Detección específica de la actividad de siembra de tau en la enfermedad de Alzheimer utilizando células biosensoras diseñadas racionalmente

Neurodegeneración molecular volumen 18, número de artículo: 53 (2023) Citar este artículo

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La propagación priónica de tau en los trastornos neurodegenerativos implica que la tau patológica mal plegada puede reclutar la proteína normal y moldear su agregación. Aquí, informamos los métodos para el desarrollo de líneas celulares biosensoras sensibles para la detección de la actividad de siembra de tau.

Realizamos el diseño racional de nuevas sondas tau basadas en el conocimiento estructural actual de los agregados patológicos de tau en la enfermedad de Alzheimer. Generamos líneas celulares estables de biosensores basadas en transferencia de energía por resonancia de Förster (FRET) y caracterizamos su sensibilidad, especificidad y capacidad general para detectar tau bioactiva en muestras humanas. En comparación con la línea de biosensores de referencia, el diseño optimizado de la sonda dio como resultado una mayor eficiencia en la detección de la siembra de tau. La mayor sensibilidad permitió la detección de una menor cantidad de capacidad de siembra de tau en muestras de cerebro humano, al tiempo que se preserva la especificidad de las semillas de tau que se encuentran en la enfermedad de Alzheimer.

Esta próxima generación de células biosensoras basadas en FRET es una nueva herramienta para estudiar la actividad de siembra de tau en muestras humanas con enfermedad de Alzheimer, especialmente en muestras con niveles bajos de actividad de siembra, lo que puede ayudar a estudiar eventos patológicos tempranos relacionados con tau.

La acumulación cerebral de la proteína tau asociada a microtúbulos (MAPT) en agregados insolubles es una característica neuropatológica importante de la enfermedad de Alzheimer (EA) y otros trastornos neurodegenerativos denominados tauopatías. Tau es una proteína intrínsecamente desordenada normalmente presente en el compartimento axonal de las neuronas, donde desempeña un papel en la estabilización de los microtúbulos. En la EA, las formas hiperfosforiladas de tau se acumulan en el citoplasma y se agregan en filamentos helicoidales pares (PHF) que son estructuras filamentosas laminares con pliegues beta [1, 2]. La estadificación estereotipada de Braak de la patología tau de la EA desde la corteza entorrinal hasta el hipocampo y, más tarde, hasta las regiones límbicas [3], se correlaciona con la pérdida de neuronas y el curso de los síntomas clínicos [4,5,6,7,8]. La propagación de agregados de tau a través de regiones anatómicas interconectadas está respaldada por un sólido conjunto de pruebas. Por ejemplo, los animales transgénicos que sobreexpresan la tau mutante P301L en la capa II de la corteza entorrinal desarrollan agregados de tau humana en la circunvolución dentada, modelando la tau endógena de ratón en el proceso [9]. La capacidad de los agregados de tau mal plegados para reclutar tau normal en un mecanismo "similar a un prión" se denomina siembra y se ha replicado en numerosos modelos experimentales [10,11,12,13]. El papel de la siembra en la propagación de la patología humana está respaldado por la detección de tau competente para la siembra (también denominada tau bioactiva) en regiones del cerebro que contienen patología de ovillos neurofibrilares manifiesta, pero también en regiones posteriores que están libres de cambios patológicos manifiestos. más adelante en la vía de Braak [14]. La propensión a la siembra de Tau en cerebros postmortem se correlaciona con la tasa de progresión clínica, lo que confirma el papel fundamental de este fenómeno en la EA [15, 16].

El estudio de los mecanismos de siembra en la patología de la EA se aceleró enormemente con el desarrollo de una línea celular biosensora de tau basada en la transferencia de energía por resonancia de Förster (FRET) [12]. Esta línea celular estable de riñón embrionario humano (HEK 293 T) expresa sondas que son un mutante proagregante P301S del dominio repetido tau 4R (RD, aminoácidos 244–372) fusionado a una proteína fluorescente cian (CFP) o a una proteína fluorescente amarilla. (YFP). La adición de material tau competente para la siembra derivado del cerebro de AD o fibrillas de tau preformadas induce la agregación de estas sondas fluorescentes y la posterior señal FRET. La señal FRET se puede cuantificar mediante citometría de flujo 24 h después de la incubación con semillas de tau. Para aumentar la sensibilidad de la detección de semillas, los liposomas se mezclan con material competente para la siembra para transducir semillas en las células [17]. En ausencia de liposomas, las células biosensoras se pueden utilizar para estudiar los mecanismos de absorción de semillas [18, 19]. Las células biosensoras de tau se han utilizado para amplificar y cuantificar específicamente cantidades diminutas de tau bioactiva de varias muestras de EA, incluidos extractos de cerebro utilizando diversos métodos de purificación, líquido cefalorraquídeo (LCR) postmortem, LCR lumbar antemortem o vesículas extracelulares derivadas del cerebro [20,21,22]. ,23,24].

Un análisis más detallado de las lesiones de tau en la EA y otras tauopatías revela diferencias tanto en las modificaciones postraduccionales observadas [25, 26] como en la estructura de las fibrillas, según lo definido por la tecnología de microscopía crioelectrónica. Mientras que la EA, la tauopatía primaria relacionada con la edad y la rara demencia autosómica dominante familiar danesa o británica comparten la misma estructura central de fibrillas tau, otras tauopatías incluyen la parálisis supranuclear progresiva (PSP), la degeneración corticobasal (CBD) y la enfermedad de Pick (PiD). o la encefalopatía traumática crónica (CTE) tienen firmas estructurales específicas de agregados centrales de tau [27]. Aunque el papel patológico específico de la propagación de tau y la agregación con plantillas todavía está bajo investigación en tauopatías no relacionadas con la EA, la existencia de actividad de siembra de tau se ha demostrado en diferentes sistemas experimentales, incluida la inyección de extractos de cerebro humano en animales transgénicos [28], o real. -Conversión inducida por temblores en el tiempo (RT-QuIC) [13, 29, 30], para cada tauopatía. Estos hallazgos sugieren que cepas o conformadores de tau específicos pueden explicar los fenotipos específicos de las tauopatías. Nuestra hipótesis es que, dadas las ideas estructurales mencionadas anteriormente, las células biosensoras podrían diseñarse para tener preferencia por una clase de estructuras tau en comparación con otras. Aquí, describimos los métodos para el desarrollo de una nueva línea celular biosensora de tau con preferencia por AD tau.

Para optimizar el nivel de expresión y la eficacia para detectar la señal FRET después de la agregación de la sonda, se implementaron varias modificaciones en el diseño de la sonda. La secuencia de ADN se basó en una única construcción que comprende un péptido autoescindible T2A para mantener una expresión cercana a equimolar de las dos moléculas de tau marcadas con fluorescencia [31]. La secuencia tau de los aminoácidos 244 a 378 cubría el dominio repetido de tau y aminoácidos adicionales que forman parte de la estructura central de los filamentos de tau AD definidos por microscopía crioelectrónica (EM) [32]. El turquesa modificado 2 (mTurquoise2) y el verde neón modificado (mNeonGreen) se seleccionaron respectivamente como donante y aceptor de FRET en función de la alta transferencia de energía prevista [33, 34]. Debido a que la secuencia de ADN era muy análoga en ambos lados del péptido 2A, se realizó una optimización de codones para evitar la recombinación durante la integración del ADN en el genoma de la célula huésped [35]. La eficiencia de la transferencia de energía FRET está inversamente correlacionada con la distancia entre los fluoróforos. Postulamos que la composición y conformación del enlazador pueden afectar la eficiencia de FRET. Por lo tanto, hemos comparado construcciones con enlazadores que tienen diferente conformación y flexibilidad [36]. Debido a que la acetilación y/o ubiquitilación de tau en los residuos 311, 317 y 321 se observan en la EA humana, y se ha propuesto que impulsen el ensamblaje en filamentos helicoidales pares [26, 37], mutamos lisinas en esos sitios a glutaminas para imitar la acetilación (3xKQ mutante) (Fig. 1A).

El diseño de la sonda biosensora afecta la detección de semillas de tau bioactivas. A. Esquema de las distintas sondas tau que se diseñaron. La secuencia tau (244:378) consistía en el dominio repetido y los aminoácidos incluidos en el núcleo de los filamentos tau AD. En la construcción se introdujeron variaciones en la composición de la secuencia conectora entre la secuencia tau y el indicador fluorescente. También se introdujeron mutaciones 3 KQ para imitar modificaciones postraduccionales. B. La siembra de Tau se cuantificó mediante citometría de flujo en células transfectadas transitoriamente con construcciones que contenían variaciones en la secuencia del conector y expuestas a diluciones en serie de lisado cerebral de AD (panel izquierdo). El panel derecho representa los datos extraídos para una concentración de tau de 20 ng..C. Se realizó un experimento similar comparando el efecto de las modificaciones 3xKQ en la secuencia tau. D. Esquema de los vectores lentivirales que se produjeron para generar líneas celulares estables. E. Se compararon poblaciones de células estables generadas mediante transducción lentiviral con la línea de biosensores original en un ensayo de siembra basado en citometría de flujo. Cada punto representa la media de 4 réplicas biológicas. Barras de error en el error estándar de la media

Para comparar la eficiencia de diferentes sondas tau en la detección de tau competente para siembra derivada del cerebro humano, se transfectaron transitoriamente células HEK293T con las diversas construcciones y se expusieron a diluciones en serie de homogeneizados de cerebro humano durante 24 h. Como referencia, las construcciones CFP e YFP tau RD utilizadas para generar la línea biosensora CRL-3275 original se transfirieron a un único plásmido que contenía el péptido 2A [12]. Esta sonda tau incluye un conector de 21 aminoácidos aleatorios (YPYGILQSTVPRARDPPVATAV). El uso de conectores flexibles generó una señal FRET más baja en comparación con la construcción original, mientras que la proteína de fusión y el conector rígido de 15 aminoácidos (EAAAK)3 produjeron eficiencias FRET más altas cuando las células se expusieron a diluciones en serie de tau (Fig. 1B). La pseudoacetilación aumentó el número de células positivas para FRET aproximadamente tres veces, lo que sugiere que las sondas tau pseudoacetiladas tienen una mayor propensión a la agregación inducida por tau cerebral con EA humana (Fig. 1C). Los valores del área bajo las curvas se proporcionan en la Tabla complementaria 1. Sobre la base de estos hallazgos, se produjeron vectores lentivirales que codifican las sondas tau pseudoacetiladas (Fig. 1D) y se utilizaron para generar líneas celulares HEK293T estables. En comparación con la línea de biosensores original, la población de células estables pseudoacetiladas (EAAAK) 3 que expresan demostró una capacidad robusta y diez veces mayor para detectar semillas de tau competentes en homogeneizados de cerebro humano con EA (Fig. 1E; Fig. 2).

El nuevo biosensor HEK293T clon 18 demuestra una mayor sensibilidad en la amplificación de semillas de tau bioactivas. A. El clon del biosensor seleccionado se comparó con la línea celular del biosensor de tau original en un ensayo de siembra basado en citometría de flujo después de la exposición a diluciones en serie de tau total en lisado cerebral de EA humana o lisado cerebral de control. B. Expansión de A en el rango de concentración de tau inferior. Cada punto representa la media de 4 réplicas biológicas. Barras de error en el error estándar de la media. La tabla resume el límite inferior de detección calculado. Los valores son medias de 2 experimentos independientes ± desviación estándar. C. Imágenes de fluorescencia del clon celular biosensor seleccionado 24 h después de la siembra con lisado cerebral de AD, que representa la estructura fibrilar representativa de la sonda tau agregada. Los paneles inferiores representan la misma condición con mayor aumento. D. Imagen representativa de motas nucleares de tau detectadas después de la siembra en un nuevo clon de células biosensoras. E. Detección de inclusiones positivas de tau-13 humanas derivadas del cerebro (puntas de flecha) incrustadas en agregados de sonda tau fibrilares 24 h después de la siembra. La barra de escala es de 10 μm.

De la población celular estable más prometedora se aislaron 52 clones individuales. Todos ellos fueron probados en ensayos de siembra basados en citometría de flujo (datos no mostrados). Se seleccionó el clon con la relación señal-ruido más alta para una mayor caracterización. En comparación con la línea celular biosensora original, este clon HEK293T (n.º 18) demostró una alta sensibilidad en la detección de semillas de tau bioactivas cuando se aplicaron a las células diluciones en serie que cubrían cinco órdenes de magnitud en concentraciones de tau (Fig. 2A). El límite inferior de detección calculado para el clon 18 fue de 3 pg, más de 10 veces menor que la línea celular biosensora original (Fig. 2B). Para caracterizar las características morfológicas de los agregados de la sonda tau después de la siembra, se tomaron imágenes del clon 18 en un microscopio confocal después de sembrar con AD o lisado cerebral de control. Los agregados fluorescentes de la sonda tau frecuentemente tomaban la forma de estructuras fibrilares, muy similares a los agregados patológicos de tau (Fig. 2C). En particular, encontramos que los agregados no solo se acumularon en el citoplasma, sino también en el núcleo, como se describió anteriormente (Fig. 2D) [38]. Se realizó una inmunotinción con un anticuerpo que no reconoce la sonda, utilizando el anticuerpo tau-13 N-terminal. Después de sembrar con lisado cerebral de AD, se detectaron inclusiones positivas para tau-13 atrapadas dentro de los agregados de la sonda (puntas de flecha, Fig. 2E). Estos puntos probablemente representen material apto para semillas.

Se analizó más a fondo el estado de agregación de la sonda después de la siembra. Las proteínas se extrajeron de las células sembradas en sarkosyl al 1% y se procesaron en una transferencia Western utilizando un anticuerpo de detección que se une a tau RD (Fig. 3A). En comparación con las células CRL-3275, el nivel de expresión basal de la sonda FRET en el clon 18 de HEK293T fue sustancialmente mayor (aumento de aproximadamente seis veces, figura complementaria, figura 1D). Además, después de sembrar con material derivado del cerebro de AD, la mayor parte de la sonda se acumuló en la fracción insoluble de sarkosilo a diferencia de la línea celular original. La transferencia Western también reveló la presencia de una pequeña cantidad de polipéptido no escindido que también se acumuló en la fracción insoluble. Utilizando este protocolo de extracción, encontramos que la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), nuestro control de carga, también se detectó en la fracción insoluble de sarcosilo de acuerdo con otros estudios [39, 40]. En el clon 18 de HEK293T, la transferencia Western reveló una banda adicional de alrededor de 40 kDa que probablemente sea el resultado de una escisión dentro de la proteína fluorescente, como todavía se detecta con el anticuerpo tau 316-355. A continuación, se evaluó la formación de la estructura secundaria de lámina beta-plisada de la sonda mediante tinción con rojo de tiazina. El rojo de tiazina es un tinte fluorescente que tiene alta afinidad por las estructuras fibrilares plisadas beta y que tiñe los agregados de tau maduros en el cerebro con EA [41]. Después de sembrar con lisado cerebral de AD, el nuevo biosensor HEK293T exhibió una señal roja de tiazina robusta que se colocalizó con un indicador fluorescente agregado (Fig. 3C). En la línea celular CRL-3275 original, también se observó positividad del rojo tiazina, pero el tamaño de los agregados fue mucho menor (Fig. 3D).

La sonda Tau en células biosensoras se agrega en estructuras plegadas beta insolubles después de la siembra. A. Esquema del protocolo de extracción de tau soluble e insoluble después de la siembra. B. Transferencia Western que compara la expresión de la sonda tau en la línea celular del biosensor original y el nuevo clon 18 del biosensor HEK293T después de sembrar en fracciones solubles e insolubles en sarcosilo. Se utilizó como anticuerpo primario un anticuerpo que reconoce el dominio repetido de tau. Se utilizó GAPDH como control de carga. En la figura complementaria 2 se muestran imágenes sin recortar de membranas de transferencia Western. Se realizó tinción con rojo de tiazina para detectar la conformación beta-plisada 24 h después de la siembra con lisado cerebral de AD o lisado cerebral de control en el nuevo clon de biosensor HEK293T (C) y la línea de biosensor original D. La barra de escala es de 10 μm.

Recientemente hemos demostrado que parte de la variabilidad en la progresión clínica de la EA se correlaciona con la actividad de siembra de tau, medida por la línea celular biosensora original (CRL-3275) en el cerebro post mortem de la EA [15]. Para investigar si el nuevo biosensor HEK293T clon18 detecta especies de tau patológicas similares, se probaron en paralelo casos de EA que previamente se había demostrado que albergaban una actividad de siembra alta, moderada y baja en ensayos de siembra con ambas líneas celulares. Después de la normalización, la cuantificación de la actividad de siembra proporcionó el mismo patrón en ambas líneas celulares, lo que sugiere que la nueva línea de biosensores detecta especies de tau clínicamente relevantes similares (Fig. 4A).

El nuevo biosensor HEK293T clon 18 amplifica las semillas de tau bioactivas con alta sensibilidad y especificidad. A. Extractos de cerebro de casos de EA ampliamente caracterizados en Dujardin et al. [15], consideradas como actividad de visión baja, moderada y alta, se probaron en ensayos de siembra basados en citometría de flujo en las líneas de biosensores originales y novedosas. La señal se normalizó en la sembradora alta para demostrar un patrón similar en ambas líneas. Las barras representan la media de 2 experimentos independientes individuales. B. La especificidad del nuevo clon del biosensor de tau se confirmó después de la inmunodepleción de tau en un homogeneizado de cerebro con EA. Se inmunodepleción de Tau a partir del lisado cerebral y tanto el material de entrada como el agotado se analizaron en un ensayo de siembra basado en citometría de flujo. La inmunodepleción se confirmó mediante transferencia Western utilizando un anticuerpo tau policlonal como detección (C): se ingresa el carril 1, el carril 2 es una muestra inmunodeplecionada. La membrana que se muestra a la derecha es un tiempo de exposición prolongado que muestra una mancha correspondiente a tau de alto peso molecular (HMW). D. Comparación de la actividad de siembra de tau en ambas líneas de biosensores en varias tauopatías (cada punto representa la media de 3 réplicas técnicas de un caso, las barras de error representan la desviación estándar). E. Se incubó un clon de CHO estable que sobreexpresaba la construcción del biosensor con HMW derivado del cerebro de AD sembrando tau competente o tau de bajo peso molecular (LMW) en ausencia de liposomas durante 48 h y la absorción y amplificación de las semillas se cuantificó mediante citometría de flujo. La adición de RAP 1 μM, un conocido inhibidor de LRP-1, disminuyó la siembra

En el homogeneizado de cerebro con EA, múltiples factores pueden impulsar la agregación de la sonda tau. Para evaluar la especificidad de la sonda para las semillas de tau, se realizó una inmunodepleción. Tau se inmunoprecipitó en el lisado de cerebro humano utilizando un anticuerpo dirigido a la región media. El material de partida y las muestras inmunodepletadas se procesaron en el ensayo de siembra utilizando el nuevo biosensor. En el material agotado, la señal de siembra disminuyó en un 82,3% (Fig. 4B). Las muestras se analizaron mediante transferencia Western para evaluar la cantidad de tau (Fig. 4C). Se encontró un frotis con el material de partida que confirma la presencia de formas de tau muy modificadas y agregadas en el cerebro con EA. Algunas bandas residuales estaban presentes en la muestra inmunodeprimida, lo que sugiere que la inmunoprecipitación fue incompleta, lo que explica por qué se encontró alguna señal residual en el ensayo de siembra.

A continuación, para comparar la sensibilidad y especificidad de varias semillas de tau, se probaron lisados cerebrales de EA, parálisis supranuclear progresiva (PSP), degeneración cortico basal (CBD), enfermedad de Pick (PiD) y casos de control en las células biosensoras originales y novedosas. (Figura 4D). Para todos los casos, la entrada se normalizó según el contenido total de tau medido mediante transferencia Western (50 ng). Como era de esperar, cuando utilizamos lisados cerebrales de una región con patología tau manifiesta donde se esperaba una alta actividad de siembra, como la corteza frontal (área 8 de Brodmann) en las etapas tardías de Braak (V/VI), la señal fue comparable entre líneas. Además, la nueva línea de biosensores fue capaz de detectar consistentemente actividad de siembra incluso en lisados de EA de la corteza visual primaria (área 17 de Brodmann) que deberían estar libres de patología tau para calificar para el estadio III o IV de Braak.

Las células CRL-3275 son capaces de detectar tau en tauopatías humanas sin EA, pero parecen tener una clara preferencia por las "cepas" de tau relacionadas con la EA (Fig. 4D). Nuestra hipótesis es que, al mejorar la eficiencia de FRET con fluoróforos mejorados y enlazadores optimizados, y al mismo tiempo elegir el dominio que más se asemeja a los núcleos de fibrillas de AD e introducir cambios postraduccionales relacionados con AD en residuos de lisina específicos, podríamos diseñar una sonda más sensible que aún mantenía su preferencia por semillas relacionadas con AD. Probamos muestras de PiD, PSP, CBD y controles (Fig. 4D) y descubrimos que el clon 18 de hecho no mostró una mayor sensibilidad para tau no AD, ya que se observó que la señal permaneció baja en otras tauopatías (a pesar de la coincidencia con equivalentes). cantidades de tau añadidas al ensayo).

En la EA, tau se propaga de una célula a otra a través de regiones cerebrales interconectadas. La proteína 1 relacionada con el receptor de LDL (LRP1) es un receptor endocítico para tau monomérica y patológica y media la captación de tau y también la siembra [19, 42]. En ausencia de liposomas para permeabilizar la membrana celular, el biosensor original propaga semillas con baja eficiencia, posiblemente relacionado con los niveles relativamente bajos de LRP1 presentes en las células HEK. La mayor sensibilidad del reportero en la línea diseñada muestra un aumento de 10 veces en la señal FRET después de la incubación con una preparación de tau de alto peso molecular (HMW) derivada del cerebro en comparación con la línea original. Curiosamente, aunque las células HEK293 expresan niveles bajos de LRP1 [19], la siembra se redujo cuando se coincubó HMW con RAP 1 μM, un antagonista conocido de LRP1 (Figura 2A complementaria), lo que sugiere que la mayor sensibilidad observada no se debió a un aumento en la absorción de tau, sino a un sistema informador más sensible. Dado que las células de ovario de hámster chino (CHO) expresan niveles más altos de LRP1 [19], diseñamos una línea celular clonal que sobreexpresa la misma sonda biosensora de tau. Cuando este clon de CHO estable se incubó con HMW tau en ausencia de liposomas, se detectó la siembra. En presencia de RAP, la siembra disminuyó en dos tercios, lo que sugiere que la mayor parte de la absorción de tau estuvo mediada por LRP1 (Fig. 4E). Este experimento confirmó que dicha construcción informadora optimizada basada en lentivirales se puede utilizar no solo para estudiar la siembra con plantilla sino también los mecanismos de absorción de tau extracelular.

Las líneas celulares biosensoras de tau basadas en FRET son un método eficaz para cuantificar la capacidad de siembra de especies de tau en muestras biológicas. Aquí, describimos una nueva línea de biosensores de tau para EA con sensibilidad mejorada, utilizando el conocimiento recientemente adquirido sobre las características estructurales de los agregados de tau en la EA. Desarrollamos sondas tau FRET basadas en una única construcción de ADN utilizando el péptido autoescindible T2A. Esta construcción permitió la sobreexpresión eficiente del informador tau utilizando una única construcción lentiviral. A diferencia de intentos anteriores de aumentar la expresión de la sonda tau en células biosensoras [43], esta estrategia resultó en una mejora espectacular en la expresión de la sonda en comparación con la línea biosensora original. Como se informó anteriormente en otro estudio que utilizó diferentes reporteros fluorescentes, la optimización del par de proteínas fluorescentes permitió la generación de una señal FRET robusta en un amplio rango dinámico [44].

La secuencia del fragmento tau se seleccionó para incluir la secuencia completa de aminoácidos de los agregados centrales de AD. Utilizando la transfección transitoria en células T HEK 293, comparamos múltiples secuencias enlazadoras y descubrimos que un enlazador rígido de 15 aminoácidos proporcionó una señal FRET optimizada medida por citometría de flujo. Al igual que la línea de biosensores original, la nueva sonda tau incluía una mutación en la posición 301. Se ha demostrado que las sustituciones de prolina 301 modifican la estructura local de tau y fomentan su agregación sembrada [45, 46]. La línea CRL-3275 tiene una mutación P301S, mientras que el clon 18 HEK293T tiene una mutación P301L. El mutante P301L puede explicar potencialmente parte de la sensibilidad mejorada de la nueva línea celular. Sin embargo, ambos mutantes se utilizan por igual en el campo y estudios previos que compararon los efectos de los dos mutantes informaron hallazgos inconsistentes [47, 48].

La estructura crio-EM de los agregados de tau en la EA ha revelado la presencia de densidades a nivel de lisinas 317 y 321 [32]. Posteriormente, se informaron modificaciones postraduccionales que incluyen acetilación y ubiquitinación en las lisinas 311, 317 y 321 en agregados de tau derivados del cerebro y se propusieron como un mecanismo de neutralización de carga que favorece el apilamiento de protofilamentos en filamentos helicoidales pares [26, 37]. La modificación de la sonda tau que imita la acetilación en los residuos 311, 317 y 321 dio como resultado un aumento masivo de la formación de agregados en las células biosensoras, lo que sugiere que la sonda modificada puede tener una mayor propensión a la agregación.

En total, las múltiples optimizaciones de la sonda tau dieron como resultado una línea celular con un aumento de más de diez veces en la sensibilidad a las semillas de tau en el extracto de cerebro con EA. El clon 18 detectó una señal FRET significativa en la concentración total de tau en el equivalente femtomolar de los monómeros de tau mientras mantenía la especificidad por las semillas de tau como lo demuestra la inmunodepleción. El aumento de la sensibilidad permitió la detección de la actividad de siembra de tau en regiones con señal esperada baja, como la corteza visual primaria en los casos de EA Braak III/IV. Además, al igual que la línea celular biosensora CRL-3275 original, el reportero clon 18 recién generado detectó una variación constante de la actividad de siembra en tres casos de EA clasificados como sembradores bajos, moderados y altos en un estudio previo [15].

La relevancia de las células biosensoras basadas en FRET ha sido cuestionada por un estudio que utiliza proteínas de fusión tau recombinantes [49]. Según los autores, cuando tau se fusiona con una proteína fluorescente, el impedimento estérico puede impedir el alargamiento de los agregados hasta formar filamentos completamente formados. En consecuencia, la señal FRET generada en las células biosensoras puede resultar de procesos biológicos que divergen de la agregación, incluidos los gránulos de estrés o la separación de fases líquido-líquido. Este estudio utilizó una secuencia conectora corta de 13 a 14 aminoácidos entre el fragmento tau y el indicador fluorescente que es más corta que el conector presente en la línea biosensora original y la secuencia optimizada presentada en este estudio. Además, la cuantificación dinámica de la formación de agregados en las células biosensoras utilizando imágenes de células vivas siguió consistentemente un patrón compuesto por una fase de retraso, seguida de una fase de crecimiento y una meseta (Figura complementaria 3), como se informó anteriormente en la línea de biosensores original. 50]. Este patrón estereotipado recuerda a los modelos que describen la cinética de la fibrilogénesis [51]. Aquí, demostramos que los agregados generados en células biosensoras después de la siembra consisten en láminas beta-plisadas insolubles en sarkosilo. Hemos realizado estudios EM preliminares que no lograron identificar inclusiones que contengan filamentos helicoidales emparejados en las células. Por lo tanto, los agregados positivos de FRET en este modelo deben verse como evidencia de la competencia de la semilla de tau presentada a las células, en lugar de como un modelo de conformación de PHF per se. Estudios recientes y elegantes de crioEM [52] muestran de manera concluyente que, aunque las estructuras de láminas beta plisadas se pueden formar fácilmente, incluso pequeños cambios en las condiciones del tampón o en la longitud del péptido afectan la probabilidad de formar fibrillas de tau AD óseas in vitro. Nuestra experiencia actual está alineada con estas observaciones.

Aquí, describimos los métodos para el diseño y generación de líneas celulares biosensoras de tau basadas en FRET optimizadas para la detección de la actividad de siembra de tau. Si bien se propusieron otros métodos como RT-QuIC para cuantificar la actividad de siembra de tau, las células biosensoras permiten estudios de agregación con plantilla en un entorno celular. El uso de una línea celular que expresa LRP1, un conocido receptor de superficie para tau, permite estudiar los mecanismos de captación y los eventos celulares posteriores utilizando la misma sonda biosensora.

La integración del conocimiento actual sobre la base estructural de los pliegues tau en la EA y el papel de las modificaciones postraduccionales en el diseño de las sondas condujo a una sensibilidad y especificidad mejoradas. Gracias a las descripciones recientes del pliegue tau en varias tauopatías, estos métodos pueden guiar el desarrollo de otras líneas de biosensores diseñadas para la detección de confórmeros específicos de enfermedades.

Marc Diamond proporcionó la línea celular Tau RD P301S FRET Biosensor (CRL-3275). Las células HEK293T se solicitaron a ATCC (CRL-11268). Las células se mantuvieron en DMEM suplementado con 10% de FBS y penicilina-estreptomicina a 37 °C y 5% de CO2 en una atmósfera humidificada. La línea celular CHO se obtuvo de ATCC (CCL-61) y se cultivó en DMEM/F12 suplementado con 10% de FBS y penicilina-estreptomicina.

La generación de los vectores lentivirales Tau-RD-P301S-CFP y Tau-RD-P301S-YFP se ha descrito en [12]. Los plásmidos fueron proporcionados por Marc Diamond. Los fragmentos que codifican RD-P301S-CFP y RD-P301S-YFP se subclonaron en un plásmido pcDNA3.1 que contenía una secuencia peptídica de autoescisión T2A. Todas las demás construcciones de ADN, incluidos los vectores lentivirales, se sintetizaron y ordenaron a Twist Bioscience para plásmidos de expresión o a Vectorbuilder para construcciones lentivirales. Todas las secuencias de ADN sintetizadas se optimizaron con codones utilizando la herramienta en línea GeneDesign [53]. El mapa detallado de la construcción lentiviral más eficiente y su secuencia se proporciona en material complementario.

El tejido cortical humano congelado se homogeneizó en PBS suplementado con un cóctel inhibidor de proteasa Halt 1X (ThermoFisher Scientific) (500 µl de PBS para 100 mg de tejido), con 20 movimientos hacia arriba y hacia abajo en un homogeneizador Dounce de vidrio de 2 ml. Las muestras se transfirieron a un tubo Eppendorf de 1,5 ml y se centrifugaron a 10.000 g durante 10 min. El sobrenadante se recogió, se repartió en alícuotas y se almacenó a -80 °C hasta su uso posterior. La tau de alto peso molecular (HMW) y de bajo peso molecular (LMW) se preparó mediante cromatografía de exclusión por tamaño como se describió anteriormente [21]. Brevemente, los homogeneizados de cerebro se procesaron en columnas Superdex200 10/300GL (n.º 17–5175-01, GE Healthcare) en PBS. Se recogieron fracciones de 500 μL. Las fracciones 1 a 4 de APM se reunieron y se concentraron mediante ultracentrifugación a 150.000 g durante 30 min a 4 °C. Se descartó el sobrenadante y el sedimento se resuspendió en 75 µl de PBS para generar el concentrado de tau de APM. Las fracciones de BPM 12 a 14 se reunieron y se concentraron aproximadamente 20 veces usando un Ultra-15 (10 k) (Amicon, no. UFC901024) durante 10 minutos a 4000 g. La concentración total de tau se cuantificó mediante transferencia Western utilizando diluciones en serie de la proteína recombinante tau-441 (Sigma-Aldrich nº T0576) y un anticuerpo policlonal de conejo anti-tau humano (A0024, Dako) como anticuerpo primario. Los diagnósticos demográficos y neuropatológicos de los casos humanos que se utilizaron se resumen en la Tabla complementaria 2.

Se sembraron treinta mil células HEK293T por pocillo en una placa de 24 pocillos. Después de 24 h, las células se contaron y se infectaron con partículas lentivirales con una multiplicidad de infección de 30 en 250 µl de medio acondicionado suplementado con 5 µg/ml de polibreno. Al día siguiente, se agregaron 250 μL de medio de cultivo fresco. Las células se expandieron durante las siguientes 2 semanas para permitir la eliminación de partículas virales infecciosas. Para las selecciones de células clonales, las células se separaron de un matraz de cultivo T75 con confluencia al 75% con 5 ml de Accutase y se resuspendieron en HBSS filtrado de 0,22 μm que contenía albúmina sérica bovina al 1%. Las células se procesaron en el clasificador de células Biorad S3e y el 10 % de las células más brillantes se sembraron a razón de 1 célula/pocillo en placas de 96 pocillos que contenían 150 µl de medio acondicionado filtrado a 0,22 µm. Se cultivaron, amplificaron y caracterizaron clones individuales en ensayos de siembra. Se siguió el mismo procedimiento para la transducción de células CHO excepto que se sembraron 10.000 células CHO en una placa de 24 pocillos para la infección viral.

El ensayo del biosensor FRET de siembra de tau mediante transfección transitoria se realizó de la siguiente manera. Las células HEK293T se transfectaron de forma inversa en placas de 96 pocillos de fondo transparente Costar Black (Corning) (previamente recubiertas con 50 μg/ml de poli-D-lisina), utilizando 0,3 μl/pocillo de reactivo trans-IT X2 (Mirus) en 10 μl/pocillo. Opti-MEM según el protocolo del fabricante con 100 ng/pocillo de ADN plasmídico. Se sembraron 6 x 10 células E5 por pocillo en un volumen final de 100 μl. Después de 24 h, las células se lavaron con PBS estéril. Los extractos de cerebro humano se incubaron con Lipofectamine 2000 (Invitrogen, concentración final 1% vol/vol) en Opti-MEM (volumen final de 50 μL por pocillo) durante 20 minutos a temperatura ambiente antes de agregarlos a las células. Cada condición se probó por triplicado o cuadruplicado. Para el ensayo de siembra usando la línea celular CRL-3275 del clon 293 T estable, se usó un procedimiento similar excepto que las células no se transfectaron de manera inversa y esa placa se sembró con 30.000 células por pocillo. El experimento se analizó mediante citometría de flujo o imágenes de células vivas en un lector multimodo Cytation 5 (BioTek) con 1 imagen cada 30 minutos. Para la citometría de flujo, 24 h después de la incubación, con extractos de cerebro, las células se recogieron con 50 μl de tripsina y se transfirieron a placas con fondo en U de 96 pocillos (Corning) utilizando 50 μl de medio de cultivo FBS al 10 % para neutralizar la tripsina. Las células se sedimentaron a 1200 g durante 10 minutos, se resuspendieron en paraformaldehído al 2% frío durante 10 minutos, se sedimentaron a 1200 gy se resuspendieron en tampón FACS que contenía BSA, EDTA y azida al 0,09% (Miltenyi). Las células se analizaron en el citómetro de flujo MACSQuant VYB (Miltenyi) para la cuantificación de fluorescencia y FRET. El canal CFP/mTurquoise2 y FRET se midieron excitando las células usando el láser de 405 nm y leyendo la emisión de fluorescencia en los filtros de 405/50 nm y 525/50 nm, respectivamente. Para cuantificar la señal FRET, se creó una gráfica de densidad de dos parámetros de FRET versus el donante CFP/mTurquoise2, y se usaron células tratadas con control o condición simulada sola para identificar la población negativa para FRET. Se registró el porcentaje de células positivas para FRET y la intensidad de fluorescencia media. La densidad FRET integrada se calculó multiplicando los dos parámetros como se propuso anteriormente [14]. Se analizaron unas 40.000 células por pocillo. Los datos de citometría de flujo se analizaron utilizando el software FlowJo v10.7 (BD Biosciences).

Para obtener imágenes de fluorescencia, los ensayos de siembra se realizaron en placas negras de 96 pocillos con fondo de película μClear (Greiner Bio-One). El procedimiento fue el mismo que el descrito anteriormente. Todas las imágenes se adquirieron en un microscopio de barrido láser confocal Olympus FV3000. Las células se fijaron en PFA al 4% en PBS durante 15 min. Para la inmunocitoquímica, el bloqueo se realizó con BSA al 1%, Tween20 al 0,1% en PBS durante 30 minutos. El anticuerpo primario Tau-13 (Abcam) se aplicó durante la noche a 4 °C. Para la tinción con rojo de tiazina, después de la fijación, las células se incubaron durante 15 minutos en una solución de rojo de tiazina al 0,005% (p/v) en etanol al 50% en una solución de TBS y se lavaron 3 veces en TBS. La contratinción nuclear se realizó con una solución DAPI de 1 μg/ml durante 5 minutos. Para evitar la superposición con los espectros de mNeonGreen, se excitó rojo de tiazina a 550 nm y se registró a 650 nm.

Para el análisis de la expresión y la solubilidad del indicador tau después de la siembra, las células se sembraron en placas de 6 pocillos (previamente recubiertas con 50 μg/ml de poli-D-lisina) a una densidad de 9 x 10E5 células por pocillo. Al día siguiente, se incubó extracto de cerebro humano (1 µg de tau total por pocillo) con Lipofectamine 2000 (Invitrogen, concentración final 1% vol/vol) en Opti-MEM (volumen final de 2 ml por pocillo) durante 20 minutos a temperatura ambiente. antes de ser añadido a las células. Después de 24 h, las células se lavaron 3 veces con PBS y se lisaron en tampón RIPA que contenía un cóctel inhibidor de proteasa/fosfatasa 1X. El contenido de proteína total se cuantificó mediante BCA. El volumen de todas las muestras se ajustó para que coincidiera con el contenido de proteína. Se añadió una concentración final de sarkosilo al 1% y las muestras se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente mientras se agitaba. Luego las muestras se ultracentrifugaron a 100.000 g durante 1 h. El sedimento se resuspendió en PBS con un cóctel de inhibidor de proteasa/fosfatasa 1X. Las transferencias Western se realizaron en gel Bis-Tris al 4-12% (Invitrogen) en MOPS y se transfirieron a membranas de PVDF. Se utilizó como anticuerpo primario el anticuerpo anti-tau 316–355 dirigido al dominio repetido (clon 77G7, BioLengend). Se utilizó anti-GAPDH como control de carga (Abcan, ab83956). Las transferencias Western se revelaron en un sistema Odyssey LI-COR. Para el inmunoagotamiento de tau, se entrecruzó anticuerpo anti-tau (clon D5D8N de Cell Signaling Technology) con perlas de proteína G (5 µg de anticuerpo para 25 µl de perlas) y se incubó en una muestra de tau HMW (volumen final 100 µl) durante la noche a 4°C. Las perlas se sedimentaron mediante centrifugación y se recogió el sobrenadante inmunodeprimido para su análisis. La inmunoprecipitación se confirmó mediante transferencia Western en el material de partida y el sobrenadante utilizando un anticuerpo policlonal de conejo anti-tau humano (A0024, Dako) como anticuerpo primario.

Las estadísticas y gráficos básicos se generaron en GraphPad Prism v9.1.1 (GraphPad). El valor de p se indicó como * para p < 0,05, ** para p < 0,01, *** para p < 0,001, **** para p < 0,0001. Se utilizó ANOVA unidireccional para todos los análisis estadísticos, excepto para la Fig. 4D en la que la señal se comparó mediante la prueba no paramétrica de Mann-Whitney.

Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante el presente estudio están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable.

Las líneas celulares descritas en este manuscrito se depositarán en la Colección Estadounidense de Cultivos Tipo.

Proteína tau asociada a microtúbulos

enfermedad de alzheimer

Transferencia de energía de resonancia de Förster

Filamento helicoidal emparejado

Riñón embrionario humano

Repetir dominio

Proteína fluorescente cian

Proteína fluorescente amarilla

Parálisis supranuclear progresiva

Degeneración cortico basal

enfermedad de pick

Conversión inducida por temblores en tiempo real

Microscopio de electrones

Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa

Proteína 1 relacionada con el receptor de LDL

Alto peso molecular

Ovario de hámster chino

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Este trabajo fue financiado en parte por una subvención de investigación patrocinada por Abbvie; El trabajo también fue apoyado por subvenciones del Rainwater Foundation Tau Consortium (BTH), NIH R56AG061196, RF1AG059789, RF1AG058674 y P30AG062421 (BTH). AL contó con el apoyo de la Fundación Nacional Suiza para la Ciencia (P2ELP3_184403), la Asociación de Alzheimer (AACSF-19–617308), la Fundación Profesor Dr. Max Cloetta y la Fundación Uniscientia, Vaduz y el Programa de Investigación e Innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea en el marco del programa Marie Skłodowska- Acuerdo de subvención Curie n.º 839098.

Departamento de Neurología, Hospital General de Massachusetts/Facultad de Medicina de Harvard, 114 16Th Street, Charlestown, MA, 02129, EE. UU.

Caitlin Commins, Noah Quittot, Zhanyun Fan, Rachel E. Bennett y Bradley T. Hyman

Facultad de Medicina de Harvard, Boston, MA, EE. UU.

Aurelien Lathuiliere, Romain Perbet, Noé Quittot, Rachel E. Bennett y Bradley T. Hyman

Centro de la Memoria, Departamento de Rehabilitación y Geriatría, Hospital Universitario de Ginebra y Universidad de Ginebra, Ginebra, Suiza

Aurelien Lathuiliere

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Conceptualización: AL, BTH; Metodología: AL, BTH, ZF; Análisis formal: AL, BTH; Investigación: AL, YJ, RB, CD, CC, NQ, ZF, REB; Recursos: BTH; Curación de datos: AL, YJ; Redacción: borrador original: AL, BTH; Redacción: revisión y edición: AL, BTH, RB, NQ, REB.; Visualización: AL; Supervisión: AL, BTH; Administración de proyectos: AL, BTH; Adquisición de financiación: AL, BTH.

Correspondencia a Bradley T. Hyman.

El tejido humano fue proporcionado por el Centro de Investigación de la Enfermedad de Alzheimer de Massachusetts (ADRC) con la aprobación del Mass General Brigham IRB (1999P009556).

No aplica.

El Dr. Hyman tiene un familiar que trabaja en Novartis y posee acciones en Novartis; forma parte del SAB de Dewpoint y posee acciones. Es miembro de un consejo asesor científico o consultor de AbbVie, Aprinoia Therapeutics, Arvinas, Avrobio, Axial, Biogen, BMS, Cure Alz Fund, Cell Signaling, Eisai, Genentech, Ionis, Latus, Novartis, Sangamo, Sanofi, Seer, Takeda, Departamento de Justicia de EE. UU., Vigil, Voyager. Su laboratorio cuenta con el respaldo de subvenciones de investigación de los Institutos Nacionales de Salud, Cure Alzheimer's Fund, Tau Consortium y la Fundación JPB, y acuerdos de investigación patrocinados de Abbvie, BMS y Biogen.

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Tabla complementaria 1. Área calculada bajo las curvas para los paneles 1B, 1C y 1E. Figura complementaria 1. Membranas de transferencia Western sin recortar utilizadas para preparar la figura 3B. A. Anticuerpo primario con dominio repetido Tau. B. Anticuerpo primario GAPDH. C. Imagen fluorescente original con la superposición de ambos canales. Las muestras se cargaron en el siguiente orden: 1: línea CRL-3275 transfectada solo con lipofectamina, fracción soluble, 2: línea CRL-3275 transfectada solo con lipofectamina, fracción insoluble, 3: línea CRL-3275 transfectada con semillas de tau, fracción soluble, 4: línea CRL-3275 transfectada con semillas de tau, fracción insoluble, 5: clon HEK293T transfectado solo con lipofectamina, fracción soluble, 6: clon HEK293T transfectado solo con lipofectamina, fracción insoluble, 7: clon HEK293T transfectado con semillas de tau, fracción soluble, 8: Clon HEK293T transfectado con semillas de tau, fracción insoluble. Otras muestras mostradas en la membrana no son relevantes para el presente manuscrito. D. Cuantificación por transferencia Western del dominio de repetición tau normalizado en la expresión de GAPDH en las células CRL-3275 y el clon HEK293T. Figura complementaria 2. Detección de semillas de tau en ausencia de liposomas. Tanto CRL-3275 como HEK293T clon 18 fueron expuestos a tau derivada del cerebro de HMW o LMW AD durante 48 horas. La adición de 1 μM de RAP redujo la disminución de la siembra. Figura complementaria 3. Cinética de formación de agregados en el nuevo clon 18 del biosensor HEK293T. El nuevo clon 18 del biosensor HEK293T se expuso a diluciones en serie de lisado cerebral de EA y se ejecutó en un generador de imágenes de células vivas durante 60 horas. Los agregados se cuantificaron cada 30 minutos. La línea continua es la media de 4 réplicas. El área es ±SEM para cada punto. Tabla complementaria 2. Diagnóstico demográfico y neuropatológico de los casos humanos utilizados para el estudio.

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Reimpresiones y permisos

Lathuiliere, A., Jo, Y., Perbet, R. et al. Detección específica de la actividad de siembra de tau en la enfermedad de Alzheimer utilizando células biosensoras diseñadas racionalmente. Mol Neurodegeneración 18, 53 (2023). https://doi.org/10.1186/s13024-023-00643-2

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Recibido: 09 de marzo de 2023

Aceptado: 28 de julio de 2023

Publicado: 08 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s13024-023-00643-2

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