el número de copias N veces (2 − ∆∆Ct) observado en pREF2 fue obviamente el doble que el número en pREF1 en cada dilución (Fig. 3B), lo que confirma que se podría aplicar el cálculo de 2 − ∆∆Ct.

Variación del número de copias en el gen PocDBP-RII. Una curva estándar de qPCR para la detección de PocDBP-RII y PocFBPA para calcular la eficiencia de amplificación relativa (Effv%). El eje horizontal representa el Lg de moléculas de ADN agregadas al sistema de reacción qPCR en cada dilución, y el eje vertical son los valores de Ct. El valor absoluto de la pendiente fue cercano a cero (m = 0,0632), lo que confirma que las eficiencias de amplificación de PocDBP-RII y PocFBPA fueron similares. B Se realizaron gráficas de Lg de moléculas de ADN versus número de copias N veces para reflejar la eficiencia relativa y el número de copias de PocDBP-RII en los dos plásmidos de referencia. C Diagramas de dispersión que representan la estimación del número de copias N veces de PocDBP-RII en aislamientos de Plasmodium ovale curtisi de diferentes regiones de África (n = 74)

De los 93 aislamientos, se determinaron con éxito 2 de 3 de África Oriental, 16 de 20 de África Occidental, 1 de 1 de África Meridional y 55 de 69 de África Central. Nuestras estimaciones de PocDBP-RII CN para estos aislados oscilaron entre 0,7 y 1,2 (Fig. 3C). En ningún caso fue N veces > 1,3, lo que indica que todos los aislados portaban una copia del gen PocDBP-RII. Se excluyeron del análisis diecinueve muestras que no cumplieron con los criterios (N veces > 0,7) utilizados en la metodología. El error en la detección de CN en estas muestras puede haber sido causado por la parasitemia de bajo grado que resultó en una extracción muy pequeña de ADNg de P. ovale curtisi para qPCR. Esta situación también estuvo presente en el proceso de cálculo del número de copias N de pREF1 y pREF2, donde los números de copias N mostraron una gran inestabilidad cuando la molécula de ADN era <320 (datos no mostrados). Como PocDBP-RII es evolutivamente estable y libre de CNV, lo que le permite cumplir con el requisito principal para desarrollar un antígeno valioso como vacuna, el siguiente paso fue garantizar su antigenicidad e inmunogenicidad.

Los productos de PCR de PocDBP-RII se amplificaron con éxito (Fig. 4A) y se clonaron en un vector pET28a. El plásmido resultante se transformó en células de la cepa Rosetta (DE3) de E. coli y se indujo con IPTG. La expresión de proteínas se analizó mediante SDS-PAGE y luego se tiñó con azul brillante de Coomassie (Fig. 4B). La rPocDBP-RII se purificó a partir de cuerpos de inclusión y la proteína replegada mostró diferentes movilidades en condiciones reductoras (DTT+) y no reductoras (DTT-), lo que indica que los enlaces disulfuro se habían formado correctamente (Fig. 4C). Se utilizó el ensayo de ácido bicinconínico (BCA) para crear una curva estándar y se estimó que la concentración de rPocDBP-RII purificada obtenida era de 1 mg/ml. Se utilizó anticuerpo anti-His conjugado con peróxido de rábano picante (HRP) en Western blot para detectar la expresión de proteínas, y se emplearon sueros de ratones inmunizados con rPocDBP-RII o ratones inmunizados con PBS para estudiar la especificidad de anticuerpos de ratones inmunizados con rPocDBP-RII (Fig. .4D). Como resultado, se demostró que el suero de ratón inmunizado con rPocDBP-RII reconoce específicamente la proteína rPocDBP-RII en comparación con la falta de reconocimiento en el suero de ratón inmunizado con PBS (control negativo).

Expresión y purificación de rPocDBP-RII y detección de anticuerpo anti-rPocDBP-RII en sueros de ratones inmunizados. Una amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para PocDBP-RII (punta de flecha: un producto de 975 pb). M: marcador; carril 1: sin control de plantilla; carril 2: ADN extraído del plasma de un paciente infectado por parásitos. B Análisis SDS-PAGE de rPocDBP-RII (punta de flecha: una banda de 39 kDa) después de la inducción con IPTG. M: marcador proteico; carril 1: homogeneizados celulares de E. coli Rosetta/pET28a-PocDBP-RII sin inducción de IPTG; carril 2: homogeneizados celulares después de la inducción con IPTG durante 6 h. C Gel SDS-PAGE teñido con azul de Coomassie de rPocDBP-RII eluido, purificado y concentrado antes y después del tratamiento con ditiotreitol (DTT). M: marcador proteico; carril 1: rPocDBP-RII replegado (DTT-); carril 2: rPocDBP-RII desnaturalizado (DTT+) que migró como un patrón de bandas único en SDS-PAGE al tamaño esperado de 39 kDa. D Análisis de transferencia Western de rPocDBP-RII utilizando un anticuerpo monoclonal de conejo anti-HIS (carril 1) o anticuerpos del suero de ratones inmunizados con rPocDBP-RII (carril 2) o PBS (carril 3)

Para evaluar la antigenicidad de rPocDBP-RII, se evaluaron mediante micromatrices de proteínas los títulos promedio de IgG sérica de anticuerpos específicos de antígeno en ratones inmunizados con rPocDBP-RII e inmunizados con PBS. Se obtuvieron muestras de sangre de ratones antes de la inmunización para establecer un nivel preinmune inicial y normalizar la intensidad media de la fluorescencia en diferentes micromatrices de proteínas. Los resultados indican que, en comparación con los ratones inmunizados con PBS, los niveles de anticuerpos de rPocDBP-RII aumentaron gradualmente desde la inmunización primaria hasta aproximadamente 2 semanas después de la última inmunización (día 42) y comenzaron a disminuir en el mes siguiente, pero aún mantuvieron un nivel alto. (Figuras 5A, B). Además, después de tres inmunizaciones consecutivas con rPocDBP-RII, las muestras de suero de ratones inmunizados diluidas de 1:250 a 1:32.000 en los días 42 y 70 después de la inmunización inicial mostraron una tendencia similar de reactividad a rPocDBP-RII, y el título de anticuerpos a rPocDBP-RII. el antígeno diana es 1:16.000 (Fig. 5C, D).

Respuestas inmunes humorales en ratones inmunizados con rPocDBP-RII. A Los niveles de IgG total en suero de ratón contra la proteína rPocDBP-RII (n = 5) o PBS (n = 3) se midieron mediante matrices de proteínas los días 0, 14, 28, 42 y 70 después de la inmunización. La imagen en color falso de una matriz de ejemplo muestra la intensidad de la señal; una mancha blanca o roja es más intensa que las azules. El número en la parte superior de la imagen representa diferentes ratones. B Cuantificación de las intensidades puntuales relativas de duplicados. Las concentraciones más altas de anticuerpos en el suero producen una intensidad media de fluorescencia (MFI) más fuerte. C Se dispuso suero de ratones inmunizados por duplicado en una serie de diluciones dobles (de 1:250 a 1:32.000). D La linealidad y replicabilidad de estos datos se muestran en el gráfico.

Se utilizó un ensayo de proliferación de linfocitos para evaluar la inmunogenicidad de rPocDBP-RII en la inducción de respuestas de células T específicas de antígeno. En comparación con el grupo inmunizado con PBS, los esplenocitos de los ratones inmunizados con rPocDBP-RII tenían una mayor capacidad para dividirse en respuesta a la estimulación de rPocDBP-RII. Además, la proteína rPocDBP-RII indujo una respuesta proliferativa más agresiva en los esplenocitos que ConA (control positivo) (Fig. 6B). Para evaluar la función de las células T específicas de rPocDBP-RII, se analizó la proporción de células productoras de citocinas IFN-γ/IL-10 tras la estimulación con rPocDBP-RII mediante tinción con citocinas intracelulares (Fig. 6A). Al estimular los esplenocitos de ratones inmunizados in vitro, se encontró que el nivel de células T productoras de IFN-γ era significativamente mayor en el grupo inmunizado con rPocDBP-RII (CD4+, 2,09 ± 0,42 %; CD8+, 8,7 % ± 1,15 %). que en los ratones inmunizados con PBS (CD4+, 0,42 ± 0,13%, P <0,05; CD8+, 1,24 ± 0,62%, P <0,05) (Fig. 6C). Por el contrario, la estimulación con rPocDBP-RII no pudo aumentar la magnitud de las células T CD4+ productoras de IL-10 (rPocDBP-RII, 0,2 ± 0,09%; PBS, 0,08 ± 0,04%, P > 0,05) o células T CD8+ (rPocDBP- RII, 1,43 ± 0,32%, PBS, 1,49 ± 0,72%, P > 0,05) (Fig. 6D). Estos datos sugieren que la inmunización con rPocDBP-RII fue capaz de inducir células T productoras de IFN-γ y que la inmunidad celular también podría estar implicada en la protección mediada por rPocDBP-RII contra la infección por P. ovale curtisi.

Respuestas de células T productoras de IFN-γ/IL-10 en ratones inmunizados con rPocDBP-RII. Una estrategia de activación de citometría de flujo para células T productoras de IFN-γ/IL-10 sobre el antígeno rPocDBP-RII. B Actividad linfoproliferativa de esplenocitos aislados del grupo experimental y del grupo PBS, la concanavalina A (Con A) funcionó como control positivo. Medición de los niveles de células T CD4+ y CD8+ productoras de IFN-γ C y D productoras de IL-10 en ratones mediante citometría de flujo. Los datos se muestran como la media ± DE. Los valores de p se calcularon mediante la prueba t de Student. Las diferencias significativas entre grupos se indican en el gráfico: * P < 0,05, se indican diferencias no significativas (ns) (P > 0,05)

Dado que las células efectoras/efectoras de memoria productoras de IFN-γ desempeñan un papel clave en la inducción y el mantenimiento de la protección a largo plazo contra la malaria mediada por células T CD4+ o células T CD8+ [39], se analizó la expresión de esplenocitos CD4+ y CD8+ activados. CD62L y CD44. Las células T CD4+ y CD8+ en los esplenocitos de ratones se pueden dividir en cuatro subconjuntos de células T vírgenes/de memoria [40]: CD44int/lowCD62L+ naive, CD44highCD62L+ CM, CD44highCD62L− EM y CD44int/lowCD62L− EMRA (Fig. 7A). Tanto el patrón fenotípico de las células T CD4+ como las CD8+ en el grupo inmunizado con rPocDBP-RII mostraron un porcentaje mayor y significativo de TEM (Fig. 7B), mientras que la TCM mostró una diferencia significativa solo en el subconjunto de células T CD8+ específicas de antígeno (Fig. 7B). .7C). Además, nuestro estudio demostró que rPocDBP-RII podría inducir una mayor proporción de TEM en células T CD4+ (CD4+, 17,26% ± 1,41%; CD8+, 5,03% ± 0,78%) y una mayor proporción de TCM en células T CD8+ (CD4+, 8,03% ± 0,98%; CD8+, 21,28% ± 4,18%). En general, parecieron predominar las células T CD4+CD44highCD62L− y las células T CD8+CD44highCD62L+ activadas por estimulación de rPocDBP-RII.

Frecuencia de células T de memoria en respuesta a la estimulación del antígeno rPocDBP-RII mediante citometría de flujo multiparamétrica. A La estrategia de selección representativa para identificar células T vírgenes (Tnaïve, CD44int/bajo CD62L+), células T de memoria central (TCM, CD44high CD62L+), células T efectoras de memoria (TEM, CD44high CD62L−) y células T diferenciadas terminalmente (TEMRA, CD44int /bajo CD62L-). Los gráficos de contorno de arriba representan células T CD4+ y los gráficos de contorno de abajo muestran células T CD8+. Comparación de porcentajes de TEM (B) y TCM (C) en células T CD4+ y CD8+ después de estimular los esplenocitos de ratones inmunizados con rPocDBP-RII e inmunizados con PBS mediante rPocDBP-RII in vitro

Recientemente, la malaria no falciparum y no vivax se han convertido en el foco de atención de la comunidad científica con patrones cambiantes de transmisión de la malaria y un buen control de P. falciparum [41]. Aquí, mostramos que PocDBP-RII tenía una menor diversidad de nucleótidos (π = 0,00011) en comparación con otras vacunas candidatas para P. vivax, como PvEBP, PvDBP-RII, PvAMA1 y PvMSP3α (π = 0,019) [42, 43]. El análisis de la secuencia de proteínas reveló que había tres sitios de residuos polimórficos en PocDBP-RII, de los cuales el cambio de aminoácidos en la posición 251 fue trimórfico (F251I, F251N), ocurriendo con una frecuencia del 3,2%. Curiosamente, una alineación clustal de secuencias homólogas reveló que también se había informado anteriormente que el aminoácido PvDBP-RII-F261, que es homólogo a PocDBP-RII-F251, tenía polimorfismo en aislados de P. vivax de Malasia [44]. La importancia de esta mutación debe evaluarse experimentalmente para una mayor confirmación.

En pruebas evolutivas neutrales, es algo paradójico que D y Fu de Tajima y D* y F* de Li revelaran valores negativos, pero sólo D* y F* de Fu y Li alcanzaron significación estadística. Se observó un patrón de datos similar en PvRBP1a-ecto [42]. La estimación de diferenciación genética (FST) y el análisis de la red de haplotipos indicaron que no había ningún nivel de diferenciación en la población considerada (datos no mostrados). Sin embargo, si una expansión de la población produjera un exceso de alelos raros, entonces coexistirían una baja diversidad de nucleótidos y altos haplotipos [45]. Sin embargo, el hecho de que hayamos encontrado sólo cinco haplotipos no puede explicar la presencia de selección natural. El análisis de diversidad genética de PocDBP-RII indicó que esta región sin amplificación se conserva como una región objetivo atractiva para el desarrollo de vacunas. Sin embargo, en futuras investigaciones se necesitarán muestras globales más grandes y técnicas más poderosas para respaldar nuestros hallazgos.

Los antígenos con baja diversidad genética y sitios de aminoácidos conservados pueden servir como objetivos potenciales para respuestas inmunes protectoras y candidatos a vacunas [46]. Recientemente se ha examinado la contribución de potentes respuestas inmunitarias neutralizantes y de la inmunidad celular protectora a la prevención de la malaria en el contexto del desarrollo de vacunas [47,48,49]. La respuesta serológica indicó que rPocDBP-RII puede ser el objetivo de anticuerpos inmunológicamente activos. Aunque los títulos de anticuerpos disminuyeron después de dos meses de inmunización, el nivel de anticuerpos obtenido de los ratones inmunizados todavía era alto. Además, los adyuvantes adecuados son suficientemente eficaces para inducir títulos elevados de anticuerpos [50], y la longevidad y la composición de la respuesta inmune celular parecen merecer más atención. Una vacuna eficaz iniciará una respuesta inmune humoral para el desarrollo de anticuerpos contra la malaria a través de las células B y una respuesta inmune celular a través de la producción de linfocitos específicos de antígeno por parte de las células T [51]. Una cantidad suficiente de anticuerpos específicos del parásito Plasmodium y de células T CD4+ y CD8+ puede mediar la inmunidad protectora en etapa sanguínea [52]. Nuestros resultados sugirieron que la inmunización con rPocDBP-RII era capaz de inducir que las células T productoras de IFN-γ, en lugar de las células T productoras de IL-10, participaran en la inmunidad celular mediada por rPocDBP-RII contra la infección por P. ovale curtisi. Varios estudios han demostrado repetidamente que el IFN-γ es esencial para la eliminación del parásito y la eficacia protectora [53, 55]. En la infección por malaria, la IL-10 es un potente supresor de varias citoquinas proinflamatorias como el IFN-γ, lo que la hace perjudicial para la respuesta inmune mediada por células [56, 57].

Aunque muchas células del sistema inmunológico pueden secretar IFN-γ, la producción de respuestas de memoria de IFN-γ específicas de la malaria de larga duración está impulsada principalmente por las células T de memoria [58, 60]. Este estudio confirma que tanto las células T CD4+ como las células T CD8+ fueron productoras cruciales de IFN-γ, pero las células T CD8+ mostraron una mayor tasa de TCM mientras que las células T CD4+ mostraron una mayor proporción de TEM. El resultado no concordaba con la conclusión de que las células T CD4+ eran la principal fuente de IFN-γ en respuesta a PvMSP1P-19 [38], porque aunque la mayor parte del IFN-γ del bazo puede ser producido por las células T CD4+ en la etapa temprana de la infección, en la etapa tardía, el IFN-γ de las células T CD8+ podría potenciarse debido a la compensación por parte de otros tipos de células [19]. El aumento de TEM CD4+ asociado con la persistencia del antígeno puede deberse al impulso de su proliferación y a la programación de la producción de TEM a partir de la MTC [21, 58]. En general, las células T CD44 de alta memoria pueden contener una gran proporción de células efectoras que producen IFN-γ, lo que puede haber contribuido a una mayor protección. Además, cabe señalar que este artículo se concentra en gran medida en la respuesta inmune de las células T; sin embargo, a menudo será deseable medir al mismo tiempo las células B de memoria (MBC) y las células plasmáticas de larga vida (LLPC) para desarrollar una vacuna candidata eficaz y duradera [35, 61]. En conclusión, este estudio investigó nueva información sobre la idoneidad de rPocDBP-RII como nueva vacuna candidata para P. ovale curtisi.

Este estudio confirma que el gen PocDBP-RII, que tiene baja diversidad genética y evidencia débil de selección natural, se conserva entre los parásitos de P. ovale curtisi recolectados de aislados africanos. No solo eso, sino que se ha observado que el antígeno rPocDBP-RII provoca y mantiene de manera eficiente respuestas celulares dependientes de IFN-γ tanto humorales como derivadas de células T en ratones. Estos hallazgos sugieren que rPocDBP-RII podría servir como una posible vacuna candidata, pero es imperativo que se realicen estudios futuros para evaluar mejor la eficacia de rPocDBP-RII.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado.

Plasmodium ovale curtisi Región II del dominio de la proteína de unión Duffy

Reacción en cadena de la polimerasa

nucleótido

Electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida

Solución salina tamponada con fosfato con Tween-20

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Descargar referencias

Los autores agradecen a los funcionarios de salud locales del Hospital Provincial de Jiangsu en China y al Instituto de Enfermedades Parasitarias de Jiangsu por su ayuda al proporcionar muestras clínicas de Plasmodium ovale. Agradecemos cordialmente a los miembros del Laboratorio Hongmei Jiao por el análisis celular, que fue esencial para este trabajo.

Este estudio fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias de la Naturaleza de China (n.º 82072297), el Proyecto de mejora de la capacidad de la provincia de Jiangsu a través de la ciencia, la tecnología y la educación (n.º ZDXYS202207), el Proyecto Six Talent Peaks en la provincia de Jiangsu (2019-YY-065 ), el Proyecto de Apoyo al Talento de Alto Nivel de la Universidad de Yangzhou y el programa de Investigación y Práctica de Innovación para Graduados de la Provincia de Jiangsu (KYCX22_3564).

Zhenyu Ren, Qiyang Shi y Simin Xu contribuyeron igualmente a este trabajo.

Departamento de Biología Patógena e Inmunología, Facultad de Medicina, Universidad de Yangzhou, Yangzhou, 225009, República Popular China

Zhenyu Ren, Simin Xu, Jiahui Xu, Yi Yin, Zhijie Lin, Xinlong He, Jingyuan Lu, Yinyue Li, Wenwen Zhang, Jiali Liu, Yun Yang y Feng Lu

Laboratorio clave de control y prevención de enfermedades parasitarias de la Comisión Nacional de Salud, Laboratorio clave provincial de Jiangsu sobre tecnología de control de parásitos y vectores, Laboratorio médico clave provincial de Jiangsu, Instituto de enfermedades parasitarias de Jiangsu, Wuxi, 214064, República Popular de China

Qiyang Shi, Sui Xu, Xiaoqin Ma, Yaobao Liu, Guoding Zhu y Jun Cao

Segundo Hospital Popular de Changshu, Suzhou, 215500, Jiangsu, República Popular China

Simin Xu

Departamento de Biología Médica Ambiental y Medicina Tropical, Facultad de Medicina, Universidad Nacional de Kangwon, Chuncheon, Gangwon-do, 24341, República de Corea

Eun Taek Han

Hospital afiliado de la Universidad de Yangzhou, Yangzhou, 225000, República Popular China

Fenglu

Laboratorio clave de Jiangsu de investigación experimental y traslacional de ARN no codificante, Facultad de Medicina, Universidad de Yangzhou, Yangzhou, 225009, República Popular de China

Zhijie Lin y Feng Lu

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FL, JC y EH diseñaron y revisaron el manuscrito. ZR y JX contribuyeron al experimento relativo a proteínas y redactaron el manuscrito. QS, SX e YY contribuyeron a la secuenciación objetivo. SX, YL y GZ contribuyeron a la recolección de muestras y extracción de ADNg. XM, XH, JL, YL, JL, WZ e YY participaron en el experimento y analizaron los datos. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Jun Cao o Feng Lu.

Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Laboratorio Provincial Clave de Tecnología de Control de Parásitos y Vectores de Jiangsu, el Instituto de Enfermedades Parasitarias de Jiangsu (IRB00004221) y la Facultad de Medicina de la Universidad de Yangzhou (Yangzhou, China, YXYLL-2020-59). Los participantes firmaron un formulario de consentimiento informado antes de inscribirse en el estudio.

No aplica.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Ren, Z., Shi, Q., Xu, S. et al. Obtención de inmunidad dependiente de IFN-γ derivada de células T mediante la región II del dominio de la proteína de unión a Duffy de Plasmodium ovale curtisi altamente conservada (PocDBP-RII). Vectores de parásitos 16, 269 (2023). https://doi.org/10.1186/s13071-023-05897-9

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Recibido: 24 de mayo de 2023

Aceptado: 27 de julio de 2023

Publicado: 08 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s13071-023-05897-9

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