Ultra

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 13017 (2023) Citar este artículo

157 Accesos

Detalles de métricas

La identificación de especies es necesaria para prevenir la introducción de plagas de plantas exóticas a través del comercio mundial. Muchas de estas plagas están poco estudiadas y carecen de datos de secuencias de ADN disponibles públicamente en los que se puedan basar métodos rápidos de identificación molecular. Uno de esos linajes es el género Chrysodeixis, que incluye tres especies de posible interés para las iniciativas comerciales de los Estados Unidos: C. includens, C. chalcites y C. eriosoma. Aquí describimos un método para generar perfiles robustos de ADNr 45S utilizando secuenciación de lectura larga para aclarar las relaciones evolutivas y desarrollar una técnica de identificación por PCR en tiempo real. Una herramienta de identificación de este tipo será útil para diferenciar rápidamente entre especies de Chrysodeixis de interés cuarentenario donde los métodos tradicionales de identificación morfológica son insuficientes. Los métodos moleculares como este reducen en gran medida el tiempo dedicado a identificar cada muestra, permiten la detección de ADNe, aumentan enormemente el rendimiento y aumentan la probabilidad de detección. Los métodos presentados aquí serán generalmente adaptables a cualquier taxón de lepidópteros poco estudiado que requiera un ensayo de diagnóstico molecular y, con ajuste o prueba de los cebadores, podrían aplicarse a cualquier grupo para el cual el desarrollo de perfiles de ADNr en un entorno de mesa resultaría útil.

El diagnóstico de especies es cada vez más importante en un mundo globalizado donde la translocación de especies (especialmente plantas e insectos) mediada por humanos está ocurriendo a un ritmo mayor que nunca antes1,2. Con el aumento del movimiento de personas y el envío global de productos agrícolas, incluidos cultivos alimentarios, flores cortadas y material de embalaje de madera, la capacidad de detectar e identificar rápidamente cualquier insecto asociado es fundamental para limitar la introducción y el establecimiento de especies de plagas invasoras3,4. En los Estados Unidos, las inspecciones de carga y productos básicos en los puertos de entrada y los estudios nacionales en busca de plagas exóticas se utilizan para detectar la presencia de plagas de insectos. La identificación de estos especímenes puede ser difícil y a menudo depende de un registro preciso del huésped en el que se encontró el organismo y el origen del envío, los cuales pueden ser complicados debido al transbordo a través de múltiples ubicaciones5. En muchos casos, las plagas interceptadas sólo pueden identificarse según la familia, subfamilia o género. Esto es especialmente cierto en el caso de los lepidópteros, que se interceptan casi exclusivamente en el estado larvario.

La identificación de insectos capturados durante los estudios nacionales también es un desafío porque la atracción cruzada por señuelos de feromonas puede dar como resultado la captura de docenas o cientos de insectos similares que no son objetivos en una sola trampa. Es deseable una identificación rápida de objetivos potenciales para detectar especies invasoras antes de su establecimiento (es decir, la fase de retraso6), pero hacerlo a menudo requiere la disección de cada muestra o un enfoque molecular, como el código de barras de ADN de la citocromo c oxidasa 1 (CO1)7. Ambos enfoques requieren mucho tiempo y pueden no ser confiables para especies que no han sido descritas previamente, están mal caracterizadas o carecen de datos de secuencia disponibles públicamente. Para mejorar las posibilidades de detección de especies invasoras, se han desarrollado ensayos moleculares rápidos o de alto rendimiento para algunas especies de plagas de insectos potencialmente invasivas y comúnmente interceptadas (por ejemplo, 8,9,10,11). Las técnicas de identificación molecular de alto rendimiento no solo aumentan la probabilidad de detección, sino que también reducen drásticamente el tiempo y el costo necesarios para completar las identificaciones, especialmente en el caso de ensayos multiplexados12,13. Algunas especies que presentan un alto potencial de invasión también están poco estudiadas y carecen de información básica, como la ubicación filogenética y la descripción de especies hermanas, la variación filogeográfica dentro de la especie o datos de secuencia disponibles públicamente7,14.

Si bien hay disponible una gran base de datos de secuencias de CO1 para muchas especies (es decir, BOLD15, GenBank16), esta región puede no ser adecuada para el desarrollo de técnicas basadas en secuencias de ADN como la PCR en tiempo real debido al alto contenido de AT, la baja variación entre especies y /o una alta variación intraespecies resultante de una rápida evolución y deriva genética17. En estas situaciones, la identificación de especies a menudo se puede llevar a cabo de manera confiable utilizando regiones de ARN ribosomal 45S (ARNr). Entre los primeros ácidos nucleicos que se secuenciaron, el ARNr 45S es muy abundante en el genoma y tiene una longitud relativamente corta18. La unidad de ARNr se compone de repeticiones en tándem estructuralmente conservadas formadas por un espaciador transcrito externo (ETS), ARNr 18S, espaciador transcrito interno (ITS) 1, ARNr 5.8S, ITS2 y ARNr19 28S. Estas propiedades del ARNr, así como la conservación de la secuencia en las regiones codificantes y las altas tasas de evolución en las regiones ITS no codificantes en el ADN ribosómico subyacente (ADNr), llevaron al uso de este locus para estudios filogenéticos en todo el árbol de vida20,21. A partir de estos estudios filogenéticos, se pusieron a disposición del público grandes cantidades de datos de secuencias de ADNr a partir de los cuales los investigadores han desarrollado métodos para la identificación rápida de especies. Estos loci son ideales para tales ensayos moleculares porque las regiones ITS están relativamente conservadas dentro de las especies, son muy variables entre especies (con mutaciones puntuales e indeles) y están presentes en un gran número de copias en el genoma. Esto los convierte en candidatos ideales para desarrollar ensayos de PCR basados ​​en sondas8,22,23 y permite la amplificación de estas secuencias incluso a partir de ADN degradado o en muestras ambientales de alta complejidad24,25. Debido a que las secuencias codificantes de ARNr 18S, 28S y 5.8S están altamente conservadas, el desarrollo de cebadores universales para amplificar toda esta región es posible incluso si no hay datos de secuencias de ADNr disponibles para la especie en cuestión. Sin embargo, debido al gran número de copias dentro de un solo genoma, existen diferencias de nucleótidos entre las copias dentro de un individuo. Estas variaciones intraindividuales se consideran ribotipos26,27, y dichas variaciones ribotípicas deben evitarse al desarrollar una técnica confiable basada en el ADN para la identificación de especies; sin embargo, la caracterización de la variación ribotípica rara vez se completa. Por lo tanto, el uso de un método de secuenciación de alto rendimiento es útil para caracterizar la diversidad ribotípica y para diferenciar entre variaciones fijas y transitorias que existen entre repeticiones.

Para explorar la utilidad y viabilidad de generar un perfil de ADNr para desarrollar técnicas de identificación molecular, consideramos un grupo económicamente importante para el cual hay poca investigación molecular disponible: Chrysodeixis (Hübner), un género de polillas de la subfamilia Plusiinae (Noctuidae). Dentro del género, tres especies son de interés económico en los EE. UU. y se beneficiarían de la identificación molecular. El primero es Chrysodeixis includens (Walker), que se encuentra en gran parte de América, donde prefiere los climas subtropicales a los tropicales. Aunque es probable que la especie pase el invierno sólo en las partes sur o sureste de los EE. UU., migrando hasta Nueva Escocia, es la especie más común en las áreas agrícolas del este de los EE. UU.28. Las larvas son polífagas y se han registrado en 174 especies de plantas en 39 familias, y C. includens es una de las plagas de la soja más importantes en su área de distribución nativa (p. ej., 29, 30, 31). El segundo, C. eriosoma (Doubleday), se encuentra en hábitats tropicales de Asia y Oceanía, incluidas poblaciones de las islas hawaianas, la Polinesia francesa32 y Nueva Zelanda, donde se considera una de las plagas más importantes de los cultivos hortícolas33. Las larvas son polífagas y se alimentan de varias especies de familias como Asteraceae, Fabaceae y Solanaceae. Por último, C. chalcites (Esper) se encuentra en hábitats subtropicales a tropicales en todo el Mediterráneo, Asia occidental y gran parte de África34. Al igual que las dos especies discutidas anteriormente, las larvas son altamente polífagas y se alimentan de plantas de Asteraceae, Brassicaceae, Fabaceae, Poaceae, Solanaceae y muchas otras35. Las larvas de C. chalcites se consideran plagas importantes del tomate, la alfalfa, la papa, el pepino, el pimiento y otros cultivos de importancia económica36. Si bien ninguna de las tres especies pasa el invierno en regiones templadas, se sabe que C. chalcites establece poblaciones durante todo el año en invernaderos en Europa, tan al norte como Noruega34. También se ha descubierto en Michigan, Ohio, Columbia Británica y Ontario36,37,38. Se han interceptado especímenes de C. chalcites en los puertos de entrada federales de Estados Unidos más de 300 veces entre 1984 y 201434, incluidas 84 veces solo en California, y se prevé que tendrá un impacto grave si se establece allí39.

Debido a su similitud morfológica y biológica, la taxonomía e identificación de C. chalcites y C. eriosoma es complicada. Los especímenes tipo de C. chalcites y C. eriosoma se recolectaron en ubicaciones geográficamente dispares, pero generalmente se trataron como sinónimos hasta que Kostrowicki40 separó las dos especies basándose en diferencias menores en el patrón de las alas y los genitales masculinos. Autores posteriores (por ejemplo, 41) aceptaron o rechazaron la delimitación de Kostrowiki, pero en general determinaron que se necesitaba más trabajo y que, si fueran dos especies, no podrían separarse morfológicamente de manera confiable36. Los rangos de distribución de ambas especies se superponen en Medio Oriente y Asia occidental, y ambas se encuentran habitualmente en India y Pakistán durante los estudios de diversidad plusiina42,43. Las muestras se identifican erróneamente con regularidad y el método actual de separación es mediante códigos de barras de CO1 y consideración del origen geográfico44. Los especímenes de Chrysodeixis reportados en Columbia Británica en 2005 se describieron originalmente como C. eriosoma38, pero luego Lafontaine y Schmidt44 determinaron que eran C. chalcites.

Debido al elevado número de intercepciones de larvas plusiinas en productos importados y a los recientes descubrimientos de poblaciones invasoras de C. chalcites en América del Norte, es necesario un método molecular para diagnosticar individuos de forma rápida y fiable. Aquí, presentamos un método de PCR en tiempo real para la identificación de Chrysodeixis económicamente importantes que se encuentran rutinariamente durante encuestas nacionales o se interceptan en los puertos de entrada, utilizando una secuenciación de lectura larga y de cobertura profunda. Se utilizaron porciones de los perfiles de ADNr 45S para cada espécimen, junto con datos de secuencia de CO1, para aclarar las relaciones entre las tres especies. El método de secuenciación de ADNr 45S descrito aquí es universalmente aplicable a todos los lepidópteros y adaptable a casi cualquier linaje con un ajuste adecuado de los cebadores.

Se utilizó secuenciación de lectura larga (Oxford Nanopore Technologies) para desarrollar un perfil de ADNr 45S de un solo individuo para cada una de las tres especies de Chrysodeixis utilizando amplicones de PCR de largo alcance. Los amplicones ensamblados tenían 6474 pb para C. includens, 6493 pb para C. eriosoma y 6494 pb para C. chalcites. Las secuencias individuales de ADNr fueron variables tanto con indeles como con mutaciones puntuales en toda la región. La mayoría de las ambigüedades fueron de baja frecuencia, posiblemente debido a errores de PCR o de secuenciación, y no afectaron el ensamblaje final. Dentro de los perfiles de ADNr para cada muestra de especie, las ambigüedades fijas identificadas mediante LoFreq45 se consideraron "ribotipos" (Tabla complementaria 1). Tanto para C. includens como para C. chalcites, se seleccionaron cuatro loci para la investigación mediante la secuenciación de Sanger. De estos, un ribotipo que aparece como una W fija (A o T) se detectó en C. chalcites en la posición 4775 usando LoFreq y se confirmó usando la secuenciación de Sanger (Figura 1A complementaria), los tres restantes no fueron concluyentes o no fueron detectables mediante la secuenciación de Sanger. Cuatro (en 1916, 2426, 2535 y 4502) de los siete ribotipos encontrados en C. includens usando LoFreq fueron confirmados mediante secuenciación de Sanger (Figura complementaria 1B-E). El ensamblaje final del segmento de ADNr de C. eriosoma no reveló variaciones fijas. En la Fig. 1 se muestra una red TCS de diversidad ribotípica dentro y entre los tres individuos secuenciados. Estas variantes ribotípicas intragenómicas se evitaron durante el diseño de cebadores y sondas de PCR en tiempo real (Archivo complementario 1).

Red TCS de diversidad ribotípica detectable en ensamblajes finales de C. eriosoma, C. chalcites y C. includens 45S rDNA. Los puntos representan ribotipos dentro de los individuos: 1 ribotipo dentro de C. eriosoma, dos dentro de C. chalcites y 16 combinaciones posibles de cuatro loci ribotípicos en C. includens. Las marcas de sombreado entre nodos representan SNV que separan especies y ribotipos.

En el alineamiento de las secuencias de ADNr de C. chalcites y C. eriosoma, se encontraron 13 ubicaciones variables entre las dos, 11 de las cuales estaban dentro de las regiones ITS pero no estaban flanqueadas por secuencias adecuadas para el diseño de cebadores o sondas, y dos en 28S. (Archivo complementario 1). Debido a los debates pasados ​​sobre el estado de la especie de C. eriosoma y estos resultados de secuenciación, utilizamos datos de códigos de barras de CO1 disponibles en toda la población para cada especie y nuestro propio archivo de especímenes para examinar la relación. Utilizando datos de secuencia de CO1 de C. includens, C. chalcites y C. eriosoma, los árboles de unión de vecinos (NJ) e inferencia bayesiana (BI) resolvieron tres clados bien soportados correspondientes a cada una de las tres especies (Fig. 2A; Suplementario). Figura 2A). La red TCS producida a partir del mismo alineamiento muestra diversidad haplotípica dentro de cada especie (Fig. 2B). Como se muestra en el árbol bayesiano de CO1 (Fig. 2A complementaria) y la red TCS (Fig. 2B), los especímenes de C. eriosoma se clasificaron en dos haplogrupos, que corresponden aproximadamente a la ubicación de recolección con especímenes de todo el Medio Oriente, India. Pakistán y el sudeste asiático agrupados y especímenes de Australia, Nueva Zelanda y la Polinesia Francesa agrupados (Fig. 2A; Fig. complementaria 2A). Los especímenes hawaianos se resolvieron con los de la India y ambos haplogrupos fueron recolectados en Papua Nueva Guinea. Por el contrario, C. chalcites mostró una mayor ramificación intraclado y longitudes de rama más largas entre los grupos, todos con un alto soporte de rama (Fig. 2A) y un haplogrupo grande con un haplogrupo más pequeño y dos únicos en la red TCS (Fig. 2B). Por último, C. includens no mostró una estructura específica de ubicación ya que todos los especímenes se resuelven en un solo clado a pesar de las colecciones geográficamente dispersas (Fig. 2A) y un gran haplogrupo que abarca el rango geográfico (Fig. 2B). Un total de 28 variaciones de nucleótido único (SNV) separan a C. includens de C. chalcites y C. eriosoma, mientras que solo 4 SNV separan los haplotipos de C. chalcites y C. eriosoma más estrechamente relacionados.

El análisis de especies de Chrysodeixis basado en CO1 resuelve las relaciones evolutivas entre C. includens, C. chalcites y C. eriosoma. (A) Un árbol vecino muestra variación dentro y entre especies. Cada espécimen está etiquetado con un código de país de tres letras que indica su ubicación de recolección y un código de colores según el continente/región. Las etiquetas de las ramas representan el soporte tipo navaja. Helicoverpa armigera se estableció como un grupo externo. La barra de escala representa la distancia genética. (B) Una red TCS de las mismas secuencias muestra el número de SNV informativos de parsimonia que separan a cada grupo. Las marcas de sombreado entre nodos indican el número de SNV y los haplotipos están representados por círculos grandes.

Se llevó a cabo un análisis de delimitación de especies para probar la validez de C. chalcites/C. Las especies de eriosoma se dividen. Utilizando la delimitación de especies46, se probaron dos hipótesis en un árbol CO1 NJ: C. chalcites y C. eriosoma como especies separadas (Fig. 3A) o C. chalcites y C. eriosoma como una sola especie (Fig. 3B). En ambas pruebas, los linajes son recíprocamente monofiléticos según el PAB47 de Rosenberg, y bajo la hipótesis de una sola especie (Fig. 3B), el patrón de ramificación se considera aleatoriamente distinto según el P48 de Rodrigo. Sin embargo, bajo la hipótesis de las dos especies (Fig. 3A), cada linaje tiene una P de Rodrigo estadísticamente significativa, lo que indica que hay un impulso de selección en cada rama. Por el contrario, C. includens se distingue aleatoriamente por la P de Rodrigo pero es recíprocamente monofilética con C. acuta. Debido a que hay dos clados bien respaldados en la pequeña muestra de C. acuta incluida en este análisis, estas hipótesis también se probaron para C. acuta como comparador (Figura complementaria 3). De manera similar, la P de Rodrigo indica que la ramificación es aleatoria dentro del clado en su conjunto, es recíprocamente monofilética con C. includens según la P de Rosenberg, pero los clados se consideran distintos cuando se prueban por separado (Figura complementaria 3). La distancia intraclado para C. acuta es mayor que la distancia intraclado para C. chalcites y C. eriosoma cuando se consideran una sola especie (Fig. 3B, Fig. 3 complementaria).

El análisis de delimitación de especies se llevó a cabo utilizando datos de CO1 siguiendo dos hipótesis. (A) Se muestra un árbol de unión de vecinos comparando C. chalcites, C. eriosoma, C. includens y C. acuta como 4 especies individuales. Cada clado que representa una especie ha sido colapsado y codificado por colores. (B) Muestra el mismo árbol con C. chalcites y C. eriosoma tratados como una sola especie, colapsados ​​juntos en el ancestro común más reciente.

Usando ITS1, un árbol NJ (Fig. 4A) y un análisis bayesiano (Fig. 2B complementaria) mostraron una resolución más baja entre C. chalcites y C. eriosoma en comparación con el CO1 (Fig. 2A; Fig. 2B complementaria). Además, ITS1 de individuos de cada especie reveló menos diferenciación entre ellos que la que contienen los perfiles de ADNr (Archivo complementario 1), lo cual está respaldado por la red TCS, que muestra más diversidad dentro de la pequeña muestra de C. includens que la que separa a cualquiera de las especies más grandes. muestras de C. eriosoma y C. chalcites entre sí (Fig. 4B). Los pequeños tamaños de muestra y las ubicaciones limitadas de recolección de muestras para los datos de secuencia ITS1 generados para este estudio dificultan su aplicación como locus filogeográfico o de delimitación de especies, por lo que no se realizaron más análisis.

Análisis de especies de Chrysodeixis basado en la secuenciación de ITS1. (A) Un árbol de unión vecino muestra variación dentro y entre clados que contienen cada una de las especies analizadas: C. includens, C. chalcites y C. eriosoma. Las etiquetas de las ramas indican soporte tipo navaja. Helicoverpa zea se estableció como grupo externo. La barra de escala representa la distancia genética. (B) Una red TCS de las secuencias ITS1 muestra los SNV (marcas de sombreado) informativos de parsimonia que separan cada grupo.

Se llevó a cabo el desarrollo de un ensayo de PCR en tiempo real para ejecutarlo como un ensayo basado en sonda triplex con un conjunto de oligos para identificar C. includens (FAM en ITS2), un conjunto de oligos para identificar tanto C. chalcites como C. eriosoma (HEX en ITS1), y un oligo establecido para servir como control (Quasar 670 en 18S23). Todas las muestras de Chrysodeixis analizadas arrojaron resultados positivos para la sonda esperada y para la sonda de control 18S. No hubo reactividad cruzada entre las sondas FAM y HEX. La sonda FAM tenía un rango de Cq de 11,57 a 25,44 (media 15,77 ± DE 2,59) y la sonda HEX tenía un rango de Cq de 15,19 a 23,98 (media 18,77 ± 1,75 DE). La sonda de control 18S arrojó consistentemente un valor de Cq más alto que el de cualquiera de las sondas de diagnóstico para las tres especies y no varió significativamente en eficiencia entre especies. El ΔCq entre las sondas FAM y Quasar 670 osciló entre − 2,22 y 2,86 (media 2,08 ± DE 0,70) y el ΔCq entre las sondas HEX y Quasar 670 osciló entre 0,66 y 1,39 (media 1,04 ± DE 0,19), lo que indica que la sensibilidad para ambas sondas de diagnóstico es mayor que la de la sonda de control.

Se generaron curvas estándar para las sondas FAM (Fig. 5A) y HEX (Fig. 5B) junto con la sonda de control Quasar 670. Generalmente, la disminución de la concentración de ADN resultó en un aumento de Cq para todas las concentraciones analizadas para las tres especies. Todas las réplicas del ensayo de sensibilidad se realizaron con los tres conjuntos de oligo presentes, lo que indica que la multiplexación tuvo poco efecto sobre la sensibilidad del ensayo. Según la curva estándar, la sonda FAM puede detectar ADN de C. includens a ≥ 0,001 ng/μL (Fig. 5A), mientras que la sonda HEX puede detectar ADN de C. chalcites o C. eriosoma a ≥ 0,0001 ng/μL (Fig. 5B). ).

La curva estándar de valores de Cq para (A) C. incluye (ITS2) y (B) C. chalcites/C. Se muestran conjuntos de cebadores y sondas de eriosoma (ITS1) para diluciones en serie de ADN purificado de cada especie ejecutadas en el ensayo de PCR triple en tiempo real. En cada gráfico, los triángulos y la línea continua representan la sonda de diagnóstico y los cuadrados y la línea discontinua representan la sonda de control 18S.

Se llevaron a cabo pruebas de falsos positivos utilizando 17 especies (n = 67) de no objetivos que a menudo se recolectan en estudios de Chrysodeixis o se identifican erróneamente en interceptaciones en puertos de EE. UU. (Tabla complementaria 2). Estos datos se utilizaron para determinar empíricamente el umbral de RFU para cada sonda. De estos, se produjeron 3 falsos positivos para la sonda HEX y un falso positivo para la sonda FAM. Según las RFU finales de los no objetivos, el umbral de referencia para las tres sondas se estableció en 1000 RFU. Este umbral se utilizó para todos los datos reportados. Para los falsos positivos observados, el ΔCq fue > 8 ciclos, lo que los eliminó de su consideración como objetivos.

Con base en el ΔCq para las tres sondas, las pruebas de falsos positivos y las pruebas de sensibilidad, se desarrolló un conjunto de reglas para determinar la identidad de las muestras mediante el ensayo múltiple (Fig. 6). Para separar C. chalcites y C. eriosoma de estos resultados, se podría considerar el origen de la muestra junto con el código de barras de CO1.

Reglas para la interpretación de resultados de PCR en tiempo real de muestras sospechosas de C. includens, C. chalcites o C. eriosoma basadas en valores de Cq. 1Es probable que un resultado no concluyente se deba a una cantidad insuficiente de ADN o a una mala calidad del mismo. 2Es probable que un resultado no concluyente se deba a contaminación, artefactos o genotipo no muestreado. Se deben realizar códigos de barras 3CO1 para delimitar entre C. chalcites y C. eriosoma cuando sea necesario.

La delimitación de especies ha sido durante mucho tiempo una fuente de debate entre los biólogos (por ejemplo, 49). A pesar de la naturaleza ocasionalmente esotérica de estos debates, las diferencias funcionales a menudo se asocian con designaciones de especies, incluidos rasgos clave que pueden hacer que una especie sea más probable que sea invasora que los linajes hermanos (p. ej., 50, 51). Los métodos biológicos y morfológicos utilizados anteriormente son insuficientes para determinar el estado taxonómico de C. chalcites y C. eriosoma como especies distintas; sin embargo, parece haber diferencias consistentes en los marcadores genéticos. El uso de un concepto de especie genética requiere un debate sobre qué marcadores moleculares proporcionan la mejor señal para el reconocimiento de especies52,53. Entre los loci utilizados con mayor frecuencia para los metazoos se encuentran ITS1 e ITS2; Coleman22 sugiere que ITS2 siempre es exclusivo de las especies, aunque se sabe que varía dentro de las especies e incluso dentro de los individuos26,27. Entre C. chalcites y C. eriosoma hay cinco SNV y un indel en ITS1 y seis SNV en ITS2, ambos dentro de la variación ribotípica observada para una sola especie54. Cuando se secuenció ITS1 de más individuos, dos de los SNV demostraron ser loci variables con identidad compartida entre las dos especies. Murillo et al.36 sugirieron que la variación molecular entre los códigos de barras de CO1 de C. chalcites y C. eriosoma era de alrededor del 1%, lo que quizás indique sinonimia. Encontramos que la variación entre ambas especies fue de alrededor del 1% para los loci ITS1, ITS2 y CO1. Esto se compara con la variación entre cualquiera de estas especies y C. includens, que fue de alrededor del 2,6% para los mismos loci. A pesar del alto nivel de similitud entre C. chalcites y C. eriosoma en los análisis filogenéticos que realizamos, ambos son monofiléticos. Además, el soporte en forma de navaja que separa las dos especies es del 100% tanto para el CO1 como para los perfiles completos de rDNA 45S (Fig. 2A, Fig. 4 complementaria), mientras que la probabilidad posterior cae a 0,82 cuando solo se emplea ITS1 (Fig. 4A). Cuando se ejecuta un análisis de polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) en datos de CO1 de C. chalcites y C. eriosoma con una frecuencia de variante mínima de 0,25, hay 12 SNP en 6 loci que separan a los dos. Además, las pruebas de delimitación de especies respaldan la hipótesis de que C. chalcites y C. eriosoma son especies separadas, ya que ambas son recíprocamente monofiléticas y parecen tener un impulso evolutivo independiente dentro de cada grupo. Dados estos resultados, C. chalcites y C. eriosoma pueden considerarse especies separadas bajo varios conceptos diferentes49. La distancia relativamente pequeña que los separa puede indicar que C. chalcites y C. eriosoma divergieron recientemente, pero desde entonces han permanecido separados ya que no se encontró evidencia de introgresión o clasificación de linaje incompleta en los datos de ADNr o CO1. Sin embargo, el muestreo geográfico amplio sigue siendo un desafío para ambas especies, ya que hay pocos C. eriosoma disponibles en colecciones de museos o en interceptaciones y C. chalcites se toma principalmente de poblaciones invasoras. La evidencia concluyente de su estado filogenético requerirá un muestreo genético y geográfico más extenso.

La distribución de C. eriosoma se extiende desde Hawaii hasta la India a través del hemisferio oriental, mientras que la distribución de C. chalcites abarca toda África hasta la región mediterránea de Europa en el norte y hasta la India en el este34,44. Este patrón de distribución es similar al de otras plagas noctuidas (p. ej., Spodoptera). Chrysodeixis chalcites parece ser más invasiva que C. eriosoma, ya que ha establecido poblaciones fuera de su área de distribución natural en Europa y América del Norte, mientras que C. eriosoma no tiene poblaciones invasoras conocidas. Estas poblaciones de C. chalcites sobreviven en invernaderos durante todo el año y parecen relativamente aisladas ya que la distancia genética entre especies es mayor en comparación con C. includens y C. eriosoma (Fig. 3A). Debido a que la mayoría de los datos de códigos de barras disponibles para C. chalcites provienen de especímenes de poblaciones aisladas, se desconoce la variación molecular dentro del rango natural de C. chalcites, lo que afecta su utilidad para la delimitación de especies55. Esto contrasta con C. eriosoma, que se separa en dos haplogrupos geográficos y muestra una distancia genética intraespecie baja (Figs. 2, 3A), así como C. includens, que muestra la distancia genética intraespecie más baja de los tres. . Chrysodeixis includens es notablemente panmíctico porque sus poblaciones migran hacia el norte cada año28. En un estudio de los haplotipos de CO1 y CO2 en Brasil, Silva et al.56 reforzaron el hallazgo de baja variabilidad dentro de C. includens allí, encontrando un haplogrupo dominante en todo el país.

Los factores biológicos y ecológicos que podrían estar impulsando la divergencia entre C. chalcites y C. eriosoma no se han descrito adecuadamente. Sumándose a la dificultad para diferenciar C. eriosoma de C. chalcites, el trabajo de Kostrowicki40 que elevó a C. eriosoma de un sinónimo de C. chalcites lo hizo basándose en la coloración de las alas y la morfología genital, ninguna de las cuales es suficiente para diagnosticar de manera confiable estos linajes. Un trabajo más reciente sobre la taxonomía de C. eriosoma y C. chalcites realizado por Twinkle et al.42 hizo poco para cuestionar la relación entre ellos. Debido a que se apoya la hipótesis de una sola especie como recíprocamente monofilética pero divergente aleatoriamente, el clado podría considerarse una gran población de Fisher-Wright48. Si bien parece que las dos especies son distintas cuando se consideran por separado, lo mismo puede decirse de los distintos clados de C. acuta (Fig. 3; Fig. complementaria 3). Esto es digno de mención porque, al igual que C. chalcites, los lugares de recolección de C. acuta utilizados en este análisis no son representativos de su rango completo, un factor que se sabe que sesga los análisis de delimitación de especies55.

Para desarrollar un ensayo de diagnóstico para estas tres especies sin generar genomas completos para cada especie, optamos por secuenciar el ADNr 45S y utilizar los segmentos ITS1 e ITS2 para la identificación. Estas regiones con alto número de copias son particularmente adecuadas para el diagnóstico molecular porque las secuencias son abundantes incluso en muestras mal conservadas o ambientalmente degradadas25. Sin embargo, el uso de la amplificación por PCR para reducir la complejidad de la secuenciación y la naturaleza de la secuenciación, la llamada de bases y el mapeo de Nanopore complican la clasificación de la diversidad ribotípica completa de los individuos al enmascarar la variación de baja frecuencia presente en el ADN26,57. El algoritmo de minimapa utilizado para el ensamblaje permite la alineación de secuencias que varían hasta un 15%58, lo cual es importante para su uso con datos ONT ruidosos, pero el mapeo de lecturas a una secuencia de referencia excluye la variación de baja frecuencia del ensamblaje final. El ensamblaje de la secuencia se complicó aún más por la necesidad de una técnica de alineación progresiva para desarrollar los perfiles de ADNr 45S de C. includens y C. chalcites, así como el software de llamada de bases disponible en el momento en que se secuenciaron estos especímenes, los cuales conducen a errores en el resultado final. perfiles. Los datos de C. includens se denominaron base con un modelo de alta precisión (HAC), mientras que C. chalcites se denominaron base con el modelo rápido de menor calidad. La peor calidad del algoritmo rápido se hizo evidente cuando C. eriosoma se secuenció posteriormente utilizando una versión más nueva del algoritmo HAC y reveló los errores de secuenciación y de llamada de bases presentes a través de la comparación entre las dos secuencias que de otro modo serían muy similares. Además, la tecnología Nanopore tiene un problema conocido con la lectura y la llamada de bases G y especialmente al secuenciar una cadena (3 o más) de Gs59. Como era de esperar, los errores en las repeticiones G fueron el problema más frecuente en el perfil de ADNr de C. chalcites, pero estuvieron presentes en los perfiles de las tres especies. Afortunadamente, los datos de la ONT permiten volver a analizar los datos de secuencia para mejorar la precisión de las llamadas. A medida que mejora el posprocesamiento para ONT, es posible que sea posible una mejor caracterización de la diversidad ribotípica con modelos de llamadas base de súper precisión. En el futuro, la inclusión de más muestras en los esfuerzos de secuenciación debería permitir una mejor detección de la variación inter e intraespecífica del ADNr y ayudar a identificar y eliminar artefactos que puedan alterar la unión eficiente de los oligos diseñados para la detección de especies cuando se utiliza un método como la ddPCR. (ver 11). La ventaja de reducir la complejidad de la secuencia mediante PCR, ONT y las técnicas de ensamblaje y análisis descritas aquí es identificar los motivos más comunes para la identificación de especies. Este método permite la generación rápida de un perfil de ADNr en un entorno de mesa para especies poco estudiadas para mejorar el diagnóstico de especies. Además, pudimos identificar ribotipos usando LoFreq (Tabla complementaria 1), el más común de los cuales pudimos confirmar mediante secuenciación de Sanger (Figura 1 complementaria), que podría interferir con la unión eficiente del cebador o la sonda y evitarlos durante el desarrollo. el ensayo de PCR en tiempo real.

Debido a la amenaza que representan C. chalcites y C. eriosoma para la agricultura estadounidense, una sonda que identifique especímenes de ambos, como se desarrolló aquí, es apropiada para detectar sospechosos descubiertos en trampas o interceptados en los puertos de entrada. Una muestra identificada como C. chalcites o C. eriosoma mediante la prueba de PCR en tiempo real debe verificarse mediante códigos de barras de CO1 para fines de generación de informes. Por el contrario, C. includens es frecuentemente interceptada en los puertos de entrada a los EE. UU. Aunque está presente en todo el continente americano, las larvas son difíciles de separar de otras Plusiinae, por lo que se puede utilizar una sonda que detecte C. includens para proporcionar mejores identificaciones y reducir la confusión. con especies de plagas exóticas. Ambos ensayos de diagnóstico también diferenciarán las especies de Chrysodeixis de otras especies comúnmente interceptadas o atrapadas, ya que el ensayo múltiplex no muestra amplificación fuera del objetivo de especies no objetivo cuando se siguen las reglas de identificación.

El diagnóstico molecular desempeña un papel cada vez más importante en la identificación de especies y la seguridad fitosanitaria, incluso para especies para las que se dispone de pocos o ningún dato validado de secuencias de ADN de referencia. Este método de secuenciación de ADNr se puede adaptar fácilmente a otros linajes alterando los cebadores debido a la conservación de 18S y 28S entre parientes cercanos. En la mayoría de los casos, las regiones ITS son excelentes para ensayos de diagnóstico a nivel de especie y pueden utilizarse para muchos tipos de muestras y modalidades de PCR. Se requiere más trabajo, incluido el muestreo y la secuenciación ampliados, para aclarar la relación entre C. chalcites y C. eriosoma pero, tal como están actualmente, nuestro ensayo de PCR en tiempo real es suficiente para diagnosticar muestras con fines de cuarentena y será validado para uso en otras instalaciones de laboratorio y también adaptado para su uso en la selección masiva de muestras de encuestas.

Se interceptaron especímenes adultos y larvales de C. includens y C. chalcites en productos en los puertos de entrada y se identificaron mediante códigos de barras CO18 utilizando los cebadores LepF1 y LepR1 (60; Tabla 1), disección genital28, claves de identificación morfológica61 o una combinación de estos. métodos. En este estudio se utilizaron especímenes larvarios que comprenden 58 individuos de C. includens y 8 C. chalcites de varios lugares adquiridos a través de interceptaciones y encuestas. Se recolectaron especímenes adultos de C. eriosoma en Hawái mediante trampas de feromonas cebadas con señuelos de C. chalcites (APHIS TL 17-065a) y se conservaron en etanol para su transporte. Los adultos también se identificaron mediante códigos de barras de CO1 con los cebadores LepF1 y LepR1 (Tabla 1). Para este análisis se utilizaron cinco muestras de C. eriosoma. Se llevaron a cabo pruebas sin objetivos utilizando especies plusiinas comúnmente capturadas en los Estados Unidos, así como larvas plusiinas interceptadas de otras regiones que a menudo se confunden con especies de Chrysodeixis. Todas las muestras fueron identificadas mediante código de barras CO1, disección genital o ambas. La secuenciación de Sanger, incluido el código de barras de CO1, se llevó a cabo en el Centro Integral de Secuenciación de ADN del Centro Oncológico de la Universidad de Chicago utilizando un secuenciador de ADN Applied Biosystems 3730XL (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE. UU.). Todas las muestras objetivo y no objetivo utilizadas en este estudio se enumeran en la Tabla complementaria 2.

Para aplicaciones que no requerían alta calidad y concentración de ADN (p. ej., códigos de barras de ADN), se utilizó un kit Qiagen DNeasy Blood and Tissue (Qiagen, Hilden, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante. Para aplicaciones que requerían ADN de mayor calidad y concentración (p. ej., PCR de largo alcance), se utilizó el kit de purificación de ADN y ARN completo Lucigen MasterPure (LGC Ltd, Teddington, Reino Unido) siguiendo las instrucciones del fabricante con una incubación adicional de una hora a -20 °C antes de la precipitación para aumentar el rendimiento de ADN (ver 10). Todas las muestras se almacenaron en etanol antes de su uso. Para las muestras de larvas, se tomó una pequeña sección del extremo posterior de cada una y se molió en un tubo de 1,5 ml con un mortero y luego se incubó durante la noche en tampón de lisis y la porción restante de las técnicas de extracción se llevó a cabo al día siguiente. Para las muestras adultas, se quitaron las patas y se secaron el etanol residual, luego se molieron en un tubo de 1,5 ml usando perlas de sílice/zirconia de 1,4 mm en un Mini-Beadbeater (BioSpec Products, Bartelsville, OK, EE. UU.). El ADN extraído mediante ambos métodos se eluyó en tampón EB (Qiagen) para garantizar la compatibilidad con la PCR y la secuenciación. La concentración de ADN se cuantificó utilizando un espectrofotómetro NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) y un fluorómetro Qubit 4.0 (Invitrogen, Waltham, MA, EE. UU.) utilizando el kit de ensayo Qubit dsDNA HS (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Todo el ADN se almacenó a -20 °C hasta su uso.

Debido a la falta de datos de secuencia genómica disponibles para cualquier especie de Chrysodeixis, diseñamos un conjunto de cebadores generales para el ADNr de lepidópteros (Tabla 1) utilizando una alineación (Archivo complementario 2) de las secuencias enumeradas en la Tabla complementaria 3. Los cebadores amplifican casi el Región completa de ADNr desde el extremo 5 ′ de 18S hasta el extremo 3 ′ de 28S, una longitud típicamente entre 6500 y 7000 pb en especies de lepidópteros (consulte las accesiones de la Tabla complementaria 3). Los cebadores se diseñaron utilizando Primer 3 v0.4.062,63 con las siguientes configuraciones: cationes divalentes = 3,8 mM; cationes monovalentes = 50 mM; dNTPs = 0,8 mM con la fórmula SantaLucia64 para corrección de sal y parámetros termodinámicos. Los cebadores fueron fabricados por IDT (Integrated DNA Technologies Inc., Coralville, IA, EE. UU.). Se utilizó OligoCalc65 para calcular las temperaturas de fusión ajustadas a la sal. Se utilizaron muestras de larvas individuales, conservadas en etanol, de C. includens y C. chalcites que no se habían utilizado previamente para la extracción de ADN para obtener ADN para PCR de largo alcance utilizando el kit de purificación de ADN y ARN Lucigen MasterPure y se identificaron mediante códigos de barras de CO1. Se hizo lo mismo utilizando dos patas de un espécimen adulto de C. eriosoma. Se utilizó un total de 30 ng de ADN para la amplificación con el kit Takara LR Taq (TAKARA BIO INC., Kusatsu, Shiga, Japón) utilizando 600 nM de cada cebador (Tabla 1), 5,0 µL de tampón, 8,0 µL de mezcla de dNTP. y 0,5 µL de Taq. El programa de PCR utilizado fue el siguiente: 95 °C por 3 min seguido de 35 ciclos de 98 °C por 30 s, 51 °C por 30 s, 68 °C por 10 min; y paso de extensión final a 72 °C durante 10 min. Toda la PCR se llevó a cabo utilizando un termociclador Bio-Rad C1000 Touch (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, EE. UU.). Después del termociclado, los productos de PCR se procesaron en un gel de agarosa al 0,5% a 50 V durante 3 h y se tomaron imágenes en un transiluminador UVP GelSolo (Analytik Jena AG, Jena, Alemania). También se utilizó ADN de Helicoverpa armigera y H. zea como controles de PCR para garantizar que los cebadores funcionaran según lo previsto. La limpieza por PCR se realizó mediante purificación de perlas utilizando perlas paramagnéticas AMPure XP (Beckman Coulter Inc., Brea, CA, EE. UU.) siguiendo el flujo de trabajo del fabricante. Los fragmentos se cuantificaron en un fluorómetro Qubit 4.0 como se describe anteriormente y se almacenaron a -20 °C hasta su uso.

La secuenciación de los productos de PCR de largo alcance se llevó a cabo utilizando un MinION Mk1C con celdas de flujo MinION R9 (Oxford Nanopore Technologies; Oxford, Reino Unido). Se utilizó un kit de secuenciación de ligación (SQK-LSK110, Oxford Nanopore Technologies) para la preparación de la biblioteca siguiendo las instrucciones del fabricante. Las reacciones de secuenciación de nanoporos se ejecutaron durante 24 h y se llamaron en base viva mediante Mk1C o en base después de la ejecución en Guppy v. 6.1.2 (Oxford Nanopore Technology). Se llevaron a cabo preparaciones de bibliotecas y reacciones de secuenciación separadas para cada especie.

Después de la secuenciación, se utilizó Epi2Me v3.4.2 (Oxford Nanopore Technologies) para determinar la identidad de las secuencias de ADN en cada reacción. Luego, las secuencias de los archivos de pase generados durante las llamadas base se importaron a Geneious Prime 2021 o 2022 (https://www.geneious.com) como listas de secuencias que se dividieron en 136 grupos de 4000 secuencias cada uno para C. includens y 1825 grupos de 4000 secuencias cada una para C. chalcites y 1821 grupos de 3500 a 4000 secuencias cada una para C. eriosoma. A partir de estos, se seleccionaron fragmentos del tamaño previsto de ADNr de cada especie (basado en electroforesis en gel del producto de PCR), que normalmente representan alrededor del 10% de los datos de secuencia total para cada C. chalcites y C. eriosoma y alrededor del 25% de los datos de secuencia total para cada especie. 30% de los datos de secuencia totales para C. includens. Los datos de secuencia de lectura larga ordenados por tamaño para cada especie están disponibles en GenBank con el ID de BioProject PRJNA951779. Para C. chalcites y C. includens, las secuencias iniciales se obtuvieron alineando progresivamente las secuencias de mayor calidad de los primeros conjuntos de archivos de pase utilizando MUSCLE66. Las secuencias sin procesar restantes se asignaron a la secuencia de consenso derivada de MUSCLE usando el complemento Minimap258 para Geneious Prime usando el tipo de datos Pac-Bio/Oxford Nanopore y la configuración predeterminada. Para obtener un perfil de ADNr final para cada especie, las secuencias de consenso de cada archivo de pase se alinearon entre sí usando MUSCLE y MAFFT v 7.45067,68 utilizando la configuración predeterminada para comparación. Como C. eriosoma se secuenció en último lugar, los archivos de pase de esta secuenciación se asignaron a la secuencia de consenso final para C. chalcites utilizando Minimap2 con la configuración anterior. Los ensamblajes finales de la región de ADNr 45S generada para este estudio se pueden encontrar en GenBank con los números de acceso OQ829604-OQ829607. Se determinó que las ambigüedades restantes en la alineación final eran errores de secuenciación o ribotipos según la calidad y el tipo de cada ambigüedad (por ejemplo, los espacios o N se consideraron errores de secuenciación, llamadas ambiguas en las que las variaciones de secuencia en un solo punto se dividieron aproximadamente entre dos bases entre secuencias consenso se consideraron ribotipos). Las ambigüedades que representan los ribotipos se confirmaron utilizando LoFreq45 siguiendo aproximadamente el método de Sultanov y Hochwagen69. En resumen, un subconjunto de los datos de secuencia seleccionados del tamaño para cada especie se realineó con su respectivo perfil de ADNr final utilizando Minimap2 con el tipo de datos Oxford Nanopore y la configuración predeterminada. Las alineaciones se exportaron como archivos .bam y las variantes e indeles de cada una se llamaron con LoFreq. Los archivos resultantes output.vcf se importaron a Geneious y se asignaron a los perfiles de ADNr para cada especie.

A partir de los resultados de LoFreq, las variantes que estaban presentes en ≥ 50 % de las secuencias se verificaron mediante secuenciación de Sanger para buscar picos heterocigotos (Tabla complementaria 4). En total, se crearon cuatro conjuntos de cebadores para investigar cuatro posibles loci de ribotipo en C. chalcites y se diseñaron tres conjuntos de cebadores para investigar cuatro posibles loci de ribotipo en C. includens (Tabla complementaria 1). Para cada especie, se generó un consenso final que incluía todos los archivos de aprobación y las ambigüedades que representaban solo ribotipos inferidos biológicamente corregidos para reflejar los resultados de la secuenciación de Sanger cuando correspondiera (Archivo complementario 1). Los perfiles finales de ADNr para cada especie se alinearon entre sí para usarlos en el diseño de un ensayo de PCR en tiempo real para cada especie.

Para determinar las relaciones filogenéticas entre las tres especies de interés, se descargaron los datos de CO1 disponibles de la base de datos Barcode of Life (BOLD). Los números de acceso y las ubicaciones de recopilación de los datos de secuencia que se utilizaron se proporcionan en la Tabla complementaria 5. Los códigos de barras generados para este estudio están disponibles en GenBank con los números de acceso OQ732763-OQ732776. Después del control de calidad, las secuencias de CO1 se alinearon para las tres especies utilizando MAFFT v7.450 con la configuración predeterminada. Todas las secuencias se recortaron a la misma longitud (494 pb). También se incluyeron como taxones externos una secuencia de Helicoverpa zea o tres secuencias de H. armigera (Tabla complementaria 5). Se generó un árbol bayesiano utilizando el complemento MrBayes70,71 para Geneious Prime utilizando el modelo de sustitución GTR, una longitud de cadena MCMC de 1.100.000, una frecuencia de submuestreo de 200 y un árbol quemado de 100.000 con una longitud de rama sin restricciones antes. Además, se resolvió un árbol de Unión de Vecinos (NJ) utilizando el modelo de distancia Tamura-Nei72 sin grupo externo establecido y 1000 réplicas jackknife para evaluar el soporte de las ramas.

Además de CO1, diseñamos cebadores (usando los parámetros anteriores) para amplificar la región ITS1 de Chrysodeixis para muestrear la resolución de estos clados usando la secuencia objetivo para el ensayo de PCR en tiempo real para detectar C. chalcites. La ubicación del cebador directo está dentro de la porción 3' de 18S y la ubicación del cebador inverso está dentro de la porción 3' de 5.8S para permitir cierta universalidad de los cebadores para otros lepidópteros (Tabla 1). Luego se amplificó la región ITS1 a partir de un subconjunto de nuestro archivo de larvas y adultos de Chrysodeixis (3 especímenes de C. includens, 11 especímenes de C. chalcites y 5 especímenes de C. eriosoma), así como de H. zea para servir como un exogrupo. La PCR se llevó a cabo como se describió anteriormente para CO1 pero con 500 nM de los cebadores Chryso_ITS1_F y Chryso_ITS1_R (Tabla 1) y el siguiente programa de termociclado: 95 °C durante 3 min; 40 ciclos de 95 °C por 30 s, 58 °C por 30 s, 72 °C por 1 min; y 72°C por 5 min. Las secuencias de ITS1 generadas para este artículo están disponibles en GenBank con los números de acceso OQ780372-OQ780392. Se generó un árbol filogenético a partir de estos datos como se describe para CO1 con análisis bayesiano como se describe anteriormente.

Las relaciones dentro y entre las tres especies de Chrysodeixis se evaluaron utilizando datos de secuencia de CO1 e ITS1. El análisis de parsimonia estadística TCS se utilizó en PopART v1.7 (Análisis de población con árboles reticulados73) para visualizar las diferencias entre especies utilizando ambos conjuntos de datos, así como entre especies utilizando perfiles de ADNr, incluida la diversidad ribotípica. El análisis de delimitación de especies se llevó a cabo utilizando el complemento de delimitación de especies para Geneious Prime46 comparando agrupaciones de las tres especies junto con C. acuta estrechamente relacionada debido a su distribución geográfica igualmente amplia y a los abundantes datos de secuencia de CO1 disponibles. Para este análisis, se utilizó un subconjunto de las secuencias de CO1 utilizadas anteriormente para cada especie de BOLD y GenBank (Tabla complementaria 5) para resolver un árbol NJ como se describe anteriormente. El tamaño de cada clado se redujo para evitar un artefacto de cálculo que existe en el programa de Delimitación de especies (ver 46,48 para más detalles). Cada uno de los clados internos resultantes fue seleccionado para evaluar los límites de las especies actuales de Chrysodeixis.

Se diseñó un conjunto de cebadores y una sonda para cada clado de interés, C. includens y C. chalcites/C. eriosoma, según los datos de la secuencia de ADNr generados anteriormente (Tabla 1; Figura complementaria 5). Las regiones de ITS se eligieron en función de la diferencia de secuencia entre los dos clados y otros lepidópteros, así como para evitar áreas de variación de secuencia intragenómica dentro de los individuos secuenciados. Las regiones elegidas para la identificación estaban dentro de ITS2 para C. includens (Figura complementaria 5A) y dentro de ITS1 para C. chalcites/C. eriosoma (Figura complementaria 5B).

Toda la PCR en tiempo real se realizó en un sistema de PCR en tiempo real Bio-Rad CFX96 Touch (Bio-Rad Laboratories Inc.). Los ensayos se diseñaron para ejecutarse en triplex con ambas sondas de diagnóstico y una sonda de control (Tabla 1) para usarse simultáneamente. El ensayo de control se implementó como se describe en Barr et al.23. Después de la optimización, la mezcla final de PCR en tiempo real incluyó 10 µL de iTaq Universal Probes Master Mix (Bio-Rad Laboratories Inc.), 350 nM de cebadores de C. includens (includens_F e includens_R), 175 nM de sonda de C. includens (includens_P) , 300 nM de cebadores de C. chalcites (chalcites_F y chalcites_R), sonda de C. chalcites 200 nM (chalcites_P), cebadores de control 18S 500 nM (RT_18S_F2 y RT_18S_R2) y sonda de control 18S 400 nM (RT_18S_P2) con agua para completar la dilución de la mezcla maestra y 1 l de ADN de concentración variable o agua adicional para controles sin tejido (NTC). El programa de termociclado utilizado es el siguiente: 3 min a 95 °C desnaturalización inicial seguido de 40 ciclos de 95 °C durante 20 s y 59 °C durante 30 s con captura de datos al final de cada ciclo. Para todas las reacciones, se utilizaron placas de PCR rígidas, de paredes delgadas, de 96 pocillos (Bio-Rad Laboratories Inc.) con sellos Microseal 'B' ópticamente transparentes (Bio-Rad Laboratories Inc.). La especificidad del ensayo se probó utilizando otras 17 especies de Plusiine comúnmente atrapadas o interceptadas (larvas y adultos) que pueden confundirse visualmente con C. includens, C. chalcites o C. eriosoma (n = 67, Tabla complementaria 2). Los valores umbral para cada conjunto de cebador/sonda se determinaron ejecutando el ensayo en 54 muestras de C. includens, 35 muestras de C. chalcites y 5 muestras de C. eriosoma. El umbral inicial se configuró manualmente en 1000 RFU para cada sonda.

La sensibilidad del ensayo se determinó ejecutando 3 réplicas técnicas de diluciones en serie de ADN de C. includens, C. chalcites y C. eriosoma con concentraciones que oscilaban entre 10 ng/μl y 1 × 10-6 ng/μl. El ensayo se realizó con la mezcla múltiple de los conjuntos de cebador/sonda de control C. includens, C. chalcites y 18S. Los resultados se ajustaron para reflejar el umbral de RFU determinado empíricamente y los valores de Cq se promediaron y compararon con la concentración de ADN en una escala logarítmica para determinar los efectos de la pendiente, la intercepción y y la correlación de la concentración de ADN en la sensibilidad del ensayo siguiendo a Barr et al.23 .

Los archivos de pase clasificados por tamaño, llamados por base y de secuenciación ONT se pueden encontrar bajo el número de BioProject PRJNA951779 para cada especie en https://dataview.ncbi.nlm.nih.gov/object/PRJNA951779?reviewer=vrpekj27ut9qv2i5qhe3f6b855. Los resultados de Sanger para CO1 e ITS1 se pueden encontrar en GenBank en las entradas OQ732763-OQ732776 y OQ780372-OQ780392 respectivamente y con la Información complementaria. Los electroferogramas para las comprobaciones del ribotipo de Sanger están disponibles como figura complementaria 1. Todos los demás conjuntos de datos generados durante el estudio actual están disponibles a través de solicitud razonable del autor correspondiente.

Ricciardi, A. ¿Son las invasiones biológicas modernas una forma de cambio global sin precedentes? Conservar. Biol. 21, 329–336 (2007).

Artículo PubMed Google Scholar

Pyšek, P. et al. La advertencia de los científicos sobre las especies exóticas invasoras. Biol. Rev. Camb. Filos. Soc. 95, 1511-1534 (2020).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Pimentel, D., Lach, L., Zuniga, R. & Morrison, D. Costos ambientales y económicos de especies no autóctonas en los Estados Unidos. Biociencia 50, 53–65 (2000).

Artículo de Google Scholar

McLaughlin, GM & Dearden, PK Insectos invasores: métodos de manejo explorados. J. Ciencia de insectos. 19, 1–9 (2019).

Artículo de Google Scholar

Gilligan, TM y cols. Identificación de larvas de Heliothine (Lepidoptera: Noctuidae) interceptadas en los puertos de entrada de EE. UU. desde el nuevo mundo. J. Economía. Entomol. 112, 603–615 (2019).

Artículo PubMed Google Scholar

Kelly, CL, Schwarzkopf, L., Gordon, IJ y Hirsch, B. El crecimiento de la población se retrasa en las especies introducidas. Ecológico. Evolución. 11, 4577–4587 (2021).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Madden, MJL y cols. Uso de códigos de barras de ADN para mejorar la identificación de plagas invasoras en los puertos de entrada de EE. UU. PLoS One 14, e0222291 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gilligan, TM y cols. Un ensayo de PCR multiplex en tiempo real para diagnosticar y separar Helicoverpa armigera y H. zea (Lepidoptera: Noctuidae) en el Nuevo Mundo. PLoS One 10, e0142912 (2015).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Tembrock, LR, Farris, RE, Ledezma, L., Barr, NB y Gilligan, TM Un ensayo de PCR en tiempo real para la separación de Autographa gamma (Noctuidae: Plusiinae) de especies morfológicamente similares en América del Norte. J. Economía. Entomol. 110, 2609–2617 (2017).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Zink, FA, Tembrock, LR, Timm, AE y Gilligan, TM Un ensayo de PCR en tiempo real para la identificación rápida de Tuta absoluta (Lepidoptera: Gelechiidae). J. Economía. Entomol. 113, 1479-1485 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Oliveira, TMR et al. La optimización del ensayo puede igualar la sensibilidad de la PCR en tiempo real con la ddPCR para la detección de Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae) en muestras a granel. Insectos 12, 885 (2021).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Zink, FA, Tembrock, LR, Timm, AE y Gilligan, TM Un ensayo de ddPCR dúplex para detectar simultáneamente Ips sexdentatus e Ips typographus (Coleoptera: Curculionidae) en muestras de trampas a granel. Poder. J. Para. Res. 49, 903–914 (2019).

Artículo CAS Google Scholar

Mavridis, K. y col. Diagnóstico molecular de próxima generación (TaqMan qPCR y ddPCR) para monitorear la resistencia a insecticidas en Bemisia tabaci. Manejo de plagas. Ciencia. 78, 4994–5001 (2022).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Roques, A. et al. Plantar árboles europeos centinela en el este de Asia como un método novedoso para identificar posibles plagas de insectos invasores. Más uno 10, e0120864 (2015).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Ratnasingham, S. & Hebert, PD BOLD: El sistema de datos del código de barras de la vida (http://www.barcodinglife.org). Mol. Ecológico. Notas 7, 355–364 (2007).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sayers, EW y cols. Actualización de GenBank 2023. Ácidos nucleicos res. 51, D141-D144 (2023).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Hebert, PDN, Ratnasingham, S. y deWaard, JR Código de barras de la vida animal: divergencias de la subunidad 1 del citocromo c oxidasa entre especies estrechamente relacionadas. Proc. R. Soc. Londres. B (Suplementario) 270, S96–S99. https://doi.org/10.1098/rsbl.2003.0025 (2003).

Artículo CAS Google Scholar

Brownlee, GG & Sanger, F. Secuencias de nucleótidos del ARN ribosómico de bajo peso molecular de Escherichia coli. J. Mol. Biol. 23, 337–353 (1967).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Hillis, DM y Dixon, MT ADN ribosómico: evolución molecular e inferencia filogenética. Q. Rev. Biol. 66, 411–453 (1991).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Lane, DJ y cols. Determinación rápida de secuencias de ARN ribosómico 16S para análisis filogenéticos. Proc. Nacional. Acad. Ciencia. Estados Unidos 82, 6955–6959 (1985).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jüttner, M. & Ferreira-Cerca, S. Mirando a través de la lente de la historia evolutiva de la biogénesis de los ribosomas: posibles implicaciones para la filogenia de las arqueas y la eucariogénesis. Mol. Biol. Evolución. 39, msac054 (2022).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Coleman, AW Homologías paneucariotas ITS2 reveladas por la estructura secundaria del ARN. Ácidos nucleicos res. 35, 3322–3329 (2007).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Barr, NB, Ledezma, LA, Farris, RE, Epstein, ME y Gilligan, TM Un ensayo de reacción en cadena de la polimerasa multiplex en tiempo real para diagnosticar Epiphyas postvittana (Lepidoptera: Tortricidae). J. Economía. Entomol. 104, 1706-1719 (2011).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Zink, FA y cols. Un ensayo de PCR digital en gotas (ddPCR) para detectar Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae) en muestras de trampas a granel. Más uno 12, e0178704 (2017).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Butterwort, V. et al. Un método de extracción de ADN para insectos de trampas adhesivas: dirigido a una plaga de baja abundancia, Phthorimaea absoluta (Lepidoptera: Gelechiidae), en comunidades de especies mixtas. J. Economía. Entomol. 115, 844–851 (2022).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Teruel, M. et al. Evolución molecular dispar de dos tipos de ADN repetitivos en el genoma del saltamontes Eyprepocnemis plorans. Herencia (Edinb) 112, 531–542 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Ganley, AR y Kobayashi, T. Evolución concertada altamente eficiente en las repeticiones del ADN ribosómico: variación total de las repeticiones del ADNr revelada por datos de secuencia de escopeta de todo el genoma. Genoma Res. 17, 184-191 (2007).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lafontaine, JD & Poole, RW Las polillas de América del norte de México, incluida Groenlandia Fascículo 251 Noctuoidea: Noctuidae (Parte): Plusiinae (The Wedge Entomological Research Foundation, París, 1991).

Google Académico

Specht, A., de Paula-Moraes, SV & Sosa-Gómez, DR Plantas hospederas de Chrysodeixis includens (Walker) (Lepidoptera, Noctuidae, Plusiinae). Rev. P. Sujetadores. Entomol. Rev. 59, 343–345 (2015).

Artículo de Google Scholar

Moonga, MN y Davis, JA Historia de vida parcial de Chrysodeixis includens (Lepidoptera: Noctuidae) en huéspedes de verano. J. Economía. Entomol. 109, 1713-1719 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

de Sousa, PV et al. Estrategias de control de orugas de Chrysodeixis includens y Spodoptera eridania (Lepidoptera: Noctuidae) y selección de cultivares resistentes en soja. Agosto. J. Ciencia de cultivos. 13, 367–381 (2019).

Artículo de Google Scholar

McQuate, GT & Sylva, CD Captura del looper verde adulto, Chrysodeixis eriosoma (Lepidoptera: Noctuidae), en campos de camote en Hawaii. Proc. Entomol de Hawái. Soc. 50, 43–53 (2018).

Google Académico

Roberts, LIN Biología de Chrysodeixis eriosoma (Lepidoptera: Noctuidae) en Nueva Zelanda. Nuevo entusiasmo. Entomol. 7, 52–58 (1979).

Artículo de Google Scholar

Sullivan, M. & Molet, T. Hoja de datos de plagas CPHST para Chrysodeixis chalcites (USDA-APHIS-CPHST, 2007). Rev enero de 2014. http://download.ceris.purdue.edu/file/3027

CABI. Calcitas de crisodeixis. En Compendio de especies invasoras (CAB International, 2022). http://www.cabi.org/isc

Murillo, H., Hunt, DWA y VanLaerhoven, SL Primeros registros de chalcitas Chrysodeixis (Lepidoptera: Noctuidae: Plusiinae) para el centro-este de Canadá. Poder. Entomol. 145, 338–342 (2013).

Artículo de Google Scholar

Passoa, S. & Gilligan, TM Alerta de plagas: Chrysodeixis chalcites (Esper) (Lepidoptera: Noctuidae) Golden Twin Spot (USDA-APHIS-PPQ, 1995). http://download.ceris.purdue.edu/file/96

Actualización de la NAPPO sobre Chrysodeixis sp. (calcitas o eriosoma) erradicación en Columbia Británica, Canadá. Informe oficial de plagas del 8 de mayo de 2007. https://www.pestalerts.org/official-pest-report/update-chrysodeixis-sp-chalcites-or-eriosoma-eradication-british-columbia (2007).

Cueros, J. Chrysodeixis chalcites (Esper): polilla dorada de doble mancha. https://blogs.cdfa.ca.gov/Section3162/?p=2381 (2016).

Kostrowicki, AS Estudios sobre las especies paleárticas de la subfamilia Plusiinae (Lepidoptera: Phalaenidae). Acta Zool. Cracoviensia 6, 367–472 (1961).

Google Académico

Holloway, JD, Bradley, JD y Carter, DJ Guías CIE sobre insectos de importancia para el hombre. I. Lepidoptera (CAB Internacional, 1987).

Google Académico

Twinkle, T., Shashank, PR & Chattopadhyay, PC Códigos de barras de ADN y descripción taxonómica de algunas especies seleccionadas de la subfamilia Plusiinae (Lepidoptera: Noctuidae) de la India. Zootaxa 4845, 451–486 (2020).

Artículo de Google Scholar

Sarwar, ZM y cols. Taxonomía y distribución de Plusiinae (Lepidoptera: Noctuidae) de importancia agrícola del sur de Punjab, Pakistán. Arabia J. Biol. Ciencia. 28, 5720–5727 (2021).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Lafontaine, JD & Schmidt, BC Adiciones y correcciones a la lista de verificación de Noctuoidea (Insecta, Lepidoptera) de América del Norte al norte de México. Zookeys 264, 227–236 (2013).

Artículo de Google Scholar

Wilm, A. y col. LoFreq: un llamador de variantes ultrasensible y consciente de la calidad de la secuencia para descubrir la heterogeneidad de la población celular a partir de conjuntos de datos de secuenciación de alto rendimiento. Ácidos nucleicos res. 40, 11189–11201 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Masters, BC, Fan, V. & Ross, HA Delimitación de especies: un complemento generoso para la exploración de los límites de las especies. Mol. Ecológico. Recurso. 11, 154-157 (2011).

Artículo PubMed Google Scholar

Rosenberg, NA Pruebas estadísticas de distinción taxonómica a partir de observaciones de monofilia. Evolución 61, 317–323 (2007).

Artículo PubMed Google Scholar

Rodrigo, A. et al. Los peligros de la abundancia: ¿Qué vamos a hacer con todos estos genes? Filos. Trans. R. Soc. Londres. B Biol. Ciencia. 363, 3893–3902 (2008).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

De Queiroz, K. Conceptos de especie y delimitación de especies. Sistema. Biol. 56, 879–886 (2007).

Artículo PubMed Google Scholar

Colautti, R. et al. Cuantificar la invasividad de las especies. NeoBiota 21, 7-27 (2014).

Artículo de Google Scholar

Huang, C. y col. Predecir la invasividad de los insectos con datos de secuenciación del genoma completo. Plaza Res (2020).

Fontaneto, D., Flot, J.-F. & Tang, CQ Directrices para la taxonomía del ADN, con especial atención a la meiofauna. Mar. Biodivers. 45, 433–451 (2015).

Artículo de Google Scholar

Dellicour, S. & Flot, JF La guía del autoestopista para la delimitación de especies de un solo locus. Mol. Ecológico. Recurso. 18, 1234-1246 (2018).

Artículo PubMed Google Scholar

Kumar, V. y col. La alta variación intragenómica inesperada en dos de las tres principales especies de trips plagas no afecta la utilidad del espaciador transcrito interno ribosómico 2 (ITS2) para la identificación de trips. En t. J. Mol. Ciencia. 18, 2100 (2017).

Artículo MathSciNet PubMed PubMed Central Google Scholar

Meyer, CP y Paulay, G. Códigos de barras de ADN: tasas de error basadas en un muestreo completo. PLoS Biol. 3, e422 (2005).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Silva, CS y cols. Expansión poblacional y adaptación genómica a ambientes agrícolas del looper de la soja. Incluye crisodeixis. Aplicación Evol 13, 2071–2085 (2020).

Artículo PubMed Google Scholar

Chen, W. y col. Un ensamblaje del genoma a nivel de cromosomas de alta calidad de un herbívoro generalista, Trichoplusia ni. Mol. Ecológico. Recurso. 19, 485–496 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Li, H. Minimap2: Alineación por pares para secuencias de nucleótidos. Bioinformática 34, 3094–3100 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Delahaye, C. y Nicolas, J. Secuenciación de ADN con nanoporos: problemas y sesgos. PLoS One 16, e0257521 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hebert, PD, Penton, EH, Burns, JM, Janzen, DH y Hallwachs, W. Diez especies en una: los códigos de barras de ADN revelan especies crípticas en la mariposa patrón neotropical Astraptes fulgerator. Proc Natl Acad Sci USA 101, 14812–14817 (2004).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Eichlin, TD & Cunningham, HB Caracteres para la identificación de algunas orugas plusiinas comunes del sureste de Estados Unidos. Ana. Entomol. Soc. Soy. 62(3), 507–510 (1969).

Artículo de Google Scholar

Koressaar, T. & Remm, M. Mejoras y modificaciones del programa de diseño de cebadores Primer3. Bioinformática 23, 1289-1291 (2007).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Untergasser, A. y col. Primer3: nuevas capacidades e interfaces. Ácidos nucleicos res. 40, e115 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

SantaLucia, J. Jr. Una visión unificada de la termodinámica del vecino más cercano del ADN de polímeros, mancuernas y oligonucleótidos. Proc. Nacional. Acad. Ciencia. Estados Unidos 95, 1460-1465 (1998).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kibbe, WA OligoCalc: una calculadora de propiedades de oligonucleótidos en línea. Ácidos nucleicos res. 35, W43-W46 (2007).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Edgar, RC MUSCLE: Alineación de secuencias múltiples con alta precisión y alto rendimiento. Ácidos nucleicos res. 32, 1792-1797 (2004).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Katoh, K., Misawa, K., Kuma, K. y Miyata, T. MAFFT: un método novedoso para el alineamiento rápido de múltiples secuencias basado en la transformada rápida de Fourier. Ácidos nucleicos res. 30, 3059–3066 (2002).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Katoh, K. & Standley, DM Software de alineación de secuencias múltiples MAFFT versión 7: mejoras en el rendimiento y la usabilidad. Mol. Biol. Evolución. 30, 772–780 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sultonov, D. & Hochwagen, A. La fuerza variable de la selección contribuye a la diversidad intragenómica de los genes de ARNr. Nat. Comunitario. 13, 7245 (2022).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Huelsenbeck, JP & Ronquist, F. MRBAYES: Inferencia bayesiana de árboles filogenéticos. Bioinformática 17, 754–755 (2001).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Ronquist, F. & Huelsenbeck, JP MrBayes 3: Inferencia filogenética bayesiana bajo modelos mixtos. Bioinformática 19, 1572-1574 (2003).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Tamura, K. & Nei, M. Estimación del número de sustituciones de nucleótidos en la región de control del ADN mitocondrial en humanos y chimpancés. Mol. Biol. Evolución. 10, 512–526 (1993).

CAS PubMed Google Académico

Clement, M., Posada, D. & Crandall, KA TCS: Un programa informático para estimar genealogías genéticas. Mol. Ecológico. 9, 1657-1659 (2000).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Descargar referencias

Agradecemos a Charlotte Aldebron, Silvana Paula-Mores y Julieta Brambila por sus esfuerzos para obtener muestras objetivo y no objetivo para este estudio. También agradecemos a Maiki Vlahinos por el acceso al equipo informático necesario. Este estudio fue posible, en parte, gracias a un Acuerdo de Cooperación del Servicio de Inspección de Sanidad Animal y Vegetal del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (Acuerdos de Cooperación AP21PPQS&T00C047 y AP20PPQS&T00C012); es posible que no exprese necesariamente las opiniones del APHIS. Todd M. Gilligan tomó imágenes de C. chalcites y C. includens y la imagen de C. eriosoma está disponible a través de Creative Commons. También agradecemos a los tres revisores anónimos por brindar comentarios que aumentaron enormemente la calidad de este manuscrito.

Departamento de Biología Agrícola, Universidad Estatal de Colorado, Fort Collins, CO, EE. UU.

Frida A. Zink, Luke R. Tembrock y Alicia E. Timm

Laboratorio de tecnología de identificación de plagas, USDA-APHIS-PPQ-Ciencia y tecnología, Fort Collins, CO, EE. UU.

Todd Gilligan

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

FAZ concibió y diseñó el estudio, realizó el trabajo de laboratorio y el análisis de datos, y redactó el borrador del manuscrito; LRT concibió el estudio, supervisó los análisis filogenéticos y filogeográficos y proporcionó los primeros comentarios preliminares; AET contribuyó con muestras, identificó especímenes y proporcionó extractos de ADN para códigos de barras y secuenciación de ITS1; TMG supervisó el proyecto y brindó consulta morfológica; Todos los autores leyeron y contribuyeron a la versión final del manuscrito.

Correspondencia a Luke R. Tembrock.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado a los autores originales y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Zink, FA, Tembrock, LR, Timm, AE y col. Secuenciación ultraprofunda del ADNr 45S para discernir la diversidad intragenómica en tres especies de Chrysodeixis para la identificación molecular. Informe científico 13, 13017 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39673-7

Descargar cita

Recibido: 24 de marzo de 2023

Aceptado: 28 de julio de 2023

Publicado: 10 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39673-7

Cualquier persona con la que comparta el siguiente enlace podrá leer este contenido:

Lo sentimos, actualmente no hay un enlace para compartir disponible para este artículo.

Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenidos Springer Nature SharedIt

Al enviar un comentario, acepta cumplir con nuestros Términos y pautas de la comunidad. Si encuentra algo abusivo o que no cumple con nuestros términos o pautas, márquelo como inapropiado.